CN104846093A - 基于转录组序列开发的榨菜est-ssr标记引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组，属于生物技术领域。该引物组是基于转录组序列开发得到的，在转录组测序的基础上，对大量序列信息进行批量处理，从而进行SSR序列的查找和SSR标记的引物设计，克服了榨菜目前SSR标记数量稀少及开发效率低等障碍。利用榨菜及芸薹属不同种的材料验证了SSR引物的有效性及通用性，为榨菜SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择、遗传连锁图谱构建、遗传多样性评价等奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术开发及应用领域，具体涉及榨菜EST(expressedsequence tags,ESTs)微卫星标记引物组(EST‐SSR)。
背景技术
榨菜(Brassica juncea(L.)Czern.et Coss.var.tumida Tsen et Lee)分类学上称为茎瘤芥，二年生草本植物，是经我国长期栽培驯化产生的一个芥菜变种。长期以来，众多研究者对榨菜种质资源的收集、分类、鉴定做了大量的工作，为榨菜育种研究提供大量优异材料，选育出了许多符合生产需求的榨菜品种。但是目前对于榨菜研究中能够应用的分子标记技术十分有限，分子标记作为遗传连锁图谱、基因定位的基础，已经成为作物遗传、分子标记辅助育种研究和应用的重要部分，因此，榨菜分子标记的缺乏限制了其优质种质资源快速、有效的选育及生产应用。
简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和转录组SSR(EST‐SSR)，与gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST‐SSR标记更经济，效率更高。EST‐SSR标记来源于DNA的转录区域，相比于gSSR标记，EST-SSR种间通用性更高，即基于一种材料开发的EST-SSR引物，往往在一个属内甚至属间均能适用。更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等中都有极高的应用价值。
近年来随着第二代测序技术的成熟，使得通过转录组数据获得EST-SSR成为可能。但目前还未有相关利用榨菜转录组序列开发EST-SSR标记引物的报道。因此，利用第二代高通量测序技术获得榨菜转录组序列信息，批量开发EST-SSR引物，将会对其重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。
发明内容
本发明的目的是针对榨菜目前尚无SSR标记引物和反应体系的不足，提供基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组，所述引物组包括1号引物～14号引物，所述1号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；所述2号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQID NO.4所示；所述3号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示；所述4号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；所述5号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示；所述6号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.12所示；所述7号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示；所述8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.16所示；所述9号引物的正向引物的序列如SEQID NO.17所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示；所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示；所述11号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.21所示，反向引物的序列如SEQID NO.22所示；所述12号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.23所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.24所示；所述13号引物的正向引物的序列如SEQ IDNO.25所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.26所示；所述14号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.27所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.28所示。
进一步地，所述引物组通过以下步骤得到：
(1)获取榨菜转录组EST序列；
(2)采用SSRLocator软件对步骤(1)获得的EST序列进行SSR位点的筛选；
(3)榨菜EST-SSR引物的设计：依据上述步骤(2)筛选的EST-SSR位点，采用SSRLocator软件进行SSR引物设计出榨菜EST-SSR标记引物，得到引物组。
进一步地，所述步骤(1)具体为：
(1.1)采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后，转移到‐70℃冰箱内保存。
(1.2)使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA；提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700bp片段，将回收得到的片段进行PCR扩增，建立测序文库，用IlluminaHiSeqTM2000对测序文库进行测序；根据测序结果，从中选取已知方向的EST序列。
进一步地，所述步骤(2)具体为：先对上述步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选；筛选标准包括：单核苷酸的重复次数大于或等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于5次，四核苷酸重复次数和五核苷酸重复次数均大于或等于4次，六核苷酸重复次数～十核苷酸重复次数均大于或等于3次。同时也筛选中间被少数碱基(间隔小于或等于5bp)打断的不完全重复的SSR位点。
进一步地，所述步骤(3)中引物设计参数包括：引物长度为17-24bp；GC含量为30％-70％；退火温度为50-70℃；预期产物长度为100-280bp。
进一步地，所述引物长度最佳为20bp，GC含量最佳为50％；退火温度最佳为55℃，预期产物长度最佳为200bp。
本发明的优点是：本发明提供的基于转录组序列高效地完成对榨菜SSR标记引物开发的技术，与现有技术相比，获得的转录组序列，极大地增加了引物开发所用的原始数据；本发明利用生物信息学技术进行榨菜SSR标记引物的开发，批量处理数据，提高了开发效率，克服了榨菜SSR引物十分稀少的问题，拓宽了榨菜分子标记辅助育种的思路和领域；使用芸薹属不同作物对设计的引物进行PCR鉴定，结果真实可靠。实现了分子标记在芥菜育种中的初步应用，为构建高密度芥菜遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。
附图说明
图1为随机20对SSR引物在榨菜中的PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图2为3号引物在榨菜及近缘种中的PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1泳道:白菜为模板的PCR产物；2泳道:黑芥为模板的PCR产物；3泳道:甘蓝为模板的PCR产物；4泳道:榨菜为模板的PCR产物；5泳道:甘蓝型油菜为模板的PCR产物；6泳道:埃塞俄比亚芥为模板的PCR产物；7泳道:拟南芥为模板的PCR产物；
图3为10号引物在榨菜及近缘种中的PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳图；1泳道:白菜为模板的PCR产物；2泳道:黑芥为模板的PCR产物；3泳道:甘蓝为模板的PCR产物；4泳道:榨菜为模板的PCR产物；5泳道:甘蓝型油菜为模板的PCR产物；6泳道:埃塞俄比亚芥为模板的PCR产物；7泳道:拟南芥为模板的PCR产物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：本实施例制备榨菜EST-SSR标记引物组，包括以下步骤：
(1)榨菜转录组EST数据的获得:
(1.1)采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后，转移到‐70℃冰箱内保存。
(1.2)使用Trizol试剂提取榨菜的总RNA；提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700bp片段，将回收得到的片段进行PCR扩增，建立测序文库，用IlluminaHiSeqTM2000对测序文库进行测序；根据测序结果，从中选取已知方向的EST序列，共56,822条EST序列。
(2)采用SSRLocator软件对步骤(1)获得的EST序列进行SSR位点的检测:
先对上述步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选；筛选标准包括：单核苷酸的重复次数大于或等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于5次，四核苷酸重复次数和五核苷酸重复次数均大于或等于4次，六核苷酸重复次数～十核苷酸重复次数均大于或等于3次。同时也筛选中间被少数碱基(间隔小于或等于5bp)打断的不完全重复的SSR位点，检索得到8,777个EST-SSR位点。
(3)榨菜EST-SSR引物的设计：
依据上述步骤(2)得到的EST-SSR位点，采用SSRLocator软件进行SSR引物设计。引物设计主要参数：引物长度控制在17-24bp，最佳长度为20bp；GC含量控制在30％-70％，最佳为50％；退火温度控制在50-70℃，最佳为55℃；预期产物长度控制在100-280bp，最佳为200bp，共设计获得6,127对引物。
下面检测上述实施例得到的EST-SSR引物的有效性及通用性。
利用CTAB方法提取榨菜的基因组DNA。用基因组DNA对上述实施例制备的引物进行PCR扩增，以检测引物设计的可靠性及可用性。
PCR反应采用20μL反应体系，包括浓度为100ng/μL的基因组DNA模板1.0μL，浓度为10μM的正向引物1.0μL、浓度为10μM的反向引物1.0μL，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.5μL，浓度为2.5mM的dNTP 2μL，ddH2O 12.3μL。扩增反应程序为：94℃预变性3min，进入35个循环，每个循环为94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环后再72℃延伸7min，最后4℃保存。
向PCR产物中加入2μL的loading buffer，以20bp的DNA ladder为DNA分子量标准，采用质量体积比为0.12g/ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶在240V稳压下电泳1.5h，电泳缓冲液为1×TBE。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶拍照。有条带的数据为“1”，没有条带的为“0”，使用榨菜DNA扩增出数据“1”的引物即为有效引物。20对引物在榨菜中都能够扩增出条带，其中14对引物扩增得到的条带与预期大小一致(预期大小见表1)，另外6对引物扩增得到的条带大于预期大小，说明SSR引物设计成功率较高，达到70％(图1)。
| 引物名称 | 正向引物 | 反向引物 | 预期大小 |
| 1号引物 | AAATCCCCAAAAACCTAGAG | CTCATCCATCTCCTCGTCT | 229bp |
| 2号引物 | CTGTAATTGAAGTTGGCCTC | GGGTAATCAAATCCAACAGA | 133bp |
| 3号引物 | GCTCTATCAAGACCATCGAG | CTTAGGCTTCTCAGCTTCCT | 194bp |
| 4号引物 | TCTTTTCTTCTGTTCGTTGAC | TAGATTCGGTTGGAGAAGAA | 258bp |
| 5号引物 | GAAGTTTCCAACAAAACAGG | GATTATGAACCACCGAGAGA | 128bp |
| 6号引物 | TCTCAAACCGAAACAAGTCT | TCACCGGTCTTAAAATCATC | 149bp |
| 7号引物 | GAAGATGGTGGCAGCTATAC | TAAGAAGACAGAGCCAAAGC | 235bp |
| 8号引物 | CTGTTCATCTTCGTCTCCTC | ACTTCTCTGTCTTCGGTTGA | 202bp |
| 9号引物 | TCAAACCATGAACCTTCTTC | TCTCTGTCTAAGCCTATCGC | 185bp |
| 10号引物 | ATCACAAAATCCGAGTCAAC | CATCGAATCAAAGAACTTCC | 270bp |
| 11号引物 | GGTTTATCCATGAGAGACCA | TGTCGGTTTTGTACTAGGCT | 156bp |
| 12号引物 | TGTTCTTTGTGCTGAATTTG | ATCATGGATAAACACTTGGG | 197bp |
| 13号引物 | GTCCTCCATTACAAAAGCTG | CTCTGCATATTCGGTTTCTC | 189bp |
| 14号引物 | AAATGCTATTGCTGGTCACT | ATTTTGTTGCGTTTGAAAGT | 151bp |
采用CTAB方法提取白菜、甘蓝、黑芥、榨菜、埃塞俄比亚芥、甘蓝型油菜以及模式植物拟南芥的基因组DNA。用各个基因组DNA对有效的榨菜EST‐SSR标记引物进行PCR扩增，PCR反应采用20μL反应体系，包括浓度为100ng/μL的基因组DNA模板1.0μL，浓度为10μM的正向引物1.0μL、浓度为10μM的反向引物1.0μL，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.5μL，浓度为2.5mM的dNTP 2μL，ddH2O 12.3μL。扩增反应程序为：94℃预变性3min，进入35个循环，每个循环为94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环后再72℃延伸7min，最后4℃保存。
反应结束后，PCR产物加入2μL loading buffer，以20bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用质量体积比为0.12g/ml的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，240V稳压电泳1.5h。随后统计PCR产物，有条带的数据为“1”，没有条带的为“0”。使用近缘材料DNA扩增出“1”的引物即具有通用性。14对有效引物在七种材料中都能扩增出条带，说明本发明所开发的引物具有较高的通用性(图2，3)。表明利用此榨菜转录组开发SSR引物的方法，适用于榨菜SSR引物的开发。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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attttgttgc gtttgaaagt 20
Claims (6)
1.基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组包括1号引物~14号引物，所述1号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；所述2号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；所述3号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示；所述4号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；所述5号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示；所述6号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.12所示；所述7号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示；所述8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.16所示；所述9号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示；所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示；所述11号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.21所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.22所示；所述12号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.23所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.24所示；所述13号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.25所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.26所示；所述14号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.27所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.28所示。
2.根据权利要求1所述的榨菜EST-SSR标记引物组，其特征在于，所述引物组通过以下步骤得到：
（1）获取榨菜转录组EST序列；
（2）采用SSRLocator软件对步骤（1）获得的EST序列进行SSR位点的筛选；
（3）榨菜EST-SSR引物的设计：依据上述步骤（2）筛选的EST-SSR位点，采用SSRLocator软件进行SSR引物设计出榨菜EST-SSR标记引物，得到引物组。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体为：
（1.1） 采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后，转移到‐70℃冰箱内保存；
（1.2）使用Trizol 试剂提取榨菜的总RNA；提取样品总RNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；利用mRNA反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并连接测序接头，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700 bp片段，将回收得到的片段进行PCR 扩增，建立测序文库，用Illumina HiSeqTM2000 对测序文库进行测序；根据测序结果，从中选取已知方向的EST序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：先对上述步骤（1）中得到的序列进行聚类去冗余，然后进行SSR位点的筛选；筛选标准包括：单核苷酸的重复次数大于或等于16次，二核苷酸重复次数大于或等于6次，三核苷酸重复次数大于或等于5次，四核苷酸重复次数和五核苷酸重复次数均大于或等于4次，六核苷酸重复次数~十核苷酸重复次数均大于或等于3次；同时也筛选中间被少数碱基（间隔小于或等于5 bp）打断的不完全重复的SSR位点。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中引物设计参数包括：引物长度为17-24bp；GC含量为30%-70%；退火温度为50-70℃；预期产物长度为100-280bp。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物长度最佳为20bp，GC含量最佳为50%；退火温度最佳为55℃，预期产物长度最佳为200bp。
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