CN108424975A - 基于转录组序列开发的葛根ssr标记引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对，共28对。所述SSR标记引物对是基于转录组序列开发得到的，克服了传统方式开发SSR标记步骤繁琐、工作量大、成本高的问题。最终进行SSR引物筛选与葛根种质资源遗传多样性分析，验证了SSR引物的有效性。本发明获得的SSR标记引物对是稳定存在的新标记，能够实现对葛根种质资源鉴定，亲缘关系鉴定及遗传多样性分析等奠定基础，具有很大的科学价值与应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对及其应用。
背景技术
葛根是豆科葛属(Pueraria DC.)多年生植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉，野葛(Pueraria lobata)和粉葛(Pueraria thomsonii)是我国葛属植物中分布最广的两个种，是我国药食同源的两种主要的种。葛根含有葛根素、黄酮等药用成分，具有美容丰胸、解肌、透疹、止泻、降脂、降糖、解酒、等功效。葛根富含淀粉，可作为非粮生物质新材料，避开产业发展中“与民争粮，与粮争地”的瓶颈，具有巨大的开发潜力。葛根生长迅速、生物量高、适应性好，2014国际葛根健康产业发展论坛透露，我国野葛和粉葛面积近100万公顷，具有很好的市场前景。广西葛根种植面积50多万亩，分布面积广，隆林、桂林、容县、凌云、崇左、梧州、天等、钦州、玉林等地均有种植，其中藤县年种植粉葛面积就超过10万亩，超过全国面积的1/5，对当地农民增收与农业结构调整有着重要意义。
葛根是我国具有自主知识产权的新药的研究领域，在中国种植历史悠久，但是长期以来主要靠采收野生资源供药用，因过度的采挖，以及资源保护和品种选育研究滞后，一些优良的葛根资源正在减少和消失。近年来，品种收集、评价和遗传多样性分析等研究受到了相应的重视。近几年，研究者已经相继用RAPD，ISSR，SRAP等标记对葛根的遗传多样性开展了研究，但针对广西地方品种的研究没有报道。
简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记随机分布在基因组中，共显性，丰度高，多态性高，相比于EST-SSR标记，转录组开发的SSR频率更高，能提高遗传多样性分析的准确性。相比于基于基因组文库开发的SSR标记，转录组开发的SSR特异性地靶向基因组的转录区，一旦基因功能得到证实，可直接用于辅助选择育种，增加了与性状决定基因连锁的潜力。
本发明通过对葛根转录组测序发掘到一批Unigenes，从中搜索到大量SSR位点(包括单核苷酸重复至六核苷酸重复)，设计并合成引物对，检测了一批广西来源的葛根资源的遗传相似性，验证了这些SSR引物的可用性。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的不足，本发明提供了基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对及其应用。本发明采用生物信息学途径进行葛根SSR标记引物的开发，可大批量开发SSR标记引物，获得的SSR标记引物对是稳定存在的新标记，SSR标记具有多态性高、重复性好、共显性、易检测、操作简单、等优点，比现有技术信息更全面、通用性好、效率更高，克服了传统方式开发SSR标记步骤繁琐、工作量大、成本高的问题。本发明获得的SSR引物对能够实现对葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等研究，具有很大的科学价值与应用价值。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对，其特征在于：所述引物对共28对，分别为：
第一对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示；
第二对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示；
第三对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示；
第四对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示；
第五对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示；
第六对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示；
第七对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物序列如SEQ ID NO:14所示；
第八对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物序列如SEQ ID NO:16所示；
第九对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:17所示，反向引物序列如SEQ ID NO:18所示；
第十对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列如SEQ ID NO:20所示；
第十一对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列如SEQ ID NO:22所示；
第十二对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列如SEQ ID NO:24所示；
第十三对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:25所示，反向引物序列如SEQ ID NO:26所示；
第十四对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:27所示，反向引物序列如SEQ ID NO:28所示；
第十五对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:29所示，反向引物序列如SEQ ID NO:30所示；
第十六对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:31所示，反向引物序列如SEQ ID NO:32所示；
第十七对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:33所示，反向引物序列如SEQ ID NO:34所示；
第十八对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:35所示，反向引物序列如SEQ ID NO:36所示；
第十九对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:37所示，反向引物序列如SEQ ID NO:38所示；
第二十对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:39所示，反向引物序列如SEQ ID NO:40所示；
第二十一对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:41所示，反向引物序列如SEQ ID NO:42所示；
第二十二对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:43所示，反向引物序列如SEQ ID NO:44所示；
第二十三对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:45所示，反向引物序列如SEQ ID NO:46所示；
第二十四对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:47所示，反向引物序列如SEQ ID NO:48所示；
第二十五对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:49所示，反向引物序列如SEQ ID NO:50所示；
第二十六对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:51所示，反向引物序列如SEQ ID NO:52所示；
第二十七对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:53所示，反向引物序列如SEQ ID NO:54所示；
第二十八对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:55所示，反向引物序列如SEQ ID NO:56所示。
进一步的，所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对的筛选方法，其特征在于通过以下步骤得到：
(1)构建转录组文库：提取葛根组织中的RNA，检测RNA的纯度，测定RNA的浓度，评价RNA质量，富集mRNA，然后采用所述mRNA为模板合成cDNA链，得到cDNA文库；
(2)对cDNA文库进行测序，获得的Raw data；随后，对Raw Data进行数据过滤，去除其中的接头序列、包含多N及低质量Reads，获得高质量的Clean Data；
(3)采用Trinity法对步骤(2)的Clean Data进行序列组装，选择每条基因中最长的转录本作为Unigene；
(4)采用MISA软件对步骤(3)中的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和复杂类型SSR位点搜索；
(5)SSR引物设计：采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-23bp，预期扩增长度80-200bp，GC含量30-70％，Tm值57℃-62℃，排除单碱基重复SSR和复杂类型SSR和长度少于18bp的SSR；
(6)SSR引物筛选：用CTAB法提取葛根资源的基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，PAGE凝胶电泳，筛选出条带清晰且与预期扩增片段大小相似的引物，即为有效的SSR引物对。
本发明中，进行SSR引物筛选时，筛选出条带清晰且与预期(表2)扩增片段大小相似的引物。
进一步的，在步骤(6)中，所述PCR反应体系为20ul：其中PCR mix 10ul，上下游引物各1ul(使用浓度为10umol/l)，基因组DNA2ul(50ng)；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物用PAGE胶电泳分离，用硝酸银和甲醛银染显影。
进一步的，在步骤(1)中，用带有poly-T Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；以mRNA为模板，使用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二条cDNA链，得到cDNA文库。
进一步的，在步骤(1)中，所述葛根组织为葛根的根、茎、叶。
进一步的，所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对在葛根种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。
综上所述，本发明由于采用了上述方案，具有以下积极效果：
(1)目前报道的应用于葛根遗传多样性分析的分子标记只有RAPD、ISSR、SRAP这3种方法，但是SSR标记具有多态性高、重复性好、共显性、易检测、操作简单、等优点，能够实现对葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究，具有很大的科学价值与应用价值。
(2)与现有技术相比，获得的转录组序列，极大地增加了用于引物开发的原始数据；本发明利用转录组数据开发的SSR标记引物对比SSR(包括EST-SSR和genomic-SSR)标记信息更全面、通用性好、效率更高，可以挖掘到更多的SSR位点，可以提高遗传多样性研究的精准性，克服了传统方式开发SSR标记步骤繁琐、工作量大、成本高的问题。
(3)本发明采用生物信息学途径进行葛根SSR标记引物的开发，可大批量开发SSR标记引物，获得了一批扩增效率高且多态性好的SSR标记引物对，获得的SSR标记引物对是稳定存在的新标记，可以直接用于后期鉴定不同地方来源的葛根遗传多样性并加快葛根核心种质库的构建，解决了与性状决定基因连锁的潜在问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显然，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1为PtSSR144在葛根资源中的等位变异；其中，泳道1-32表示32个葛根资源；M：DL2000marker，条带依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；
图2为44份葛根资源的SSR聚类结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对及其应用，作进一步说明。
实施例1
基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对，是通过葛根转录组测序、SSR位点鉴别及SSR引物设计、DNA提取、SSR引物筛选和遗传多样性分析等步骤得到。
上述所述基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对的筛选方法，通过以下步骤得到：
(1)构建转录组文库：采用EZNAPlant RNAKit(Omega Bio-tek)提取葛根的根、茎、叶中的RNA，取葛根的根、茎、叶中的RNA等量混合，使用spectrophotometer检测RNA的纯度，使用2.0Flurometer(Invitrogen，LifeTechnologies,CA,USA)测定RNA的浓度，使用Agilent Bioanalyzer 2100(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)系统评价RNA的质量；用带有poly-T Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；采用所述mRNA为模板，使用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二条cDNA链，得到cDNA文库；
(2)使用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台对步骤(1)的cDNA文库进行测序，获得的Raw data；随后，对Raw Data进行数据过滤，去除其中的接头序列、包含多N及低质量Reads，获得高质量的Clean Data；
(3)采用Trinity法对步骤(2)的Clean Data进行序列组装，选择每条基因中最长的转录本作为Unigene；
(4)采用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对步骤(3)中的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和复杂类型SSR位点搜索；
(5)SSR引物设计：采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-23bp，预期扩增长度80-200bp，GC含量30-70％，Tm值57℃-62℃，排除单碱基重复SSR和复杂类型SSR和长度少于18bp的SSR；
(6)SSR引物筛选：用CTAB法提取葛根资源的基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，PAGE凝胶电泳，筛选条带清晰且与预期扩增产物长度、大小相近的引物，该引物即为SSR引物对；所述PCR反应体系为20ul：其中PCR mix 10ul，上下游引物各1ul(使用浓度为10umol/l)，基因组DNA2ul(50ng)；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物用PAGE胶电泳分离，用硝酸银和甲醛银染显影。
应用上述方法是用葛根根茎叶组织作为材料进行高通量测序，获得92228400bpraw reads，共得到89135882bp Clean Reads，组装得到137629个转录本，共有83811个Unigene，采用MISA从中搜索到25452个SSR位点，其中21052个Unigene鉴定出27178个SSR位点，SSR发生频率(检出SSR个数与总Unigene数目之比)为32.43％，平均每16303个Unigene中含有一个SSR位点，发生频率为19.45％；其中4749个Unigene含两个及两个以上SSR位点，发生频率为5.67％。
如表1所示，有单核苷酸至六核苷酸和复杂重复类型的SSR存在。其中单核苷酸重复出现频率最高，有13703个(53.84％)，其次为二核苷酸和三核苷酸重复，分别有4735个(17.19％)和5023个(19.74％)，四、五和六核苷酸重复出现频率均较低，分别为总SSR数量的1.21％、0.25％和0.08％。
表1葛根转录组二核苷酸和三核苷酸重复SSR的频率分布
从分布频率来看(表1)，AG/CT重复单元是所有双核苷酸重复最多的，为3394个(71.68％)；其次是AC/GT，983个(20.76％)；再者，AG/CT重复的SSR中，以重复六次的SSR居多，1144个(33.71％)。所有三核苷酸重复基元的SSR中，AAG/CTT、AAC/GTT和AAT/ATT是最普遍的类型，分别有1400个(27.87％)，800个(15.93％)和826个(16.44％)。所有的AAG/CTT类型中，五次重复是最多的一类，为726个(51.86％)。
根据25452条含有SSR位点的Unigene序列进行引物设计，一个位点合成一对引物，排除单碱基重复SSR、复杂类型SSR、长度少于18bp的SSR和PCR产物在不在80-200bp之间的SSR，共获得229对候选SSR引物。以6份葛根种质资源材料的基因组DNA为模板，用229对候选SSR引物进行PCR扩增，PAGE凝胶电泳，SSR引物筛选。结果表明，28对引物均能够扩增出清晰的条带且长度、大小与预期相符，为有效SSR引物，其序列和特征如表2所示。
表2在44份葛根资源中表现多态性的28对SSR引物信息
利用验证的28对SSR引物对(表2)检测44份葛根种质(表3)资源的基因型。结果表明，28对引物在44份葛根种质资源中呈现出高度的多态性(表2)，28对SSR引物对共扩增出90个条带，多态性条带为89个，平均每个引物获得3.18个条带，如图1(标记PtSSR144的带型)所示。采用NTSYS-PC分析软件计算遗传相似系数并进行聚类分析。结果表明，这些材料之间的遗传相似性系数在0.2667-1.0000之间。在相似性系数为0.58时，44份葛根种质(表3)资源可以分为2大类，第一类有32个资源，第二类有12个资源。在相似性系数为0.77水平时，第一大类的32个资源可以分为5个亚组，其中35和25号资源分别单独聚为一组；第二大类的12个资源可以分为3个亚组，其中14号资源单独聚为一组。在遗传相似性系数为1.00时，7、8、10、11、17和18号资源聚为一类；26、27、29、30、31和32号资源聚为一类；42、43和44资源聚为一类，它们分别具有相同的遗传背景(图2)。以上结果表明开发的28对SSR引物(表2)标记可以用于葛根遗传多样性的分析。
表3供试葛根种质及其来源
综上所述，本发明表明采用葛根转录组数据进行SSR标记开发是一种十分有效的途径。本发明采用生物信息学途径进行葛根SSR标记引物的开发，可大批量开发SSR标记引物，获得的SSR标记引物对是稳定存在的新标记，SSR标记具有多态性高、重复性好、共显性、易检测、操作简单、等优点，比现有技术信息更全面、通用性好、效率更高，可以挖掘到更多的SSR位点，克服了传统方式开发SSR标记步骤繁琐、工作量大、成本高的问题。本发明开发的标记引物对能够实现对葛根种质资源鉴定、亲缘关系鉴定和遗传多样性分析等，具有很大的科学价值与应用价值。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所
广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室
<120> 基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对及其应用
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgagtctct gcaaagccca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtcactgtg ctccaactcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagcactac tcgtgtcctt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtacagatac acctcggcgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cattcggacc tccatacccg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgcatccaa ccctgatcaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctttccgct gctaccattc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaaccccaa tgcttcacag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccctccca ccactacaac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaatgtcct cctcagctgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcgtgccca actcagttaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgacggagaa ggagggaatg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caacctggct tctgttgtgc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctctgaaacg ctgggcaatg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acactcaaca ctccaccacc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agggtttcca ccttgaaccg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggtttctt ctcggctgaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacccccttc acgcttcata 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atcagtgtct acgtggggga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cactgcagcc acaacaacat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatccgcacc ctatctgtgg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgcgacagc tccgatctta 20
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgttgctttg aacactaaca tgct 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgcccttgtc agacacaaca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttcaacattc ccccaacccc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagaagagga acaccaggcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acgacgatgc cagtgtcatt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcgtccaccc tggtgtagat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gatcccaccc accacttctg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggctctagtt ctggtgctgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atcagtgtct acgtggggga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cactgcagcc acaacaacat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctccaaaac aagaaggaaa ctcc 24
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tctttcctct tctggtatcc ca 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
caaagaagaa gcagccgcag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtcaatcccg aagcacttgc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgagtctct gcaaagccca 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgtcactgtg ctccaactcc 20
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgttgctttg aacactaaca tgct 24
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgcccttgtc agacacaaca 20
<210> 41
<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgttgctttg aacactaaca tgct 24
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcccttgtc agacacaaca 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aactgcagga ggagcatgac 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gagcctccag gttcttgtcc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggaagcattg cggtttggtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcacatcaca tgctgccact 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gcaagaacct gtgctcctct 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgccaatgcc attgtggttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctcttcca gcgagaactt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgagtctct gcaaagccca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtcactgtg ctccaactcc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgattctat tcggttgccc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggttgcattc ggaagcaaca 20
Claims (6)
1.一种基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对，其特征在于：所述引物对共28对，分别为：
第一对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQID NO:2所示；
第二对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQID NO:4所示；
第三对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQID NO:6所示；
第四对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQID NO:8所示；
第五对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQID NO:10所示；
第六对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:11所示，反向引物序列如SEQ ID NO:12所示；
第七对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:13所示，反向引物序列如SEQ ID NO:14所示；
第八对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:15所示，反向引物序列如SEQ ID NO:16所示；
第九对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:17所示，反向引物序列如SEQ ID NO:18所示；
第十对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:19所示，反向引物序列如SEQ ID NO:20所示；
第十一对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:21所示，反向引物序列如SEQ ID NO:22所示；
第十二对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:23所示，反向引物序列如SEQ ID NO:24所示；
第十三对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:25所示，反向引物序列如SEQ ID NO:26所示；
第十四对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:27所示，反向引物序列如SEQ ID NO:28所示；
第十五对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:29所示，反向引物序列如SEQ ID NO:30所示；
第十六对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:31所示，反向引物序列如SEQ ID NO:32所示；
第十七对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:33所示，反向引物序列如SEQ ID NO:34所示；
第十八对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:35所示，反向引物序列如SEQ ID NO:36所示；
第十九对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:37所示，反向引物序列如SEQ ID NO:38所示；
第二十对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:39所示，反向引物序列如SEQ ID NO:40所示；
第二十一对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:41所示，反向引物序列如SEQ ID NO:42所示；
第二十二对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:43所示，反向引物序列如SEQ ID NO:44所示；
第二十三对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:45所示，反向引物序列如SEQ ID NO:46所示；
第二十四对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:47所示，反向引物序列如SEQ ID NO:48所示；
第二十五对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:49所示，反向引物序列如SEQ ID NO:50所示；
第二十六对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:51所示，反向引物序列如SEQ ID NO:52所示；
第二十七对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:53所示，反向引物序列如SEQ ID NO:54所示；
第二十八对引物，其引物序列为：其正向引物序列如SEQ ID NO:55所示，反向引物序列如SEQ ID NO:56所示。
2.根据权利要求1所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对的筛选方法，其特征在于通过以下步骤得到：
(1)构建转录组文库：提取葛根组织中的RNA，检测RNA的纯度，测定RNA的浓度，评价RNA质量，富集mRNA，然后采用所述mRNA为模板合成cDNA链，得到cDNA文库；
(2)对cDNA文库进行测序，获得的Raw data；随后，对Raw Data进行数据过滤，去除其中的接头序列、包含多N及低质量Reads，获得高质量的Clean Data；
(3)采用Trinity法对步骤(2)的Clean Data进行序列组装，选择每条基因中最长的转录本作为Unigene；
(4)采用MISA软件对步骤(3)中的Unigene进行单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和复杂类型SSR位点搜索；
(5)SSR引物设计：采用Primer3软件进行SSR引物设计，引物序列长度18-23bp，预期扩增长度80-200bp，GC含量30-70％，Tm值57℃-62℃，排除单碱基重复SSR和复杂类型SSR和长度少于18bp的SSR；
(6)SSR引物筛选：用CTAB法提取葛根资源的基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，PAGE凝胶电泳，筛选出条带清晰且与预期扩增片段大小相似的引物，即为有效的SSR引物对。
3.根据权利要求2所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对的筛选方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述PCR反应体系为20ul：其中PCR mix 10ul，上下游引物各1ul(使用浓度为10umol/l)，基因组DNA2ul(50ng)；PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物用PAGE胶电泳分离，用硝酸银和甲醛银染显影。
4.根据权利要求2所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对的筛选方法，其特征在于：在步骤(1)中，用带有poly-T Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；以mRNA为模板，使用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二条cDNA链，得到cDNA文库。
5.根据权利要求2所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对的筛选方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述葛根组织为葛根的根、茎、叶。
6.根据权利要求1所述的基于转录组序列开发的葛根SSR标记引物对在葛根种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及亲缘关系研究上的应用。
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