CN108504762B

CN108504762B - 一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法

Info

Publication number: CN108504762B
Application number: CN201810505018.5A
Authority: CN
Inventors: 包文泉; 敖敦
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN108504762A

Abstract

一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法，所述分子标记引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物trnK‑UUU‑rps16F的序列为：AGATTGAATTGCACAGCG，所述反向引物trnK‑UUU‑rps16R的序列为：TGAAGTAATCGGGTCTAT。鉴别方法包括如下步骤：(1)叶片样本的采集；(2)叶片样本总基因组DNA的提取；(3)利用鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，对步骤(2)中的叶片样本总基因组DNA中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；(4)对步骤(3)中的扩增产物进行纯化和测序；(5)对步骤(4)中测序结果进行比对分析。基于trnK‑UUU‑rps16基因间隔区的碱基差异，正向引物和反向引物可以作为鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的种质区分的分子标记引物，且鉴别方法简单，易操作。

Description

一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说是一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法。

背景技术

大扁杏(Kernel-using apricot)为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(Armeniaca)植物，是我国特有的生态经济型树种，也是我国六大木本粮油树种之一。主要分布于我国河北、辽宁、甘肃、内蒙古、山西和陕西省等中西部生态脆弱区。大扁杏浑身是宝，常被誉为“铁杆庄家”。与其他杏相比，大扁杏核仁香甜无苦味，富含蛋白质、脂肪、糖、维生素B17及微量苦杏仁苷等成分，可加工成干果，生产杏仁蛋白、杏仁油、化妆品、功能食品等，是优质食品、化妆品和中药材原料；大扁木材坚硬，是生产高档家具的上佳材料；大扁杏根系发达，抗寒、抗旱及耐瘠薄能力极强，是我国中西部高寒及生态脆弱区发展的优良树种，具有极高的经济、社会和生态价值，应用前景十分广阔。但我国杏属植物种质资源极为丰富，生长环境又相似，使其具有相似的形态特征等原因，生产及市场上常有以西伯利亚杏、鲜食杏冒充大扁杏的现象。伪品西伯利亚杏、鲜食杏较大扁杏的产量、出仁率、核仁含油率及口感均差，不能代替大扁杏的经济效益，因此，在市场流通时需要准确相互辨别。

目前，对大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的鉴定主要通过传统的形态特征鉴别法来完成，而传统鉴定方法需要3-5年的生长周期，不利于推广。近年来，随着分子生物学及生物信息学的飞速发展，DNA条形码鉴别技术因不受环境及形态特征的影响，操作简单易行，且重复性和稳定性高等优点，已成为动植物鉴定有效工具。

植物DNA条形码中，可用的基因组DNA有核基因组DNA(nrDNA)、叶绿体基因组DNA(cpDNA)和线粒体基因组DNA(mtDNA)，其中，nrDNA的进化速率最快，是细胞核内全自主的遗传系统，其结构与组成极为复杂，各基因家族形成功能调控网络，并且很多基因出现多拷贝现象，存在直系同源和旁系同源等问题。而mtDNA易发生基因重排、重复和丢失，并且植物mtDNA拷贝数较低，提取和纯化较难，因此，在植物鉴定中mtDNA的应用范围有限。相比于nrDNA和mtDNA，cpDNA既不存在较多的重复序列，也不出现频繁的重排事件，它不受遗传重组的影响，对鉴别复杂的物种具有特殊意义。同时，叶绿体基因组绝大数属于母系遗传，具有相对独立的演化路线，其进化速率适中，较适用于属及种等低分类阶元的鉴定分析。植物叶绿体trnK-UUU-rps16基因间隔片段进化速度较慢，在属及种的水平上遗传变异较小，具有通用性强、易扩增等特点，在植物鉴别研究中常选取作为分子鉴定的DNA条形码。可以结合DNA快速提取检测技术，寻找和建立杏属植物便捷的鉴定方法。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子鉴别引物及方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，分子标记引物为叶绿体基因组。

上述的鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，所述分子标记引物包括正向引物和反向引物；

所述正向引物trnK-UUU-rps16F的序列为(如SEQ ID NO:1所示)：AGATTGAATTGCACAGCG，

所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为(如SEQ ID NO:2所示)：TGAAGTAATCGGGTCTAT。

一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，包括如下步骤：

(1)叶片样本的采集；

在步骤(1)中，采集各地区鲜嫩、健康和无病虫害的大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的叶片样本，组成大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群。

(2)叶片样本总基因组DNA的提取；

在步骤(2)中，通过植物DNA快速提取试剂盒，提取大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本的总基因组DNA。

(3)利用鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，对步骤(2)中的叶片样本总基因组DNA中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；

在步骤(3)中，鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，包括正向引物和反向引物；

所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为(如SEQ ID NO:2所示)：TGAAGTAATCGGGTCTAT；

所述目标片段序列为：trnK-UUU-rps16。

在步骤(3)中，

PCR扩增反应体系为：为25uL的混合体系，包括9.5μL的无菌去离子水ddH₂O，1μL的叶片样本总基因组DNA，12.5μL的2×Tab Master Mix，1μL的正向引物和1μL的反向引物；所述叶片样本总基因组DNA的浓度为10-20ng·μL^-1；

PCR反应程序为：

(P-1)95℃预变性5min，

(P-2)95℃变性30s，

(P-3)52℃的退火30s，

(P-4)72℃延伸30s，

(P-5)步骤(P-1)到步骤(P-4)循环30次，

(P-6)72℃终延伸5min。

(4)对步骤(3)中的扩增产物进行纯化和测序；

在步骤(4)中，用DNA分析仪对步骤(3)中得到PCR扩增产物，进行检测。

(5)对步骤(4)中测序结果进行比对分析。

在步骤(5)中，用GENEDOC和DNAMAN软件进行序列比对，获得大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异，进行物种间的鉴别。

在步骤(5)中，将大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异作为鉴别种质的分子标记，大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异如下：

(1)在第92个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为G；

(2)在第131碱基位置处大扁杏叶片样本群有碱基AAATATTT的插入，而西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处有碱基AAATATTT的缺失；

(3)在第151个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为C；

(4)在第178碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群有碱基ATTAGA的插入，而西伯利亚杏叶片样本群在此处有碱基ATTAGA的缺失；

(5)在第230个碱基位置处大扁杏叶片样本群的碱基为A，而西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处的碱基为C；

(6)在第385碱基位置处西伯利亚杏叶片样本群有碱基A的插入，而大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处有碱基A的缺失；

(7)在第425个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为TT，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为AA；

(8)在第551个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为G；

(9)在第560碱基位置处西伯利亚杏叶片样本群有碱基AA的插入，鲜食杏叶片样本群在此处有碱基A的插入，而大扁杏叶片样本群在此处有碱基A的缺失。

有益效果

1.利用正向引物trnK-UUU-rps16F和反向引物trnK-UUU-rps16R对大扁杏叶片、西伯利亚杏叶片和鲜食杏叶片样本的总基因组DNA扩增，对扩增得到的叶绿体DNA trnK-UUU-rps16基因间隔短片段序列比对结果，可看出大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏序列间存在9个碱基变异位点，分别为5个转换，4个插入/缺失。大扁杏群体个体间扩增结果一致，西伯利亚杏群体个体间扩增结果一致，鲜食杏群体个体间扩增结果亦一致，均表现出高度的一致性。该方法的结果稳定，可重复性强，保证了极高的准确性，因此，基于trnK-UUU-rps16基因间隔区的碱基差异可以作为大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的种质区分的分子标记，且鉴别方法简单，易操作。

2.由于叶绿体基因拷贝数比核基因多，较核基因，叶绿体基因不易受DNA降解的影响，因此，叶绿体DNA的条形码更适于各种植物的分子鉴别。

3.传统的形态特征检测方法，需植物叶、花、果实等的长时间(3-5年)观察和鉴定才能完成，且易受环境及人为的影响，本发明只需一片叶即可对样品进行快速识别，大大提高了检测速度和效率，为本发明借鉴该方法建立了快速简便的检测体系。

附图说明

图1利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本的DNA质量的电泳检测图(1-4为大扁杏叶片样本，5-8为西伯利亚杏叶片样本，9-12为鲜食杏叶片样本)；

图2利用琼脂糖凝胶电泳检测大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本的trnK-UUU-rps16F基因特异PCR扩增产物的电泳检测图(1-4为大扁杏叶片样本，5-8为西伯利亚杏叶片样本，9-12为鲜食杏叶片样本)；

图3大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本鉴别方法示意图的左半部分(1-4为大扁杏叶片样本，5-8为西伯利亚杏叶片样本，9-12为鲜食杏叶片样本)；

图4大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本鉴别方法示意图的右半部分(1-4为大扁杏叶片样本，5-8为西伯利亚杏叶片样本，9-12为鲜食杏叶片样本)。

具体实施方式

仪器与材料

PCR仪(Eppendorf，型号5332)，低温冷冻离心机(Eppendorf，型号5810R),微量移液器(Eppendorf)，电泳系统(北京市六一仪器厂，型号DYY—12)，凝胶成像分析仪(BIO-RADChemiDoc XRS)，ABI 3500XL(Applied Biosystems，USA)DNA分析仪。

植物DNA快速提取试剂盒(北京天根公司)，TAE缓冲液，琼脂糖(Promega公司)，Goldview(北京索莱宝科技有限公司)，DNA Taq聚合酶(Takara公司)，三氯甲烷、无水乙醇为国产分析纯。

实施例1

1.叶片样本的采集

样品是由内蒙古林木良种繁育中心鉴定并收集，采自不同产地的大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的鲜嫩、健康、无病虫害的叶片样本各4份。如表1所述。

表1大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的叶片样本及来源

2.叶片样本总基因组DNA的提取

通过植物DNA快速提取试剂盒，对叶片样品总基因组DNA进行提取，并基于1％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，结果显示如图1所述，电泳条带的亮度、均匀度及点样口光点等均显示良好，表明样品纯度高，无污染，可直接用于后续分子生物学实验。

3.PCR扩增供叶片样本总基因组DNA中的目标基因序列

利用特异引物正向引物trnK-UUU-rps16F和反向引物trnK-UUU-rps16R扩增目标基因trnK-UUU-rps16序列；

PCR扩增反应体系为：25uL的混合体系，包括9.5μL的无菌去离子水ddH2O，1μL的叶片样本总基因组DNA，12.5μL的2×Tab Master Mix，1μL的正向引物和1μL的反向引物；所述叶片样本总基因组DNA的浓度为10-20ng·μL-1；

PCR反应程序为：

(P-1)95℃预变性5 min，

(P-2)95℃变性30s，

(P-3)52℃的退火30s，

(P-4)72℃延伸30 s，

(P-5)步骤(P-1)到步骤(P-4)循环30次，

(P-6)72℃终延伸5 min。

4.对扩增产物进行纯化和测序

12个叶片样品的PCR扩增产物，采用ABI 3500XL(Applied Biosystems，USA)DNA分析仪进行检测。

5.对测序结果进行比对分析

对测序所得的12个叶片样本的trnK-UUU-rps16基因间隔片段序列，用GENEDOC和DNAMAN软件进行序列比对，获得大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的特异INDEL和SNP，进行物种间的鉴别。

实施例2结果分析

对PCR产物进行纯化后，进行双向测序，并对大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的序列进行比对，大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在叶绿体基因trnK-UUU-rps16目的片段序列的比对结果为：

大扁杏：

AGATTGAATTGCACAGCGCAATCAAAAGCAATCAAAATATTAAAATAAATTTAAAAATTTCTAATTGATTATATTCTGAACATAATAAAAATTAACGGATAAAAATAGGCATTTTAAATATTTAAATATTT(AAATATTT)⁺AAGGACCGCCCCTTGTCTCTTATGTTATCCATTAATGA(ATTAGA)⁺ATTAGTACATATAGATTTTTATTAATTTTAATCTTAATCAAAATAATAAAAAAAAGACTTCTTGTATCACAGAAAATCCAAGAACCCATTATTTGAATGAAATAAAATCTATGGGACAGAGATATAAATAGATCCTTATTATCCACGATCGGATTATATTTATTTGATACACTGTTGTCAATATGAATGTTGAGAAAAAAAA-TACAAAAGAGAAAACAAATTATAAATCTAACTAACAATTTTAATTTCAATCAATTTTAATAAAAAAAAACTAAGTACTTGTGTTGGATTGGCACTACATAATATATACAATATTTATATACAATATTGGTGGAAGAATAAATTAAGGAAGATAAAGGGAAAAGTATAAAAAAAA--TGAGGTTTATTTGATAAGTAAAATAAACAAGTTTAATCCTTTGTGTTTTTTTATTTGTTCATAGAGTTCCACCGAAAACCACCTCATTGACAGTAATCTCAAAATTTTATATTTATAGACCCGATTACTTCA

2西伯利亚杏：

AGATTGAATTGCACAGCGCAATCAAAAGCAATCAAAATATTAAAATAAATTTAAAAATTTCTAATTGATTATATTCTGAACATAATAAAAATGAACGGATAAAAATAGGCATTTTAAATATTTAAATATTT--------AAGGACCGCCCCCTGTCTCTTATGTTATCCATTAATGA------ATTAGTACATATAGATTTTTATTAATTTTAATCTTAATCAAAATAATCAAAAAAAGACTTCTTGTATCACAGAAAATCCAAGAACCCATTATTTGAATGAAATAAAATCTATGGGACAGAGATATAAATAGATCCTTATTATCCACGATCGGATTATATTTATTTGATACACTGTTGTCAATATGAATGTTGAGAAAAAAAA(A)⁺TACAAAAGAGAAAACAAATTATAAATCTAACTAACAATTAAAATTTCAATCAATTTTAATAAAAAAAAACTAAGTACTTGTGTTGGATTGGCACTACATAATATATACAATATTTATATACAATATTGGTGGAAGAATAAATTAAGGAAGATAAAGGGAAAAGTAGAAAAAAAA(AA)⁺TGAGGTTTATTTGATAAGTAAAATAAACAAGTTTAATCCTTTGTGTTTTTTTATTTGTTCATAGAGTTCCACCGAAAACCACCTCATTGACAGTAATCTCAAAATTTTATATTTATAGACCCGATTACTTCA

3鲜食杏：

AGATTGAATTGCACAGCGCAATCAAAAGCAATCAAAATATTAAAATAAATTTAAAAATTTCTAATTGATTATATTCTGAACATAATAAAAATTAACGGATAAAAATAGGCATTTTAAATATTTAAATATTT--------AAGGACCGCCCCTTGTCTCTTATGTTATCCATTAATGAATTAGAATTAGTACATATAGATTTTTATTAATTTTAATCTTAATCAAAATAATCAAAAAAAGACTTCTTGTATCACAGAAAATCCAAGAACCCATTATTTGAATGAAATAAAATCTATGGGACAGAGATATAAATAGATCCTTATTATCCACGATCGGATTATATTTATTTGATACACTGTTGTCAATATGAATGTTGAGAAAAAAAA-TACAAAAGAGAAAACAAATTATAAATCTAACTAACAATTTTAATTTCAATCAATTTTAATAAAAAAAAACTAAGTACTTGTGTTGGATTGGCACTACATAATATATACAATATTTATATACAATATTGGTGGAAGAATAAATTAAGGAAGATAAAGGGAAAAGTATAAAAAAAA(A)⁺TGAGGTTTATTTGATAAGTAAAATAAACAAGTTTAATCCTTTGTGTTTTTTTATTTGTTCATAGAGTTCCACCGAAAACCACCTCATTGACAGTAATCTCAAAATTTTATATTTATAGACCCGATTACTTCA

其中，“()⁺”表示碱基序列插入；“-”表示碱基序列缺失；有下划线“”的碱基与对应的碱基为转换特异变异。

由大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的trnK-UUU-rps16基因间隔区片段序列排序结果，可看出其间存在9个变异位点，分别为5个转换，4个插入/缺失，可将三个种有效鉴别；

测序结果表明，大扁杏叶片样本群4个个体扩增结果一致，西伯利亚杏叶片样本群4个个体扩增结果一致，鲜食杏叶片样本群4个个体扩增结果亦一致，均表现出高度的一致性，结果稳定且可重复性强，保证了极高的准确性，因此，基于trnK-UUU-rps16基因间隔区的碱基差异可作为大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的种质区分的分子标记，且鉴别方法简单，易操作。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物及方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agattgaatt gcacagcg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagtaatc gggtctat 18

Claims

1.一种鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）叶片样本的采集：采集各地区鲜嫩、健康和无病虫害的大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的叶片样本，组成大扁杏叶片样本群、西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群；

（2）叶片样本总基因组DNA的提取：通过植物DNA快速提取试剂盒，提取大扁杏叶片样本、西伯利亚杏叶片样本和鲜食杏叶片样本的总基因组DNA；

（3）利用鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，对步骤（2）中的叶片样本总基因组DNA中的目标基因进行扩增，得到扩增产物；在步骤（3）中，鉴别大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的分子标记引物，包括正向引物和反向引物；

所述正向引物trnK-UUU-rps16F的序列为AGATTGAATTGCACAGCG，

所述反向引物trnK-UUU-rps16R的序列为TGAAGTAATCGGGTCTAT；

PCR扩增反应体系为：25µL的混合体系，包括9.5µL的无菌去离子水ddH₂O，1µL的叶片样本总基因组DNA，12.5µL的2×Taq Master Mix，1µL的正向引物和1µL的反向引物；所述叶片样本总基因组DNA的浓度为10-20 ng•µL^-1；

PCR反应程序为：

（P-1）95℃预变性5min，

（P-2）95℃变性30s，

（P-3）52℃的退火30s，

（P-4）72℃延伸30s，

（P-5）步骤（P-1）到步骤（P-4）循环30次，

（P-6）72℃终延伸5min，

（4）对步骤（3）中的扩增产物进行纯化和测序；用DNA 分析仪对步骤（3）中得到PCR扩增产物，进行检测；

（5）对步骤（4）中测序结果进行比对分析：

用GENEDOC和DNAMAN软件进行序列比对，获得大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异，进行物种间的鉴别；

大扁杏、西伯利亚杏和鲜食杏的碱基差异如下：

（A）在第92个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为G；

（B）在第131碱基位置处大扁杏叶片样本群有碱基AAATATTT的插入，而西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处有碱基AAATATTT的缺失；

（C）在第151个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为C；

（D）在第178碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群有碱基ATTAGA的插入，而西伯利亚杏叶片样本群在此处有碱基ATTAGA的缺失；

（E）在第230个碱基位置处大扁杏叶片样本群的碱基为A，而西伯利亚杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处的碱基为C；

（F）在第385碱基位置处西伯利亚杏叶片样本群有碱基A的插入，而大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群在此处有碱基A的缺失；

（G）在第425个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为TT，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为AA；

（H）在第551个碱基位置处大扁杏叶片样本群和鲜食杏叶片样本群的碱基为T，而西伯利亚杏叶片样本群在此处的碱基为G；

（I）在第560碱基位置处西伯利亚杏叶片样本群有碱基AA的插入，鲜食杏叶片样本群在此处有碱基A的插入，而大扁杏叶片样本群在此处有碱基A的缺失。