CN105713981B - 利用ssr分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法 - Google Patents

利用ssr分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用特异SSR分子标记结合荧光毛细管电泳检测技术对仁用杏种质鉴定的方法，包括如下步骤：利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测后进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，其中，所用的分子标记选自如下SSR标记，UDP98‑409、UDP98‑406、UDP97‑401、pchgms12、MA039a、MA020a、BPPCT002、BPPCT007和BPPCT008，所述SSR分子标记的正向引物序列和反向引物序列依次如SEQ ID NO:1‑18所示。本发明还涉及以上用到的SSR引物以及应用所述SSR引物构建的仁用杏遗传多样性分析方法。

Description

利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种仁用杏种质鉴定的方法，特别是涉及一种利用特异SSR分子标记结合荧光毛细管电泳检测技术进行仁用杏种质鉴定的方法。
背景技术
仁用杏(Kernel-using apricots)又称“大扁杏”(俞德浚等，1984)，属蔷薇科杏属，仁大、出仁率高、饱满、杏仁味香甜或无苦味，是以产杏仁为主的我国特有杏种质资源(张加延和张钊，2003)。目前，生产栽培中主栽品种以优一、三杆旗、围选一号、龙王帽和一窝蜂等品种为主，仁用杏适应性强，栽培范围广，具有经济价值高(张睿和魏安智，2005)和广阔的开发利用前景。
长期以来仁用杏不同地区之间引种混乱或地方品种没有准确学名，且一些品种在形态上类似，传统的形态分类法很难满足仁用杏品种的鉴定，使仁用杏出现“同物异名”、“同名异物”现象，随着现代分子生物学技术的快速发展,分子标记技术已广泛应用在物种起源、种质鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种(韩晓颖和梁英海,2009；张靖国和胡红菊,2009)等研究领域，其中，SSR(simple sequence repeat)标记具有多态性丰富、共显性遗传等优点，在杏资源中也得到广泛的应用(R.Sa′nchez-Pe′rez et al.，2005；HediaBourguiba et al.，2010；张淑青和刘冬成，2010；陈娇和王小蓉，2013；Zhe Wang et al.，2014；)，但对于仁用杏品种鉴别及指纹图谱构建，在SSR标记基础上研究的报道少见；与此同时，应用RAPD标记技术对鉴别白玉扁、龙王帽、一窝蜂和优一等4个仁用杏品种也较困难(王玉柱等，2006)。
发明内容
本发明为了解决上述问题而提供了一种利用特异SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法，该方法所利用的SSR分子标记鉴别能力强且数量合适，能够覆盖主要仁用杏种质资源的遗传多样性。
本发明提供了一种利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法，包括如下步骤：利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测后进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，所用的分子标记选自如下SSR标记：UDP98-409、UDP98-406、UDP97-401、pchgms12、MA039a、MA020a、BPPCT002、BPPCT007和BPPCT008，UDP98-409的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，UDP98-406的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，UDP97-401的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，pchgms12的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，MA039a的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，MA020a的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示，BPPCT002的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示，BPPCT007的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示，BPPCT008的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示。
所用的分子标记可以优选自所述SSR分子标记中的MA039a、UDP98-409、MA020a、pchgms12和BPPCT007。
所用的分子标记例如为所述SSR分子标记中的MA039a。
所述分子标记MA039a还与第二分子标记组合，所述第二分子标记为pchgms12、MA020a、BPPCT002、UD97-401和UD98-406。
在上述技术方案的基础上，PCR扩增采用2条引物来进行，第一引物为所述SSR分子标记的正向引物和M13序列相连组成带M13尾的引物；第二引物为所述SSR分子标记的反向引物；M13尾的序列如SEQ ID NO：19所示。
本发明还提供了一种鉴定仁用杏种质的SSR分子标记检测试剂盒，所述仁用杏SSR分子标记为所述所用的分子标记。
本发明还提供了一种仁用杏遗传资源多样性的分析方法，为分子标记扩增分析法，其利用上述仁用杏SSR分子标记的扩增引物进行扩增分析。
优选地，所述PCR扩增利用SSR荧光标记，扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测。
优选地，PCR扩增采用2条引物来进行，第一引物为SSR分子标记的正向引物和M13序列相连组成带M13尾的引物；第二引物为SSR分子标记的反向引物；M13尾的序列如SEQ IDNO:19所示。
本发明从来自桃基因组DNA的17对SSR引物中筛选出多态性高、重复性好且条带清晰9对SSR引物，对我国16个仁用杏主栽品种建立指纹图谱，并利用该技术对仁用杏品种鉴定、多样性评价和亲缘关系分析等奠定基础，为仁用杏品种进行改良及合理利用提供技术和理论依据，特别是使用单独一个引物MA039a就能鉴别80D05、白玉扁、薄香甜、迟梆子、丰仁、龙王帽、围选一号、新四号、一窝蜂、优一和油仁共11个品种。此外，本发明采用毛细管电泳法检测荧光SSR引物扩增PCR产物，比传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法，简单准确、无毒害，通量高。
附图说明
图1为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记UDP98-409的16个仁用杏品种指纹图谱；
图2为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记MA020a的16个仁用杏品种指纹图谱；
图3为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记pchgms12的16个仁用杏品种指纹图谱；
图4为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记BPPCT002的16个仁用杏品种指纹图谱；
图5为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记MA039a的16个仁用杏品种指纹图谱；
图6为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记BPPCT007的16个仁用杏品种指纹图谱；
图7为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记BPPCT008的16个仁用杏品种指纹图谱；
图8为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记UD97-401的16个仁用杏品种指纹图谱；
图9为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中SSR标记UD98-406的16个仁用杏品种指纹图谱；
图10为本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中16个仁用杏品种的SSR扩增谱带的UPGMA聚类图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法的技术方案。
第一实施例、仁用杏材料的获得及其DNA的提取
1、获得仁用杏材料
2013年6月-7月期间从中国林业科学研究院经济林研发中心杏基因库采集了16份仁用杏样品，选取无病虫害，新鲜当年生的嫩叶，保存于-80℃低温冷藏冰箱备用。采集的该16份仁用杏样品为我国主要栽培的仁用杏品种，具体信息如表1所示。
表1、16个仁用杏品种的具体信息
Figure BDA0000964363770000031
Figure BDA0000964363770000041
2、基因组DNA的提取及浓度测定
采用改良的CTAB法(冯晨静和张元慧，2005)提取上述16份杏品种基因组DNA，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并用紫外分光光度计检测含量及纯度后，将DNA样品浓度调至50ng·μL-1，保存于-80℃度超低温冰箱备用。
第二实施例、SSR引物筛选和PCR扩增
1、获得供试筛选的SSR引物
选取17对来自桃基因组DNA的SSR引物供试筛选，最终筛选多态性高、条带清晰并重复性好的9对开发自桃基因组DNA的SSR引物，具体信息如表2所示。
表2、9对供试筛选的SSR引物信息
Figure BDA0000964363770000042
2、PCR扩增
利用SSR荧光标记检测技术TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailedprimer M13)(Markus S.et al.，2000)毛细管电泳荧光检测法对16个仁用杏不同品种进行研究。SSR正向引物和携带荧光标记FAM、NED、VIC或PET等的M13序列(如SEQ ID NO:19所示)相连组成带M13尾的荧光正向引物(例如：某正向引物序列为5′-CGGACTCTTATCCTCTATCAACA-3′，则该引物的正向引物为5′-TGTAAAACGACGGCCAGTCGGACTCTTATCCTCTATCAACA-3′)；PCR扩增反应体系为20ul的混合体系，具体如表3所示。
表3 PCR反应体系
Figure BDA0000964363770000051
PCR反应条件为：
Figure BDA0000964363770000052
利用ABI Prism 3130遗传分析仪检测PCR产物，GeneMapper 4.0软件分析扩增片段大小。
3、荧光毛细管电泳检测及数据分析
根据SSR引物扩增目标条带大小和重复单元，整理SSR荧光毛细管电泳原始数据，并利用DataFormater 2.7.2软件(任民，2015)和Excel Microsatellite Toolkit软件(Park SDE et al.，2001)将数据格式转化成后期数据分析软件运行格式，应用Popgene32(黄海燕,2013)软件检测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)；多态性信息含量(PIC)通过公式PIC＝1-∑fij 2计算(fij为第i个等位基因的频率)。聚类图的绘制用NTSYS pc version2.10e软件根据Nei’s遗传相似系数，采用UPGMA法完成。
第三实施例、遗传多样性分析
根据17对SSR引物对16个仁用杏品种的荧光PCR扩增结果，最终筛选条带分辨率高，结果准确可靠并且多态性高的9对引物，对16个主要栽培仁用杏进行分析，9个SSR位点遗传多样性分析结果如表4所示，不同位点的扩增片段在样品中具有较高的多态性；9个SSR位点共检测到68个等位基因(Na)，38.52个有效等位基因(Ne)，其中位点MA039a检测到的等位基因和有效等位基因最多，分别为10和5.33个，平均每位点7.6个；位点UDP97-401检测到的等位基因和有效等位基因最少，分别为6和2.75个，平均每位点4.28个；期望杂合度在0.66～0.89之间，平均为0.78；观察杂合度在0.44～0.94之间，平均为0.74；多态信息含量(PIC)值在0.64～0.81之间，均值为0.76，其中位点MA039a的值最高为0.81，而位点UDP97-401的值最低为0.64，表明所选引物均为高度多态性信息引物(PIC＞0.5)，故所选引物较适于对供试品种进行遗传多样性分析及指纹标记。
表4、9个SSR位点的遗传多样性
Figure BDA0000964363770000061
第四实施例、SSR指纹图谱的构建
基于9个SSR位点对16个仁用杏品种荧光PCR产物峰图值，构建每个位点对16个仁用杏品种DNA指纹图谱，如图1-9所示(图1-9中编号1-16对应的仁用杏品种见表1)，结果表明9个SSR位点的每对引物均不能单独将所有供试品种完全区分开，只能将16个仁用杏品种区分为5-13组；其中鉴别能力最强的为MA039a引物，将供试品种分为13组，引物UDP98-409和MA020a次之，分别为11组，而引物UDP97-401鉴别能力最弱，分为5组，引物pchgms12、BPPCT007、BPPCT008和BPPCT002可将16个供试品种分别分为8、8、7和6组；单独使用引物MA039a能鉴别80D05、白玉扁、薄香甜、迟梆子、丰仁、龙王帽、围选一号、新四号、一窝蜂、优一和油仁共11个品种；引物MA020a能鉴别80A03、80D05、白玉扁、迟梆子、三杆旗、新四号和油仁共7个品种；引物UD98-409能鉴别80A03、80B05、白玉扁、三杆旗、优一和油仁共6个品种。
9个SSR位点对16个仁用杏主栽品种扩增的具体条带大小如表5所示(表5中编号1-16对应的仁用杏品种见表1)，所扩增条带大小范围在80-500bp之间，其中引物MA039a的鉴别能力最强(88％)，由引物MA039a和pchgms12组合、MA039a和MA020a组合、MA039a和BPPCT002组合、MA039a和UD97-401组合、MA039a和UD98-406组合均能将16个供试仁用杏主栽品种鉴别开。
表5、16个仁用杏品种各SSR位点条带大小
Figure BDA0000964363770000071
第五实施例、基于SSR标记的聚类分析
基于9个SSR位点对16个仁用杏品种荧光PCR产物峰图值和遗传多样性分析，计算Nei’s相似性系数，采用UPGMA法进行聚类分析得到16个仁用杏品种的系统关系树，如图10所示，品种间相似性系数在0.53-0.99之间，平均值为0.71，基于相似系数大小，品种国仁和丰仁亲缘关系最近，而品种围选一号和80D05亲缘关系最远；由此得知，仁用杏资源遗传背景狭窄、变异幅度较小。
利用UPGMA法进行聚类分析，在相似性系数为0.70处，可将16个仁用杏品种分成4大组，聚类分析结果和品种来源基本一致。第一组包括11个品种，其中，国仁、丰仁和油仁等一窝蜂选育的优系品种和一窝蜂最先聚在一起；其次，与三杆旗、新四号、80B05、迟梆子、80A03和优一等大多是扁杏园实生选出品种依次聚在一起。第二组包括龙王帽、龙王帽优株系超仁及白玉扁等三个品种。第三组包括张家口农科院提供的薄香甜品种。第四组包括山杏的甜仁类型中选育Ⅰ最新选育出来的新品种围选1号。由此可知，不同系列品种间基因交流少，此结果将为仁用杏杂交育种过程中杂交亲本组合的选配、仁用杏起源和演化以及建立仁用杏核心种质资源提供技术和理论支持。
Figure IDA0000964363860000011
Figure IDA0000964363860000021
Figure IDA0000964363860000031
Figure IDA0000964363860000041

Claims (4)

1.一种利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测后进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，所用的分子标记为MA039a，可鉴别80D05、白玉扁、薄香甜、迟梆子、丰仁、龙王帽、围选一号、新四号、一窝蜂、优一和油仁共11个仁用杏品种；MA039a的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
2.一种利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测后进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，所用的分子标记为MA039a与第二分子标记的组合，所述第二分子标记为pchgms12、MA020a、BPPCT002、UD97-401和UD98-406中的一个或多个；可鉴别80A03、80B05、80D05、白玉扁、薄香甜、超仁、国仁、迟梆子、丰仁、龙王帽、三杆旗、围选一号、新四号、一窝蜂、优一和油仁共16个仁用杏品种；
UDP98-406的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，
UDP97-401的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，
pchgms12的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，
MA039a的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，
MA020a的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示，
BPPCT002的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，PCR 扩增采用2条引物来进行，第一引物为所述SSR分子标记的正向引物和M13序列相连组成带M13尾的引物；第二引物为所述SSR分子标记的反向引物；M13尾的序列如SEQ ID NO：19所示。
4.一种仁用杏遗传资源多样性的分析方法，为分子标记扩增分析法，其特征在于，利用权利要求1-2任一所述的利用SSR分子标记进行仁用杏种质鉴定的方法中的仁用杏SSR分子标记的扩增引物进行扩增分析；
所述PCR扩增利用SSR荧光标记，扩增结果利用毛细管电泳检测技术检测；
PCR 扩增采用2条引物来进行，第一引物为SSR分子标记的正向引物和M13序列相连组成带M13尾的引物；第二引物为SSR分子标记的反向引物；M13尾的序列如SEQ ID NO：19所示。
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杏种质资源亲缘关系及分类地位的ISSR和SSR分子标记研究;马丹慧;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20080215;第22-24页表5 *

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