CN107142330B - 利用核its序列进行榛种质鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，包括一对榛ITS序列的扩增引物：正向引物：5'‑AGTCGTAACAAGGTTTCCGT‑3'；反向引物：5'‑TCCTCCGCTTATTTATATGC‑3'；利用正向引物和反向引物对标准种质进行PCR扩增；利用正向引物和反向引物对待鉴定的目标种质进行PCR扩增；将以上两个步骤得到的扩增序列进行比对，根据比对结果是否一致进行榛种质鉴定。该方法利用的ITS序列标记鉴别能力强且重复性好，能够有效的鉴别易混淆榛种质资源或其他属植物，对榛属植物资源的种间分类、亲缘关系分析及遗传进化分析提供了重要的技术支撑，同时对开展榛属植物野生资源调查选优及杂交育种具有重大的意义。

Description

利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种榛种质鉴定的方法，尤其涉及一种利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法。
背景技术
榛为榛科(Corylaceae)榛属(Corylus)植物，在这些榛种中既包含有乔木类型也涵盖灌木类型(张宇和等，2005)。世界榛属植物约有20个种，广泛地分布在北半球的亚洲、欧洲、北美洲的温带地区。我国榛属植物资源丰富，我国天然分布的有8个种和2个变种，分布范围也很广泛，经济利用价值较高。
20世纪50年代以来，我国榛属植物的分类仍是完全依据形态特征进行划分，不同分类学家由于基于的形态尺度和依据的标准不同，因而分类结果不尽相同。尤其对于我国榛属植物种与变种的划分，分类学家们存在很多分歧。胡先啸(1948)在撰写的《中国树木图志》中首次提出中国榛属植物应属于榛科(Corylaceae)榛属(Corylus)，其中包括6个种2个变种。陈嵘(1975)在《中国树木分类学》中认为中国榛属植物应划分成3个种和3个变种。俞德浚(1979)在《中国果树分类学》中将中国榛属植物划分成4个种2个变种。《中国植物志》(1979版)将我国榛属植物划分了7个种2个变种，并首次提及1个存疑种。郑万钧(1985)在《中国树木志》中介绍中国榛属植物包含7个种和3个变种。梁维坚(1988，2005)认为川榛应是一个独立的种，并认定了具有典型短柄特征的川榛变种短柄川榛。由此可见，植物分类学家对我国榛属植物的分类存在很多争议，对榛属植物资源种类记载不一，分类地位不明确，这对我国榛属植物资源的收集、保存及利用造成一定的影响，进而影响榛属植物杂交育种工作的开展。
高等植物的rDNA是由核糖体基因(转录单位)及与之相邻的间隔区组成的高度重复串联序列，真核生物核糖体内转录间隔区ITS既有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，丰富的变异可在较低的分类阶元上(如种间)解决植物分类鉴别问题。ITS序列分析通过比较DNA分子中4种碱基序列排列的变化，反映生物体在遗传上的变异，从分子水平理清其遗传背景(Yang et al.,2007)，克服了传统研究方法的弱点，提高了植物种质资源鉴别的水平。至今未发现关于利用ITS序列进行我国榛属植物资源不同种间的系统发育和亲缘关系研究的报道。
现有技术一：
形态学标记是以植物的表型性状为遗传标记，目前的榛属植物分类主要依靠形态学的研究，依赖于表型的差异。从遗传角度看，表型性状分为数量性状和质量性状两类。但是表型性状受环境、气候、营养状况等多种因素影响，往往提供的信息不够全面，且依据形态进行鉴别分类工作量大、周期长、成本高。例如：川榛和平榛两者在树形、叶片、花序及果实形态上非常相似，不易区分，尤其是在两者交叉分布地带经常混淆，给科研调查和生产利用带来了很大困扰。又如，虎榛子属的虎榛子和榛属的毛榛在表型上也非常相近，不易区分。
现有技术二：
随着分子标记的快速发展，像RFLP标记(Restriction fragment lengthpolymorphism)，随机扩增多态性RAPD(Random amplification polymorphism DNA)、简单重复序列SSR(Simple sequence repeats)、扩增片段长度多态性AFLP(amplifiedfragment length polymorphism)、序列标签位点STS(sequence-tagged site)等，用于木本植物的分类鉴别中。但这些分子标记方法都有一定的缺陷，如RFLP标记操作繁琐，技术要求高，价格也较高。RAPD标记分析的结果并不是非常准确。SNP标记信息位点有限，成本昂贵等。上述标记大多是基于无全基因组序列信息的技术开发出来，有一定的应用价值，但随机性强、稳定性较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，包括一对榛ITS序列的扩增引物：
正向引物：5'-AGTCGTAACAAGGTTTCCGT-3'；
反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3'；
通过上述一对榛ITS序列的扩增引物进行榛种质鉴定的方法，包括如下步骤：
利用正向引物和反向引物对标准种质进行PCR扩增；
利用正向引物和反向引物对待鉴定的目标种质进行PCR扩增；
将以上两个步骤得到的扩增序列进行比对，根据比对结果是否一致进行榛种质鉴定；
在利用上述正向引物和反向引物进行PCR扩增步骤前，还需要提取标准种质和目标种质的全基因组DNA。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的利用ITS序列进行榛种质鉴定的方法，该方法利用的ITS序列标记鉴别能力强且重复性好，能够有效的鉴别易混淆榛种质资源或其他属植物，对我国榛属植物资源的种间分类、亲缘关系分析及遗传进化分析提供了重要的技术支撑，同时对我国开展榛属植物野生资源调查选优及杂交育种具有重大的意义。
附图说明
图1为本发明实施例中不同榛种的ITS序列差异图。
图2为本发明实施例中不同榛属植物的聚类图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明的利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，其较佳的具体实施方式是：
包括一对榛ITS序列的扩增引物：
正向引物：5'-AGTCGTAACAAGGTTTCCGT-3'；
反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3'；
通过上述一对榛ITS序列的扩增引物进行榛种质鉴定的方法，包括如下步骤：
利用正向引物和反向引物对标准种质进行PCR扩增；
利用正向引物和反向引物对待鉴定的目标种质进行PCR扩增；
将以上两个步骤得到的扩增序列进行比对，根据比对结果是否一致进行榛种质鉴定。
在利用上述正向引物和反向引物进行PCR扩增步骤前，还需要提取标准种质和目标种质的全基因组DNA。
所述提取标准种质和待检测种质的全基因组DNA包括如下步骤：
步骤1、在65℃水浴锅中预热2％CTAB提取液和2％β-疏基乙醇；
步骤2、取0.2克叶片，加入液氮充分研磨，然后迅速转移至2mL离心管中，加入预热的CTAB提取液1ml，65℃水浴60min，每隔10min轻轻颠倒混匀；
步骤3、水浴结束后，取出离心管冷却至室温；13000rpm条件下离心5min，取上清液800μL转入新离心管；
步骤4、加入800μL V:V＝24∶1的氯仿/异戊醇，充分混匀，13000rpm离心5min，取上清液转入2mL新离心管；
步骤5、重复步骤4，加入等体积V:V＝24∶1的氯仿/异戊醇，充分混匀，13000rpm离心5min，取上清液转入2mL新离心管；
步骤6、加入上清液2/3体积的异丙醇和1/10体积的3M NaAc,轻轻颠倒混匀，静置15min至产生絮状沉淀；
步骤7、12000rpm条件下离心6min后弃上清液，将底部白色DNA沉淀小心取出，转入1.5mL新的离心管中，用1000μL 70％的乙醇洗涤两次，每次13000rpm离心6min，弃乙醇，超净工作台风干残留的酒精；
步骤8、提取产物用100μL TE缓冲液溶解，取2～3μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其余放置于-20℃保存备用。
所述PCR扩增反应体系如下：
Figure GDA0002418120940000041
所述PCR扩增程序为：
(1)94℃预变性4min；
(2)94℃ 30s，60℃30s，72℃ 2min，10个循环；
(3)94℃ 30s，50℃30s，72℃ 2min，26个循环；
(4)72℃延伸10min；
(5)4℃保存。
本发明的利用ITS序列进行榛种质鉴定的方法，该方法利用的ITS序列标记鉴别能力强且重复性好，能够有效的鉴别易混淆榛种质资源或其他属植物，对我国榛属植物资源的种间分类、亲缘关系分析及遗传进化分析提供了重要的技术支撑，同时对我国开展榛属植物野生资源调查选优及杂交育种具有重大的意义。
本发明可作为榛遗传资源多样性的分析方法，为ITS序列PCR扩增分析法，利用所述榛ITS序列的扩增引物进行扩增分析。
本发明通过设计兼并引物对榛属植物进行ITS序列的扩增，扩增得到序列后通过比对分析，以确定得到的序列为ITS序列，然后设计引物以我国榛属植物不同种为材料进行PCR扩增，纯化和测序，筛选得到1对(IRF ID NO:1和IRF ID NO:2)可用于鉴别不同榛种植物的特异引物，所述特异引物可以有效鉴别混淆未知材料为榛种或其他属植物。该方法具有操作简单、重复性好、高效的特点，对我国榛属植物资源的种间分类、亲缘关系分析及遗传进化分析提供了重要的技术支撑，同时对我国开展榛属植物野生资源调查选优及杂交育种具有重大的意义。
具体实施中，可以利用本发明获得的ITS序列设计不同于本发明IRF ID NO:1或IRF ID NO:2的引物或兼并引物，或利用相关ITS序列设计引物，进行榛属植物不同种的扩增以获得ITS序列进行鉴别分析；也可以以不同榛种为材料，筛选得到的1对(IRF ID NO:1和IRF ID NO:2)可用于鉴别不同榛种植物的特异引物序列；扩增得到的不同榛种的ITS差异序列；利用上述引物扩增得到序列进行不同榛种分类鉴定的方法。均是在本申请的启示下实现的。
具体实施例：
第一实施例、榛属植物材料的获得。
根据实际调查从我国不同地域采集14份榛属植物材料，14份标准种质材料信息如表1所示。从陕西太白县采集1份待鉴别榛属植物材料A。陕西秦岭山脉位于川榛和平榛的交叉分布区域，根据文献记载平榛和川榛在这一区域都有分布，依据传统形态学无法准确的鉴别待鉴别材料为何种榛属植物。另外，还有1份材料采自内蒙赤峰，其形态与毛榛以及虎榛相似，为待鉴别材料B。
表1 14个榛属植物材料的具体信息
Figure GDA0002418120940000061
第二实施例、榛属植物材料基因组DNA的提取
采用优化后的CTAB法从上述16份材料样品中提取全基因组DNA，具体方法如下：
步骤201、在65℃水浴锅中预热2％CTAB提取液和2％β-疏基乙醇；
步骤202、取0.2克叶片，加入液氮充分研磨，然后迅速转移至2mL离心管中，加入预热的CTAB提取液1ml，65℃水浴60min，每隔10min轻轻颠倒混匀；
步骤203、水浴结束后，取出离心管冷却至室温；13000rpm条件下离心5min，取上清液800μL转入新离心管；
步骤204、加入800μL氯仿/异戊醇(V:V＝24∶1)，充分混匀，13000rpm离心5min，取上清液转入2mL新离心管；
步骤205、重复步骤204，加入等体积氯仿/异戊醇(V:V＝24∶1)，充分混匀，13000rpm离心5min，取上清液转入2mL新离心管；
步骤206、加入上清液2/3体积的异丙醇和1/10体积的3M NaAc,轻轻颠倒混匀，静置15min至产生絮状沉淀；
步骤207、12000rpm条件下离心6min后弃上清液，将底部白色DNA沉淀小心取出，转入1.5mL新的离心管中，用1000μL 70％的乙醇洗涤两次，每次13000rpm离心6min，弃乙醇，超净工作台风干残留的酒精；
步骤208、提取产物用100μL TE缓冲液溶解，取2～3μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其余放置于-20℃保存备用。
第三实施例、引物的筛选
1、获得目的基因片段
以具有代表性的标准种质平榛材料DNA为模板，参考White等(1990)的ITS序列设计兼并引物，进行PCR扩增，产物纯化，测序后得到一个大于600bp的目的基因片段。
2、筛选引物
根据上述目的基因片段设计引物，以14份榛属植物标准种质DNA为模板，按照下述体系(如表2所示)和程序(如表3所示)进行PCR扩增：
表2、PCR反应体系
Figure GDA0002418120940000071
表3、PCR扩增程序
Figure GDA0002418120940000072
上述方法获得的PCR产物通过用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶含有Gelred染料。利用凝胶成像系统观察记录电泳条带。利用胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化PCR产物，然后在ABI 3730xl测序仪上进行双向测序。
通过上述PCR扩增和测序，最终筛选出1对可用于鉴别我国不同榛种资源的特异性引物。引物信息如下：
正向引物：5'-AGTCGTAACAAGGTTTCCGT-3'，如IRF ID NO:1所示；
反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3'，如IRF ID NO:2所示。
第四实施例、系统发育树的构建
利用第三实施例中所述方法和筛选得到的引物对14份榛属植物材料和2份待检测植物材料(A和B)进行PCR扩增、产物纯化及测序。
对14份榛属植物材料和2份待检测植物材料(A和B)的测序序列使用Contig-Express(version 9.1)校对后，使用Clustal X(version 2.11)进行多序列比对。随后利用MEGA(version 5.0)软件的最大似然法(Maximum Likelihood)建立最似然树。
图1结果表明：不同榛种的序列差异明显，通过序列差异可以清楚的分辨不同种材料。并且不同地域的相同种榛子材料在序列上无差异，如3个不同地域的毛榛材料序列无差异，2个不同地域的平榛材料序列无差异。待检测材料A与川榛序列一致无差异。本方法高效、准确、稳定性高。
图2结果表明：待检测材料A与榛属植物的川榛和短柄川榛聚到一起，待检测材料B与所有榛属植物距离较远，包括形态相似的毛榛。
经上述方法鉴定，待检测材料A与川榛(编号9)序列一致，鉴定其为榛属植物的川榛材料，待检测材料B与毛榛及其他榛属植物种质相距较远，鉴别其为虎榛子属材料。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，其特征在于，包括一对榛ITS序列的扩增引物：
正向引物：5'-AGTCGTAACAAGGTTTCCGT-3'；
反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTTATATGC-3'；
通过上述一对榛ITS序列的扩增引物进行榛种质鉴定的方法，包括如下步骤：
利用正向引物和反向引物对标准种质进行PCR扩增；
利用正向引物和反向引物对待鉴定的目标种质进行PCR扩增；
将以上两个步骤得到的扩增序列进行比对，根据比对结果是否一致进行榛种质鉴定；
在利用上述正向引物和反向引物进行PCR扩增步骤前，还需要提取标准种质和目标种质的全基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，其特征在于，所述提取标准种质和待检测种质的全基因组DNA包括如下步骤：
步骤1、在65℃水浴锅中预热2％CTAB提取液和2％β-疏基乙醇；
步骤2、取0.2克叶片，加入液氮充分研磨，然后迅速转移至2mL离心管中，加入预热的CTAB提取液1ml，65℃水浴60min，每隔10min轻轻颠倒混匀；
步骤3、水浴结束后，取出离心管冷却至室温；13000rpm条件下离心5min，取上清液800μL转入新离心管；
步骤4、加入800μL V:V＝24∶1的氯仿/异戊醇，充分混匀，13000rpm离心5min，取上清液转入2mL新离心管；
步骤5、重复步骤4，加入等体积V:V＝24∶1的氯仿/异戊醇，充分混匀，13000rpm离心5min，取上清液转入2mL新离心管；
步骤6、加入上清液2/3体积的异丙醇和1/10体积的3M NaAc,轻轻颠倒混匀，静置15min至产生絮状沉淀；
步骤7、12000rpm条件下离心6min后弃上清液，将底部白色DNA沉淀小心取出，转入1.5mL新的离心管中，用1000μL 70％的乙醇洗涤两次，每次13000rpm离心6min，弃乙醇，超净工作台风干残留的酒精；
步骤8、提取产物用100μL TE缓冲液溶解，取2～3μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其余放置于-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系如下：
Figure FDA0002418120930000021
4.根据权利要求3所述的利用核ITS序列进行榛种质鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：
(1)94℃预变性4min；
(2)94℃30s，60℃30s，72℃2min，10个循环；
(3)94℃30s，50℃30s，72℃2min，26个循环；
(4)72℃延伸10min；
(5)4℃保存。
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