CN106498075B - 猕猴桃InDel分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明公开了一种猕猴桃InDel分子标记及其筛选方法和应用。该发明以两类抗寒性不同的软枣猕猴桃基因组DNA为研究对象，进行四个品种基因组重测序，依据重测序数据，设计InDel引物，经过PCR扩增、琼脂糖电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在软枣猕猴桃中进行多态性检测，筛选出14对InDel引物，这14对引物可应用于中华猕猴桃、美味猕猴桃等的遗传多样性分析，也可应用于杂交子代真实性鉴定、遗传图谱构建以及分子辅助育种等研究。本发明实施例的猕猴桃InDel引物变异稳定、检测容易，InDel插入/缺失片段较大，可通过琼脂糖进行分析，可简化步骤。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种猕猴桃InDel分子标记及其筛选方法和应用。
背景技术
猕猴桃隶属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl)，为多年生雌雄异株植物。猕猴桃以其独特的风味，富含维生素C、饮食纤维和多种矿物营养，以及具有清肠健胃等功效而受到人们的广泛关注，现已成为重要的水果种类之一。
猕猴桃自然界种间杂交现象明显，染色体倍性复杂，采用常规的方法进行遗传学研究效率不高，DNA分子标记的发展为猕猴桃研究提供了有效的途径(黄宏文，2009；董晓莉等，2005)。
分子标记技术如RAPD、AFLP、SSR等已应用于猕猴桃种质资源遗传多样性评价、遗传图谱构建、雌雄性别鉴定以及猕猴桃相关性状定位等(刘亚令等，2006；汤佳乐等，2014；Testolin et al.,2001；Fraser et al.,2009)。但是已开发的标记数量有限，有些标记具有群体局限性，如在某一群体中开发的雌雄相关标记在其他群体中并不适用；覃瑞(2013)的研究数据表明中华猕猴桃SSR引物在软枣猕猴桃中的通用性为23％。由于受猕猴桃倍性的影响，目前建立的遗传连锁图谱都是基于二倍体建立的(Davide et al.,2015)，这也局限了多倍性猕猴桃中重要品质以及抗性性状等的定位，因此，还需要进一步的进行猕猴桃分子标记开发。
随着高通量测序技术的发展，基于全基因组重测序的插入/缺失多态性标记(Insertion/deletion,InDel)越来越受到关注，InDel标记具有在基因组内分布广泛、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点(et al.,2008)，Lv等(2013)通过全基因组序列比对分析开发洋白菜InDel标记，定位到洋白菜抗枯萎病基因FOC；王林友(2014)利用InDel标记鉴定杂交水稻属性和并进行杂种优势预测，目前在黄瓜、甘蓝、玉米、小麦中也已有应用(李斯更等，2013；liu et al.,2013)。基于高通量测序数据开发的InDel标记，可为猕猴桃重要抗性性状以及经济性状定位、遗传多样性分析、分子标记辅助育种奠定基础。
发明内容
(一)技术问题
本发明实施例的目的在于开发猕猴桃InDel分子标记，提供多态性引物，建立猕猴桃InDel标记开发的技术体系，为猕猴桃遗传多样性分析提供更多的InDel标记，弥补目前猕猴桃InDel标记缺乏的不足。
(二)技术方案
根据本发明的一方面，本发明旨在提供一种猕猴桃InDel分子标记，包括如下表所示的14个位点所对应的正向和反向引物。
根据本发明的另一方面，本发明旨在提供一种上述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
1、提取杂交母本‘永丰一号’，父本‘11-19雄’的DNA，提取杂交母本‘RB-3’，父本‘魁绿雄’的DNA；
2、基于提取的抗寒杂交群体DNA，构建DNA文库，利用Illumina Hiseq4000平台进行重测序；对测序得到的原始双端序列(reads)进行质量评估并过滤得到净双端序列(Clean Reads)，将净双端序列与参考基因组序列进行比对，基于比对结果进行InDel位点注释挖掘，设置InDel标记引物；例如，利用R语言结合Primer3.0设置InDel标记引物；
3、利用InDel引物对四个软枣猕猴桃基因组DNA进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳和非变性聚丙稀酰胺凝胶检测，筛选多态性InDel标记引物。
根据本发明又一方面，本发明利用14对InDel引物在中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃等11个品种中进行遗传多样性分析。
根据本发明其他方面，本发明利用筛选的1对InDel引物在母本‘永丰一号’，父本‘11-19雄’杂交F1代中进行子代真实性鉴定。
(三)有益效果
本发明实施例提供的猕猴桃InDel引物变异稳定、检测容易，InDel插入/缺失片段较大，可通过琼脂糖进行分析，可简化步骤，能够用于猕猴桃遗传多样性分析、猕猴桃子代真实性鉴定、辅助分子育种，有利于准确鉴定猕猴桃品种，加快猕猴桃育种进程。
附图说明
图1为第1-9对InDel引物在四个软枣猕猴桃中的聚丙烯酰胺电泳图；
图2为第10-14对InDel引物在四个软枣猕猴桃中的聚丙烯酰胺电泳图；
图3为InDel-18在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图4为InDel-15在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为InDel-52在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图6为InDel-93在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图7为InDel-100在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8为InDel-27在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图9为InDel-44在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图10为InDel-23在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图11为InDel-12在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图12为InDel-13在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图13为InDel-8在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图14为InDel-39在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图15位InDel-3在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图16位InDel-55在11个品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图17为利用InDel-44进行‘永丰一号’ב11-19雄’杂交F1代真实性鉴定时的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，均为常规方法。
下面根据具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
本发明使用所有试验材料如表1所示。
表1供试猕猴桃材料
其中‘永丰一号’采自辽宁省大连市步云山乡，其余均采自中国农科院郑州果树研究所猕猴桃资源圃。
实施例1
本发明实施例的猕猴桃InDel分子标记筛选方法包括：DNA提取、InDel标记的挖掘和引物设计、PCR扩增及电泳检测、多态性分析。
各个步骤的具体描述如下：
(1)DNA提取
对于对软枣猕猴桃‘RB-3’、‘魁绿雄’、‘永丰一号’、‘11-19雄’，采幼嫩叶片后，将幼嫩叶片用冰袋保存，采用磁珠法提取叶片DNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，将DNA浓度调至20ng/μl备用。
其中，所用DNA提取试剂盒可购自河南惠尔纳米科技有限公司。
(2)InDel位点挖掘及引物设计
采用illumina HiSeq4000测序平台对软枣猕猴桃‘RB-3’、‘魁绿雄’、‘永丰一号’、‘11-19雄’进行全基因组重测序。对测序得到的原始双端序列(reads)进行质量评估并过滤；去除带接头(adapter)的reads；若一条reads上N(未能确定出具体的碱基类型)的比例大于10％，则过滤掉该双端序列(Pair-end reads)，去除低质量reads，保证每条reads质量值低于10的碱基不超过50％，保证数据Q30在80％或85％以上，得到净双端序列(CleanReads)。
使用bwa软件将Clean Reads与参考基因组‘红阳’猕猴桃进行比对。InDel检测可使用GATK软件工具包。根据预测的InDel位点，两两进行比较，在猕猴桃29条染色体上，每条染色体上随机选择位点设计引物，同时没有比对到染色体上的序列中的InDel也随机选择4个位点设计引物。
选取的InDel位点均为50bp左右的大片段插入/或者缺失的位点，采用primer3软件，在插入/缺失位点的上下游设计引物。引物可由上海生工生物科技有限公司合成。共设计120对引物进行验证。
(3)PCR扩增及电泳
PCR反应体系为10μl，采用2×Es Taq MasterMix高保真酶扩增(北京康为世纪科技有限公司)，扩增体系为：PCR mix 5μl；引物0.5μl；DNA 0.5μl；ddH2O 3.5μl。反应程序为：在94℃下扩增120s，在94℃下扩增30s，在60℃下扩增30s，在72℃下扩增60s，共进行34个循环。然后，在72℃下扩增10min，反应完成后保持4℃待用。
利用浓度为6％的丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳检测的电压80V，电泳时间为2h，而后，银染显色后照相保存，读带型分析。
(4)多态性分析
在120对引物中共筛选出14对在四个软枣猕猴桃品种中具有InDel标记多态性的引物，以便用于后续的实验分析。
如图1所示，第一道电泳为DL500 marker,2-5道为InDel-55,6-9道为InDel-27,10-13道为InDel-18，14-17道为InDel-52，18-21道为InDel-100，22-25道为InDel-93，26-29道为InDel-3，30-33道为InDel-44，34-37道为InDel-15。其中，每相邻四道电泳的模板点样顺序均为‘RB-3’，‘魁绿雄’，‘永丰一号’，‘11-19雄’。
如图2所示，第一道电泳为DL500 marker,2-5道为InDel-8,6-9道为InDel-39,10-13道为InDel-23，14-17道为InDel-12，18-21道为InDel-100，22-25道为InDel-13，每相邻四道电泳的模板点样顺序均为‘RB-3’，‘魁绿雄’，‘永丰一号’，‘11-19雄’。
实施例2
一种实施例1所筛选的InDel分子标记在猕猴桃遗传多样性分析中的应用，其应用步骤如下：
所用材料包括‘RB-3’、‘魁绿雄’、‘RB-4’、‘11-19雄’、‘LD134’、’11-19’、‘博山碧玉’、‘红阳’、‘Hot16-A’、‘徐香’、‘海沃德’。
提取上述材料DNA后，应用筛选的14对InDel引物在这11个品种进行PCR，采用聚丙烯酰胺电泳检测，银染染色后照相，进行带型分析，分析结果如图3-14所示。图3-14中，从左到右依次为：1:‘RB-3’,2:‘魁绿雄’,3:‘徐香’,4:‘RB-4’,5:‘11-19雄’,6:‘Hort16A’,7:‘LD134’,8:‘11-19’,9:‘博山碧玉’,10:‘红阳’,11:‘海沃德’。
根据每对引物对11个样本扩增获得的条带位置确定基因型，有带记为1，无带记为0，形成一个0、1矩阵。利用popgene软件计算等位基因数，Shannon′s多样性信息指数I(Shannon′s information index)和基因多样性指数H(Nei′s gene diversity)，如表2所示。
表2根据本发明实施例的猕猴桃InDel标记信息
以11份猕猴桃种质资源基因组DNA为模板，在64对引物中随机挑选14对引物，用PCR方法检测引物有效性。这14对引物均能扩增出特异的目的条带，均为共显性标记，其中存在2个多态性位点的引物7对，3个多态性位点的引物5对，4个多态性位点的引物3对。14对引物在11份种质资源中共扩增出43个多态1性位点，平均每个引物2.87个位点。
根据本发明的示例性实施例，基于两个软枣猕猴桃重测序数据设计的InDel引物在中华猕猴桃和美味猕猴桃中同样适用。
实施例3
一种实施例1所筛选的InDel鉴定子代真实性中的应用，其应用步骤如下：
提取‘永丰一号’和‘11-17’22个子代DNA，根据实施例1的多态性统计结果，选用InDel-44引物进行子代真实性鉴定。
如图3所示，其中第一电泳道为DL2000 marker，第二电泳道为母本，第三电泳道为父本，应用此引物可将没有父本带型的子代排除。
根据本发明的示例性实施例，本发明所述的猕猴桃InDel分子标记的开发方法应用于包括中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃等在内的猕猴桃属植物的InDel分子标记的开发。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 猕猴桃InDel分子标记及其筛选方法和应用
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-55F）
<400> 1
GAGTTATTGCTGGAGAGTGAATTTG 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-55R）
<400> 2
CTCTTCCTCTCTACTTTCGTGAGTG 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-27F）
<400> 3
GCTTGAAATGTTGGTCTTTACTGG 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-27R）
<400> 4
GCTGAAGGTTAAATGCTGATAAGTG 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-18F）
<400> 5
GGAAACCGACTTTGATTCTATGAGT 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-18R）
<400> 6
GCCTTCTATCTATCTCTCGGTTGTT 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-52F）
<400> 7
ATAGTGGAGGTAATGCTGAAACCTT 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-52R）
<400> 8
GGTTGTATGCCTCCATTATTATGTC 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-100F）
<400> 9
AGAAGGGTCAGGTTCATATTAGTCC 25
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-100R）
<400> 10
AGAGTGAGCTGCAGTCAAGGTT 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-93F）
<400> 11
CAGAAGTCTCAGAGAAGCAGAAATC 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-93R）
<400> 12
GAACTATGTGAAGCAGGGATTTAAC 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-3F）
<400> 13
GGATTTGGCAATGTGTCTGA 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-3R）
<400> 14
TGTGCATCATACGGGTCACT 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-23F）
<400> 15
ACGCATGCTAGCTTTGGTAACTAAT 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-23R）
<400> 16
AACAACTTTGGGCATACTAGCTCTT 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-44F）
<400> 17
TGGAGCTAAGCTATCCACTGTATTC 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-44R）
<400> 18
CATTGGTGAATTAGTTATGGGACAC 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-12F）
<400> 19
TACAATTATCGTGATGCAGTAGGTG 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-12R）
<400> 20
TAGTGCTGTTGGTGGTGGTAATAAT 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-15F）
<400> 21
ATCAGCATGCTAACATGATTTCTCC 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-15R）
<400> 22
TTCATGAGAGTTAACGGAACTGACF 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-8F）
<400> 23
CTGCTATTCATACCAAAGCAGTAGG 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-8R）
<400> 24
TTGTGTAAAGTTTGGTCTCTGTACG 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-39F）
<400> 25
ACTTCAATAGCTGAACAAGGACAAC 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-39R）
<400> 26
GTACAGAACCTACAGCATCCAAATC 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-13F）
<400> 27
TGGGCTGTAGTGGTAGTTCTGTTAT 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（InDel-13R）
<400> 28
TGTACAGAACAGTGATTCAAACAGG
Claims (1)
1.一组猕猴桃InDel分子标记在杂交子代真实性鉴定中的应用，其特征在于：所述InDel分子标记包括如下14个位点对应的正向和反向引物：
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| CN104293942A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-01-21 | 中国科学院武汉植物园 | 用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的ssr分子标记a001 |
| CN105331717A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-02-17 | 江苏省农业科学院 | 西瓜InDel分子标记及其开发方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RETICULATE EVOLUTION IN KIWIFRUIT (ACTINIDIA, ACTINIDIACEAE) IDENTIFIED BY COMPARING THEIR MATERNAL AND PATERNAL PHYLOGENIES;CHAT J.等;《American Journal of Botany》;20041231;第91卷(第5期);全文 * |
| 应用InDel标记进行软枣猕猴桃杂交子代真实性鉴定;孙世航等;《果树学报》;20170919(第01期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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