CN111286556A - 基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，所述鉴定方法包括以下步骤：S1、利用二代测序技术对金兰柚样品进行基因组重测序，以晚白柚为参考基因组，将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；S2、利用设定的参数进行InDel标记筛选；S3、挑选200个InDel位点设计引物并进行PCR检测，最后在全基因组范围内共筛选出81对杂合位点作为用于鉴定的标记；S4、利用S3筛选出的标记进行染色体定位和基因序列注释，实现对金兰柚品种的鉴定。本发明开发一组金兰柚全基因组InDel分子标记，通过检测一对或多对与金兰柚相关的InDel标记，可以有效鉴定是否为金兰柚品种，为金兰柚品种保护和快速鉴定提供了有效方法。
Description
技术领域
本发明属于生物鉴别技术领域，尤其涉及一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法。
背景技术
柚(Citrus grandis)为芸香科柑橘属乔木，在我国南方广泛栽培种植，其产业在地方经济中占据重要地位。金兰柚为江西省吉安市“井冈蜜柚”三大主栽品种之一，其果肉脆嫩，味甜多汁，并且富含柚皮苷、柠檬苦素和维生素C等营养物质，具有极高的营养保健价值。目前，仅安福县金兰柚种植面积就已达8万亩。
但是，随着金兰柚产业的发展，人们发现金兰柚苗木杂乱现象普遍，苗木厂在幼苗期无法区分金兰柚与其他柚类，常常将其他柚类苗木混杂在金兰柚苗中。4-5年后柚树开始结果，若发现种苗不纯，将给种植户造成巨大的经济损失。
分子标记(Molecular Markers)技术是以核苷酸序列变异为基础的遗传标记。与形态学标记相比，不受组织类别和发育时期影响，遗传稳定，被广泛应用于亲缘鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等领域。InDel(Insertion-deletion)分子标记是近年来快速发展起来的一类分子标记，在基因组中分布广泛、密度大、数目众多，具有开发成本低、通用性强、检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低等优点，适用于全基因组分子标记的开发。目前在水稻、玉米、棉花、茄子等作物中已得到广泛应用，但是在柚中还未有相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，该开发一组金兰柚全基因组InDel分子标记，通过检测一对或多对与金兰柚相关的InDel标记，可以有效鉴定是否为金兰柚品种，为金兰柚品种保护和快速鉴定提供了有效方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一组基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种用InDel分子标记，所述InDel分子标记包括如下81个引物位点及其所对应的正向和反向引物：
一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，所述鉴定方法包括以下步骤：
S1、利用二代测序技术对金兰柚样品进行基因组重测序，以晚白柚为参考基因组，将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；
S2、利用设定的参数进行InDel标记筛选；
S3、挑选200个InDel位点设计引物并进行PCR检测，最后在全基因组范围内共筛选出81对杂合位点作为用于鉴定的标记；
S4、利用S3筛选出的标记进行染色体定位和基因序列注释，实现对金兰柚品种的鉴定。
上述技术方案中进一步改进的技术方案如下：
1、上述方案中，所述步骤S2中的参数包括(1)变异位点的QUAL大于400；(2)变异位点的GQ值为99；(3)InDel插入或者缺失的长度大于100bp；(4)覆盖深度大于20层。
2、上述方案中，所述步骤S1中金兰柚样品重测序及数据分析具体为：样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、将‘A’碱基加入到DNA片段的3’端，连接测序接头，将连接产物环化后直接进行文库检测，质检合格的文库用BGISEQ-500WGS进行测序，运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；通过SAMtools和GATK进行变异检测。
3、上述方案中，所述步骤S2中标记筛选的具体操作为：利用python中封装完成的PyVCF库进vcf文件的读取，获取标记的染色体和位置信息以及基因型信息，以基因型为杂合0/1类型、变异位点的QUAL大于400、变异位点的GQ值为99InDel插入、覆盖深度大于20、缺失的长度大于100bp为参数进行过滤，根据REF和ALT的长度作为判断条件进行序列注释，如果REF长度大于ALT，则表明样品中缺失了一段序列，如果REF长度小于ALT，则表明样品中插入了一段序列；利用python库中封装好的pysam进行insetion位置侧翼200bp序列抓取，将deletion位置的侧翼200bp加上删除的序列长度进行抓取，形成fasta格式的文件，结合Primer3.0设计InDel标记的扩增引物。
4、上述方案中，所述步骤S3操作具体为：根据预测的InDel位点，以杂合标记的基因型过滤，并以琼脂糖凝胶电泳条带大于100bp为条件进行筛选和引物设计，选取200个InDel位点设计引物合成，以金兰柚样品对上述引物进行扩增效果评价。
5、上述方案中，所述PCR检测中PCR反应体系为10μl：5μl 2x Taq plus mastermix，0.25μl正向引物，0.25μl反向引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm 55℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min；
琼脂糖凝胶电泳采用1.5％～2％质量百分比的琼脂糖凝胶，电压120V，电泳15～20min。
6、上述方案中，所述步骤S4为经过至少两轮PCR鉴定，保留胶图清晰并且大小与预测完全一致的引物，引物扩增可见两条带，表明该位点为杂合，且存在胶图可分辨的大小差异，这些即可确定为可以使用的具有良好效果的标记；利用python脚本获取基因组中组装的基本信息，包括组装出来的染色体的物理长度，结合PyVCF获取到的标记的染色体和位置信息进行物理定位，将标记锚定到染色体上。
7、上述方案中，所述DNA片段化采用的机械打断的方法为超声波。
8、上述方案中，应用上述分子标记可区分金兰柚与其他柚类品种，所述其他柚类品种包括沙田柚、琯溪蜜柚、文旦柚、马家柚或江西省柚类品种中的任意一种或多种。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1、本发明基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其开发的InDel标记变异稳定、检测容易，InDel插入/缺失片段较大，可通过琼脂糖进行分析，成本低；针对金兰柚基因组开发的InDel多态标记具有很高的成功率。
2、本发明基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其81对引物，在9条染色体上分布均匀，能够用于金兰柚真实性鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种，可以提高工作效率，InDel标记通用性好，检测成本低、易操作。
附图说明
附图1为本发明81个InDel标记的琼脂糖凝胶检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例：一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，所述鉴定方法包括以下步骤：
(1)金兰柚样品重测序及数据分析
样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法(超声波)将DNA片段化,然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、将‘A’碱基加入到DNA片段的3’端，连接测序接头，将连接产物环化后直接进行文库检测，质检合格的文库用BGISEQ-500WGS进行测序。运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对。通过SAMtools和GATK进行变异检测。
(2)利用python中封装完成的PyVCF库进vcf文件的读取，获取标记的染色体和位置信息以及基因型信息，以基因型为杂合0/1类型；变异位点的QUAL大于400；变异位点的GQ值为99InDel插入；覆盖深度大于20，缺失的长度大于100bp为参数进行过滤，根据REF和ALT的长度作为判断条件进行序列注释，如果REF长度大于ALT，则表明样品中缺失了一段序列，如果REF长度小于ALT，则表明样品中插入了一段序列。利用python库中封装好的pysam进行insetion位置侧翼200bp序列抓取，将deletion位置的侧翼200bp加上删除的序列长度进行抓取，形成fasta格式的文件。结合Primer3.0设计InDel标记的扩增引物。
(3)根据预测的InDel位点，以杂合标记的基因型过滤，并以琼脂糖凝胶电泳条带大于100bp为条件进行筛选和引物设计，选取200个InDel位点设计引物交北京擎科生物科技有限公司合成。以金兰柚样品对上述引物进行扩增效果评价。
PCR反应体系为10μl：5μl 2x Taq plus master mix，0.25μl正向引物，0.25μl反向引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm 55℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳采用1.5％-2％质量百分比的琼脂糖凝胶，电压120V，电泳15-20min。
(4)经过至少两轮PCR鉴定，保留胶图清晰并且大小与预测完全一致的引物，引物扩增可见两条带，表明该位点为杂合，且存在胶图可分辨的大小差异，这些即可确定为可以使用的具有良好效果的标记。利用python脚本获取基因组中组装的基本信息，包括组装出来的染色体的物理长度，结合PyVCF获取到的标记的染色体和位置信息进行物理定位，将标记锚定到染色体上。
如表1所示，为本发明所开发的一种InDel分子标记，所述InDel分子标记包括如下81个引物位点及其所对应的正向和反向引物：
本发明上述内容进一步解释如下：
在实际鉴定金兰柚的过程中，采集若干待检测柚子材料，利用上述81个标记，最好在每条染色体上选取1对标记，采用上述步骤进行扩增，如果这些标记扩增条带都与金兰柚一致说明就是金兰柚，如果有一个标记扩增条带不一致，则不是金兰柚。
本发明开发了一组金兰柚全基因组InDel分子标记，及InDel标记在金兰柚染色体上的位点，获得这些InDel标记的引物及相关应用。通过检测一对或多对与金兰柚相关的InDel标记，可以有效鉴定是否为金兰柚品种，为金兰柚品种保护和快速鉴定提供了有效方法。本发明InDel标记通用性好，检测成本低、易操作。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西省农业科学院园艺研究所
<120> 一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法
<160> 162
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccactccctc ttcttcacca 20
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tcacagagtc cagtggttgg 20
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
cgcgtggtat agaaaattac aca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
cccgaagtcg atatcttttc c 21
Claims (9)
1.一组基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种用InDel分子标记，其特征在于：所述InDel分子标记包括如下81个引物位点及其所对应的正向和反向引物：
2.一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述鉴定方法包括以下步骤：
S1、利用二代测序技术对金兰柚样品进行基因组重测序；以晚白柚为参考基因组，将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；
S2、利用设定的参数进行InDel标记筛选；
S3、挑选200个InDel位点设计引物并进行PCR检测，最后在全基因组范围内共筛选出81对杂合位点作为用于鉴定的标记；
S4、利用S3筛选出的标记进行染色体定位和基因序列注释，实现对金兰柚品种的鉴定。
3.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S2中的参数包括(1)变异位点的QUAL大于400；(2)变异位点的GQ值为99；(3)InDel插入或者缺失的长度大于100bp；(4)覆盖深度大于20层。
4.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S1中金兰柚样品重测序及数据分析具体为：样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、将‘A’碱基加入到DNA片段的3’端，连接测序接头，将连接产物环化后直接进行文库检测，质检合格的文库用BGISEQ-500WGS进行测序，运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；通过SAMtools和GATK进行变异检测。
5.根据权利要求2或3所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S2中标记筛选的具体操作为：利用python中封装完成的PyVCF库进vcf文件的读取，获取标记的染色体和位置信息以及基因型信息，以基因型为杂合0/1类型、变异位点的QUAL大于400、变异位点的GQ值为99InDel插入、覆盖深度大于20、缺失的长度大于100bp为参数进行过滤，根据REF和ALT的长度作为判断条件进行序列注释，如果REF长度大于ALT，则表明样品中缺失了一段序列，如果REF长度小于ALT，则表明样品中插入了一段序列；利用python库中封装好的pysam进行insetion位置侧翼200bp序列抓取，将deletion位置的侧翼200bp加上删除的序列长度进行抓取，形成fasta格式的文件，结合Primer3.0设计InDel标记的扩增引物。
6.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S3操作具体为：根据预测的InDel位点，以杂合标记的基因型过滤，并以琼脂糖凝胶电泳条带大于100bp为条件进行筛选和引物设计，选取200个InDel位点设计引物合成，以金兰柚样品对上述引物进行扩增效果评价。
7.根据权利要求2或6所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述PCR检测中PCR反应体系为10μl：5μl 2x Taq plus master mix，0.25μl正向引物，0.25μl反向引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm 55℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min；
琼脂糖凝胶电泳采用1.5％～2％质量百分比的琼脂糖凝胶，电压120V，电泳15～20min。
8.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S4为经过至少两轮PCR鉴定，保留胶图清晰并且大小与预测完全一致的引物，引物扩增可见两条带，表明该位点为杂合，且存在胶图可分辨的大小差异，这些即可确定为可以使用的具有良好效果的标记；利用python脚本获取基因组中组装的基本信息，包括组装出来的染色体的物理长度，结合PyVCF获取到的标记的染色体和位置信息进行物理定位，将标记锚定到染色体上。
9.根据权利要求4所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述DNA片段化采用的机械打断的方法为超声波。
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|---|---|---|---|---|
| CN114438249A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-05-06 | 江西省农业科学院园艺研究所 | 一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法 |
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