CN1079114C - 稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因 - Google Patents

稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因 Download PDF

Info

Publication number
CN1079114C
CN1079114C CN94116141A CN94116141A CN1079114C CN 1079114 C CN1079114 C CN 1079114C CN 94116141 A CN94116141 A CN 94116141A CN 94116141 A CN94116141 A CN 94116141A CN 1079114 C CN1079114 C CN 1079114C
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
rice blast
blast resistance
gene
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN94116141A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1104251A (zh
Inventor
川崎信二
桂直树
宫本胜
佐藤征弥
安东郁男
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NEW TECHNOLOGY ENTERPRISE CORP
National Institute Of Agrobiological Resources Ministry Of Agriculture Forestr
Original Assignee
NEW TECHNOLOGY ENTERPRISE CORP
National Institute Of Agrobiological Resources Ministry Of Agriculture Forestr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NEW TECHNOLOGY ENTERPRISE CORP, National Institute Of Agrobiological Resources Ministry Of Agriculture Forestr filed Critical NEW TECHNOLOGY ENTERPRISE CORP
Publication of CN1104251A publication Critical patent/CN1104251A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1079114C publication Critical patent/CN1079114C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了稻瘟病抗性基因的核酸标记物，该标记，物是从稻基因组DNA中分离的，它是具有总长度长至2kb的DNA序列，在其两个末端带有至少10个碱基的两个相同序列，并且定位于离稻瘟病抗性基因pi-b，pi-ta或pi-ta22.0cM的距离内，根据本发明，可以容易地从含有Pi-b，Pi-ta2或Pi-ta的栽培稻中分离稻瘟病抗性基因和相关基因，因此，有利于开发和繁育优势稻种。也可以方便地对稻种进行抗性测试。这将开辟制造新抗性基因的途径。

Description

稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使 用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因
本发明涉及用于分离稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些核酸标记物分离到的稻瘟病抗性基因。
可以用本发明的核酸标记物进行标记的稻瘟病抗性基因不仅对于制备优势栽培稻种是非常有用的，而且可作为研究用材料以及用于制备能被导入到各种植株中的新的抗性基因的遗传资源。
本领域内技术人员熟知存在着能给植株提供抗病原体抗性的基因，并且在常规育种尝试中导入这些基因已经是重要的指标。因此至今通过导入这些抗性基因已制造了许多新类型的栽培种。鉴于这种生物方法通过利用植株的遗传功能而阻碍瘟疫流传将降低化学杀虫剂的消耗，并且促进了人类健康以及保存了完好的环境，还能降低农业成本，因此这些抗性基因的重要性将在世界范围内日益提高。
在抗病原体的植物抗性基因中。首先在日本发现了稻瘟病抗性基因，并且从此以后已发现了许多这样的基因的存在。尤其是，来自于印度稻的抗性基因对在日本发现的许多种稻瘟病真菌显示有抗性，并且是十分有用的遗传资源。在其它基因中，来源于印度稻的Pi-b，Pi-ta和Pi-ta2基因适用于分析基因的RFLP图谱。但是仍然仅有十分有限的情况将基因导入现存的优良的栽培种。
大概的原因是常规的育种方法需要通过许多代回交将抗性基因导入一个栽培种，并且伴随该过程，每年将病原体接种到许多单株上进行抗性试验。由于严格控制外源病原体输入，在日本国内对外来病原体进行抗性检测几乎是不可能的。
另一方面，在植物生物技术方面的最新进展已能认别和分离各种基因，然后将它们导入到其他植株中。因此，对于植物抗性基因，使用遗传工程技术将它们克隆后导入到任何有用的栽培种中并不困难，这样将大大地降低在繁育抗性栽培种时需要的时间及劳动力。还可以阐明抗性基因怎样在植株中活动，并且怎样可以修饰该基因以及然后怎样提供新的抗性基因类型的机理。现在许多研究组正在努力研究以分离到抗性基因，但至今仅有几个组获得了成功。这可归因于下列事实：只知道有限的关于抗性基因产物的生化特征的信息。
作为一种分离基因的方法，一种已知的定位克隆的抗术现在正引起人们的注意。该技术利用基因图谱中靠近靶基因的核酸标记物，并且从基因组文库中分离出靶基因。实际上，使用该技术已经分离到了某些引起人类遗传病的基因。
虽然在植物中已报道的这种定位克隆仅有几种成功的情况，但根据下列原因据认为稻是该技术最合适的植物：(1)在主要的作物中稻有最小的基因组尺寸；(2)水稻中与一个单位遗传距离(CM)相对应的物理距离(以kb计)非常小；(3)通过使用几个邻近的等基因系(NIL)很容易限制基因位点范围，其中已通过将印度稻衍生的基因渐渗到日本稻本底而产生邻近等基因系(NIL)；以及(4)将基因导入到互补测试的细胞中很容易。
这种定位克隆过程成功的一个重要关键点是否能得到一个相邻接的有效标记物。根据稻基因组大小和遗传图谱的计算结果，估计对应于稻遗传图谱的1厘摩(cM)的物理距离基于核酸来计算大约为100-200kb。另一方面，插入的酵母人工染色体(YAC)的平均大小大于200kb。因此，如果有一种距离小于100kb，即0.5-1.0cM的抗性基因的DNA标记物，该基因的定位克隆成功的可能性被认为是非常高的。
使用这样的稻瘟病抗性基因的邻近核酸标记物还可以大大地降低在常规育种中例如通过回交而检测抗性所需的时间和劳动力。
本发明目的提供适用于稻瘟病抗性基因的新的邻近核酸标记物，以及使用这些标记物分离并克隆的这些稻瘟病抗性基因。
本发明提供了稻瘟病抗性基因的核酸标记物，这些基因是从稻基因组DNA中分离的；标记物DNA序列总长度高至2kb，并且在两个末端带有至少10个碱基的两个相同序列；并且定位于距水稻瘟病抗性基因Pi-b，Pi-ta或Pi-ta2，2.0厘摩(cM)的距离内。
本发明还提供了定位于上面介绍的核酸标记物附近的二级核酸标记物，以及利用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因和与这些基因相关的基因组。
根据本发明，提供了适用于分离稻瘟病抗性基因Pi-b，Pi-ta2或Pi-ta的有效标记物。通过这些核酸标记物的应用，便可以方便地从各种栽培稻种中分离到稻瘟病抗性基因以及相关的基因组，从而有利于开发和繁育出优良栽培种。还可以方便地完成水稻抗性检测。开创了制备新的抗性基因的途径。
图1.表示将稻瘟病抗性基因Pi-b导入日本栽培种的谱系图。底下划线表示带有抗性基因的栽培种。
图2.图解观察带有Pi-b基因的邻近等基因系的水稻第二染色体。黑色部分表示来源于印度稻供体的区域。
图3.是将稻瘟病抗性基因Pi-ta2和Pi-ta导入日本山渣栽培种的谱系图。底下划线部分表示带有抗性基因的栽培种。
图4.图解观察带有Pi-ta2和Pi-ta基因的邻近等基因系的水稻第十二染色体。黑色和灰色部分表示来源于印度稻供体的区域。
图5.借助于其分离RAPD标记b-1根据RFLP图谱分析水稻抗性基因Pi-b的图谱。距离单位cM。
图6.从图1相关的栽培种扩增的快速标记物b-1谱带(箭头)。谱带b-1对所有底下划线表明的带有Pi-b的栽培种是特异的。
图7.是从图3相关的栽培种扩增的快速标记物ta2-1的谱带(箭头)。谱带ta2-1对所有底下划线表明的带有Pi-ta2和Pi-ta的栽培种是特异性。
在下文中进一步详细描述本发明的核酸标记物。
通过将几个带有稻瘟病抗性基因Pi-b，Pi-ta或Pi-ta2的不同水稻栽培种的基因组DNA和没有瘟病抗性基因的水稻栽培种的基因组DNA进行比较，并且识别出在带有稻瘟病抗性基因的栽培种中在稻瘟病抗性基因附近(2.0CM或约200-400kb内)特异性地存在着一条特异DNA谱带，由此而得到本发明的核酸标记物。
基因组DNA的比较可以在具有稻瘟病抗性基因的印度稻栽培种(供体亲本)和不具有这种基因的日本稻栽培种(回交亲本)之间进行，也可在通过将供体亲本与回交亲本重新杂交而产生的邻近等基因系的稻栽培种之间进行。
此外，本发明的核酸标记物具有下列特征，它们是具有总长度达2kb的DNA序列，并且在其两个末端带有至少10个碱基的相同序列。更具体地讲，在用至少10个碱基的合成寡聚核苷酸引物作为引物将要比较的水稻栽培种(例如上面介绍的供体亲本，回交亲本以及邻近等基因系)的基因组DNA进行PCR扩增后识别出这些核酸标记物为结合到靶基因上显示有多态性的DNA片段，尤其是进行F2分析后已知它们位于靶基因附近。
因此本发明制备的核酸标记物是具有总长度为高至2.0kb的DNA序列，并且在其两个末端具有相同于PCR扩增的那些引物的序列，并且该标记物序列定位于离稻瘟病抗性基因Pi-b，Pi-ta或Pi-ta2 2cM的短距离内，可以作为稻瘟病抗性基因或相关基因的有效的标记物。
借助下列实施例和检测试验进一步详细描述本发明。
实施例1
稻瘟病抗性基因Pi-b的核酸标记物的鉴别。
(1)材料的制备
(a)DNA提取物：
分别采用已知方法制备下列提取物：
1)含有水稻文库的大肠杆菌质粒DNA；
2)其有稻瘟病抗性基因Pi-b的水稻栽培种(供体亲本)的DNA；
3)不合有稻瘟病抗性基因Pi-b的日本稻栽培种(回交亲本)的DNA；
4)通过将回交亲本与供体亲本重复杂交而制备稻栽培种DNA(邻近等基因系)；以及
5)在上述2)，3)和4)中列出的水稻栽培种叶的粗提取物。
(b)PCR引物：
合成具有No.1号核苷酸序列的寡核苷酸引物并且使用之。
(c)用于DNA扩增的酶底物溶液：其组成及最终浓度如下：
Tris-Cl(PH：8.3)          10mM
KCl                       50mM
MgCl2                    2mM
明胶                      0.01％(w/v
dATP，dTTP，dGTP，dCTP    各100μM
Taq聚合酶                 0.5单位
(2)水稻DNA的随机PCR扩增
将列于上述(a)-1至5)的DNA提取物各25ng与15ng引物(b)和10μl 2.5  倍浓度的(c)一起混合，加入蒸馏水以达到总体积为25μl。将每个反应试管中的混合物进行45个PCR循环，每个循环包括94°，1分钟，36℃进行1分钟并在72℃进行2分钟。然后将样品混合物加到用1×TAE缓冲液配制的1.5％琼脂糖凝胶的1×3-5mm狭槽中，并且用5V/cm的伏特梯度电泳1小时。在电泳之后，用0.5g/ml的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色凝胶一小时，用300-320nm的放射性紫外线射线检测DNA谱带。
(3)核酸标记物的鉴定
将从列于上述(1)-(a)中的DNA提取物2)至4)扩增的DNA片段进行比较以鉴别存在于含有稻瘟病抗性基因Pi-b的2)和4)DNA但不存于没有Pi-b基因的3)DNA(图6)中的DNA片段。此外，通过Norin 22(无Pi-b)×BL1(含有Pi-b)的F2分析识别定位于离Pi-b基因1.0cM(相当于约100-200kb)内的DNA片段。
于是获得了适用于稻瘟病抗性基因Pi-b的核酸标记物b-1。该标记物b-1是一个具有总长度从800到1,400b的DNA序列，并且在其两个末端具有序列No.1核苷酸序列或其同源序列。
通过将各个栽培种的5)的DNA的PCR扩增片段进行比较，这是上面介绍的方法的一种简化形式，还能证实该标记物b-1是可辨认的。
还可以证实该标记物b-1可看作是适用于Pi-b甚至于具有Pi-b基因的水稻栽培种的水稻基因组文库1)的满意的Pi-b标记物。由此将扩增谱带ta2-1显示于图7中。
实施例2
以相同于实施例1中的方法鉴别适用于稻瘟病抗性基因Pi-ta2的核酸标记物，不同的是使用含有序列No.2核苷酸序列的合成寡核苷酸PCR引物以及图3的相关谱系的带有Pi-ta或Pi-ta2的水稻栽培种。
由此得到的标记物ta2-1是一种具有总长度为400-600bp的DNA序列，并且在其两个末端具有No.2的核苷酸序列或同源序列。
现在，进行下面章节中描述的某些测试，以调查在上述实施例1和2中获得的标记物b-1和ta2-1的特性。
                  测试1
对于标记物b-1，通过印度稻栽培种重复回交而检测其在将稻瘟病抗性基因导入到邻近等基因系(NIL)中的行为。
通过重复回交如图1所示已将来源于印度稻栽培种的Pi-b基因导入10个系中。使用邻近RFLP(限制性片段多态性)标记物(Saito等人，Jpn.J.Breed.；Vol.41，665-670；Kurata等人，1992：Rice Genet，Newslett.，Vol.9.130-132)检测所导入的印度稻供体的染色体是否延伸到这些NIL中，并且将结果与用在实施例1中获得的标记物(b-1)检测结果进行比较。
从显示于图1中的各个栽培种中提取DNA，并用第二染色体的上部末端部分的RFLP标记物进行Southern吸印试验，并通过检测这些标记物是日本稻型或印度稻型(图2)而调查印度稻供体亲本的染色体的哪部分遗传给这些NIL。根据结果(图2)，在8/9的NIL栽培种中证明两个RFLP标记物是印度型，但是对于所有检测的NIL没有存在显示印度型的标记物。另-方面利用从图1中所有栽培种中提取的DNA，按实施例中描述的同样方式进行PCR分析，在所有含有Pi-b的栽培种，包括九个NIL栽培种中b-1谱带显示印度型。换句话说，标记物b-1显示出比至今已知的任何RFLP标记物(Kurate et al.，1992：Rice Genet.Newslett.，Vol.9，130-132)具更好的与稻瘟病抗性基因Pi-b的存在的关联作用。
                      测试2
以相同于测试1中的方式对标记物ta2-1进行测试。
已知来源于印度稻栽培种的稻抗性基因Pi-ta2和Pi-ta占据同样位点(Kiyosawa，1967，Jpn.J.Breed.，Vol.17，165-172)。对于该供体亲本，在谱系中的回交亲本和邻近等基因系(图3)，调查其在RAPD标记的标记物ta2-1和邻近的RFLP标记物(Saito et al.，1991：Jpn.J.Breed.，Vol.41，665-670)中类型的多态性。并且检查印度稻供体的染色体的哪部分被导入以及测定抗性基因和ta2-1在遗传图谱上的大约位置(图4)。
从显示于图3中的各个载培种中提取DNA并用在第十二染色体上的RFLP标记物(Saito.et al.，1991)进行Southern印迹分析以调查印度稻供体的染色体的哪部分遗传到每个NIL(图4)。另一方面使用相同于实施例中描述的方法提取的这些DNA进行PCR分析：对于所有带有Pi-ta2的栽培种ta2-1谱带显示印度稻型。因此，估计ta2-1在染色体图谱上的位置是在图4的阴暗范围内。
由于某些带规RFLP标记物显示出与ta2-1具有类似行为，因而对于常规标记物，测试其多态性比ta2-1更困难，并且要花费三倍多的时间。
                  测试3
进行F2分析以测定稻瘟病抗性基因Pi-b和称为标记物b-1之间的遗传距离。
将BL-1，一种含有稻瘟病抗性基因Pi-b的栽培种，与Norin22，一种没有Pi-b的栽培种交配，获得许多第二代单体(F2)。使用该F2组，进行试验以测定稻瘟病抗性基因Pi-b和称为标记物b-1之间的重组比率以及遗传距离。
培植约400个F2单株，并在约5-6片叶期，将1×105/ml的稻瘟病Hoku-l菌株菌丝体悬液喷施接种到叶上。将接种过的叶在25℃，100％相对湿度时保留24小时，然后放到温室中。接种7天后，根据叶上出现的损伤及严重程度诊断出个体是抗性或易感染的。
从测出为易感染的85个单株的每株提取DNA，并且对于其中的每种用相同于实施例的方式进行PCR，以检测b-1类型为印度型或日本型。结果，在b-1和Pi-b之间没有发现重组，估计它们之间的遗传距离小于0.5cM。假定稻基因组大小是200-420Mb并且染色体图谱的总长度是约2,000cM(Saito et al.，1991)时该遗传距离对应于小于50-100kb的物理距离。考虑到在酵母人工染色体(YAC)中容易获得200-300kb基因组片段，因而这是一个非常短的距离，对于该距离足够用于完成定位克隆。
在F2分析中仅使用易感染单株，以便避免由于不充分的喷施接种而出现易感染单株表面显示无损伤并诊断为抗性。相反，抗性单株显示出许多坏死损伤的可能性非常低。结果导致表现型的诊断有较高的精确性。当抗性基因是显性时，易感染单株在基因Pi-b位点是日本型隐性纯合，预期附近的b-1标记物谱带类型是日本型。因此，容易检测到两个同源染色体与印度型的重组。由于能在两倍数目的单株染色体中检测到重组，重组比例的检测效率也变成二倍高。这两个优势对于测定具有非常低重组比例的两个基因之间的距离是十分重要的。
                    测试4
执行F2分析以测出稻瘟病抗性基因Pi-ta2和具标记性的标记物ta2-1之间的遗传之间。
将PiNo.4 一种含有稻瘟病抗性基因Pi-ta2的栽培种以及Norin22，一种没有Pi-ta2的载培种进行交配，以获得许多第二代(F2)种子。使用F2单株，执行一个试验以测定稻瘟病抗性基因Pi-ta2和标记物ta2-1之间的重组比例以及它们之间的遗传距离。
栽培约400个F2单株，在约5片叶期时，将1×105/ml的稻瘟病Hoku-1菌株的菌丝体悬液喷施接种到叶上。将经过接种后的叶在25℃，100％相对湿度下放置24小时，然后移至温室。接种7天后，根据叶上损伤的出现以及严重程度诊断出抗性株和易感染株。
从被测定为易感染的85个单株中的每一株提取DNA，并且以相同于实施例中方法将所有DNA进行PCR扩增，以检测ta2-1的型式是印度型或日本型。结果在ta2-1和Pi-ta2之间没有发现重组，估计它们之间的遗传距离为0.5cM。该距离相当于染色体图谱上小于50-100kb的物理距离。考虑到在酵母人工染色体(YAC)上可容易获得200-300Kb基因组片段，上述遗传距离是非常短的。并且对于该距离有足够可能性进行定位克隆。
测试5
测定Rapd标记物b-1在RFLP图谱上的位置
将BL-1和Norin22杂交后的F2代用于进行测试3中描述的分析。在BL-1的染色体2上，仅非常有限的长度来源于印度稻供体，并且其中不存在目前可得到的RFLP标记物。因此通过这种F2分析测定Pi-b在RFLP图谱上的位置是不可能的。但是，通过使用两个没有Pi-b基因的Kasalath(印度稻)和koshihikari(日本稻)杂交的F2代，通过分析RFLP图谱上b-1的图谱(图5)，可以根据与Pi-b共分离的b-1的位置间接测定RFLP图谱上Pi-b的位置。
更具体地，从85株由Kasalath和Koshihikar；杂交得到的F2的每-株提取核酸。检测RFLP标记物Saito et al.(1991)和Kurata et al.(1992)和RAPD标记物b-1之间的重组比例，并测出在RFLP图谱上b-1的位置，如图5所示。据认为Pi-b在相同位置。利用分离出的b-1的带核酸，作为探针进行Southern杂交测出b-1的多态型。
根据上面介绍的测试1-5的结果，证实实施例1和2中获得的核酸标记物b-1和ta2-1分别定位于离稻瘟病抗性基因Pi-b和Pi-ta2不到0.5cM的距离处以及0.5CM的距离处，并且它们分别是Pi-b和Pi-ta2基因的有效性标记物。
序列表
序列号：1
长度：10
类型：核酸
股数：单股
几何结构：线性
分子类型：合成DNA
序列：
     GTGAT    CGCAG    10
序列号：2
长度：10
类型：核酸
股数：单股
几何结构：线性
分子类型：合成DNA
序列：
     TCGCC    AGCCA    10

Claims (2)

1.稻瘟病抗性基因Pi-b的核酸标记物，它是：
(1)从稻基因组DNA中分离到的；
(2)具有800-1,400b总长度的DNA序列，并在其两个末端有序列号：1的碱基序列或其同源序列；并且
(3)定位于离Pi-b基因1.0厘摩(cM)的距离內。
2.稻瘟病抗性基因Pi-ta或Pi-ta2的核酸标记物，它是：
(1)从稻基因组DNA中分离到的；
(2)具有400-660b总长度的DNA序列，并且在其两个末端具有序列号No.2的碱基序列或其同源序列；且
(3)定位于离Pi-ta或Pi-ta21.0厘摩(cM)的距离內。
CN94116141A 1993-07-29 1994-07-29 稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因 Expired - Fee Related CN1079114C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP188544/93 1993-07-29
JP18854493 1993-07-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1104251A CN1104251A (zh) 1995-06-28
CN1079114C true CN1079114C (zh) 2002-02-13

Family

ID=16225565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94116141A Expired - Fee Related CN1079114C (zh) 1993-07-29 1994-07-29 稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因

Country Status (4)

Country Link
US (1) US5674993A (zh)
CN (1) CN1079114C (zh)
AU (1) AU6879994A (zh)
FR (1) FR2708613B1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6333151B2 (en) * 1993-07-29 2001-12-25 Research Development Corporation Of Japan Nucleic acid markers for rice blast resistance genes and rice blast resistance genes isolated by the use of these markers
AU4174397A (en) * 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
CN1052985C (zh) * 1997-12-27 2000-05-31 中国科学院新疆化学研究所 从大赖草中提取与穗形相关成分的高活性dna的方法
EP1047783A1 (en) * 1998-01-16 2000-11-02 Institute of Molecular Agrobiology Gene associated with disease resistance in plants
JP3440258B2 (ja) * 1998-06-12 2003-08-25 独立行政法人農業生物資源研究所 いもち病抵抗性遺伝子
US6479731B1 (en) 1998-08-04 2002-11-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Pi-ta gene conferring fungal disease resistance to plants
AU2002225729A1 (en) 2000-11-14 2002-05-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Modification of a plant disease resistance gene specificity and method for engineering altered specificity
US20040060081A1 (en) * 2001-10-19 2004-03-25 Leong Sally A. Plant genes that confer resistance to strains of magnaporthe grisea having avri co39 cultivar specificity gene
CN1294278C (zh) * 2003-10-15 2007-01-10 中国水稻研究所 检测水稻抗穗瘟病基因Pi25（t）的分子标记SA7
CN1306041C (zh) * 2003-12-16 2007-03-21 中国科学院遗传与发育生物学研究所 抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物与应用
CN1297661C (zh) * 2003-12-16 2007-01-31 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白与应用
CN100410390C (zh) * 2006-01-26 2008-08-13 中国水稻研究所 水稻广谱抗稻瘟病基因的分子鉴别及转育技术
CN102154470B (zh) * 2011-01-17 2013-04-10 南京农业大学 水稻抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)的分子标记方法
CN103333887B (zh) * 2013-06-17 2015-09-30 华南农业大学 一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记
CN108018371A (zh) * 2017-12-21 2018-05-11 辽宁省盐碱地利用研究所 鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用
CN114736981B (zh) * 2022-03-18 2023-10-31 中国水稻研究所 水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THEOR APPL GENET VOL81 1991.1.1 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2708613A1 (fr) 1995-02-10
US5674993A (en) 1997-10-07
FR2708613B1 (fr) 1996-04-05
CN1104251A (zh) 1995-06-28
AU6879994A (en) 1995-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1079114C (zh) 稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因
KR101912192B1 (ko) 도라지 품종 판별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
CN110512025A (zh) 一种与小麦抗白粉病基因PmJM23紧密连锁的分子标记及其应用
CN109913582B (zh) 一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用
CN113234852B (zh) 一种鉴定小麦白粉病抗性的分子标记、引物组及应用
CN111926104B (zh) 一种鉴定甘蔗与斑茅杂交后代真实性的ssr分子标记及其方法
CN108456740A (zh) 一个水稻稻瘟病抗性位点‘Pi-jx’及其Indel标记引物和育种应用
CN109735650B (zh) 四种基于单核苷酸多态性的甜瓜抗蔓枯病分子标记及用途
KR102116428B1 (ko) 뿌리혹병 저항성 배추 품종의 판별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102024212B1 (ko) ＤＮＡ 마커를 포함하는 벼 키다리병 저항성 유전자 qBK1WD를 가진 벼 품종 선별용 조성물 및 이를 이용한 저항성 벼 품종 선별 방법
CN113736866B (zh) 用于检测番茄黄化曲叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用
KR101793042B1 (ko) 수박 흰가루병 저항성 유전자 선발용 분자마커
CN109913580B (zh) 一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用
KR20100051981A (ko) 고추 탄저병 균주(Colletotrichum acutatum)에 대한 저항성주동유전자 연관 분자표지 개발 및 이의 이용
KR101137799B1 (ko) 느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도
CN1104252A (zh) 适用于稻瘟病抗性基因横的核酸标记物以及使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因
CN109825619A (zh) 与水稻稻瘟病抗性基因Pigm紧密连锁的分子标记R060939
KR101878539B1 (ko) 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도
CN109652579A (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用
CN109797235A (zh) 与水稻稻瘟病抗性基因Pi1紧密连锁的分子标记R112823
CN117757983B (zh) 与硬粒小麦抗白粉病基因PmYD001共分离的分子标记的引物及其应用
CN116814841B (zh) 一种鉴定水稻黑褐色颖壳基因hk4的引物组及其方法和应用
KR102369297B1 (ko) 싸리수염진딧물 저항성 또는 감수성 콩 자원 판별용 마커 및 이의 용도
CN112094940B (zh) 与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用
CN108085407B (zh) 与棉花隐性芽黄基因v1紧密连锁的SSR标记及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee