CN114736981B - 水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用,特征在于其引物。利用该标记对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增和琼脂糖电泳,可以检测待测材料是否携带水稻抗稻瘟病等位基因Pi25,操作简单、安全经济、且准确性高、特异性强,可应用于水稻抗稻瘟病基因Pi25的分子标记辅助选择育种以及水稻种质资源筛选鉴定。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域,特别涉及抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用。
背景技术
稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一,种植抗稻瘟病水稻品种是解决该问题最经济有效的手段。优异抗性基因的挖掘和利用是培育抗稻瘟病水稻品种的前提条件。
Pi25是来源于我国四川籼稻品种谷梅2号中的一个广谱、持久抗稻瘟病基因(Chenet al.,2011)。鉴于Pi25基因的重大利用价值,申请人开发了多个用于检测Pi25的分子标记。但随着技术的发展和需求的提高,这些标记也暴露出一些不足之处。比如:1)SK17(专利号:ZL 200310100888.8)、SA7(专利号:ZL 200310100889.2)以及Si13068、Si13070B2、Si13070C和Si13070D(专利号:ZL 200910155609.5)等标记均为Pi25基因连锁的PCR标记,虽然操作简便,但其准确性略低于基因标记或功能标记;2)P25-1(专利号:ZL200910152617.4)是基于基因编码区1个单核苷酸多态性(SNP)设计的特异性PCR标记,但其为显性标记,无法区分抗性纯合和杂合基因型;3)CAP1/Hinc II、CAP3/Bgl II、CAP3/Nde I和CAP3/Hpy 99I等标记(王惠梅等,2012)是基于基因编码区多个SNPs设计的共显性特异分子标记,但其属于CAPS标记,在操作中需要对PCR产物进行酶切,简便性不如PCR标记。
近几年,基于Pi25基因编码区的SNPs,研究者也开发了特异SNP共显性PCR分子标记(专利号:ZL 201610014679.9)和竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分子标记(专利号:202011457366.3)。前者SNP位于ATG启动子后2566bp(以下简称为SNP2566),抗性等位基因型为c,感病等位基因型为g;后者SNPs位于ATG启动子后775bp和2687bp(以下简称为SNP775和SNP2687),抗性等位基因型均为g,感病等位基因型均为a。根据王惠梅等(2012)的报道,Tetep等位基因虽然在SNP2566上具有和抗性等位基因谷梅2号相同的碱基序列c,但是在SNP775和SNP2687上则具有和感病等位基因中鉴100相同的碱基序列a,并且Tetep的全长编码序列均比谷梅2号和中鉴100短了312bp,表明Tetep等位基因有别于谷梅2号抗性等位基因。因此,仅利用SNP2566开发的分子标记可能会导致将Tetep等位基因型误判为谷梅2号抗性等位基因型。而基于SNP775和SNP2687开发的KASP标记尽管可以区分Tetep等位基因型和谷梅2号等位基因型,但操作中需要在引物合成时人为添加荧光标记,且仪器昂贵,检测成本明显偏高。
为精确、简便且经济地鉴定Pi25的谷梅2号抗性等位基因,本发明针对谷梅2号编码区内特有的功能SNPs(SNP775和SNP2687),开发共显性PCR分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供鉴定抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其检测方法。
本发明通过以下技术方案实现:
以抗稻瘟病基因Pi25的SNP775和SNP2687位点为靶目标,分别以谷梅2号抗性等位基因和中156感病等位基因(Chen et al.,2011)及其上下游约200bp的核苷酸序列为模板,设计不同错配类型的四引物扩增受阻突变体系PCR标记引物对。利用谷梅2号、中156和Tetep检测PCR扩增效果,筛选出扩增效率和特异性俱佳的引物对,并对已知基因型的10份水稻品种进行基因型验证,应用该分子标记对17份选育的水稻恢复系/杂交稻组合进行基因型和表型的功能验证,进一步应用于94份水稻种质资源的基因型检测。
四条引物的具体序列如下:
外引物上游序列为5'-CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA-3',如序列表SEQ ID No:1所示;
外引物下游序列为5'-ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC-3',如序列表SEQ ID NO:2所示;
内引物上游序列为5'-GCTTGTGGATAGAGTCCTTCG-3',如序列表SEQ ID No:3所示;
内引物下游序列为5'-TCACAAATCATTCGCTCTTTTAACT-3',如序列表SEQ ID NO:4所示。
采用上述特异性分子标记检测Pi25基因型的方法如下:
(1)采用待检测样本的基因组DNA为模板,应用Pi25基因功能特异性分子标记的引物对进行PCR扩增,反应体系为:2×Taq MasterMix 7.5μL,引物(10μM)各0.3μL,DNA模板1.0μL,ddH2O 5.3μL,总体积15.0μL;反应条件为:94℃2分钟;94℃30秒,53℃30秒,72℃30秒,30循环;72℃5分钟。
(2)采用2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。
(3)根据电泳结果判定Pi25的基因型:能够检测到469bp和318bp条带的为Pi25纯合抗性基因型;检测到469bp和196bp条带的为pi25纯合感病基因型;同时检测到469bp、318bp和196bp条带的为杂合基因型。
与现有技术相比,本发明具有如下明显的有益效果:
本发明开发的分子标记源自基因内部功能特异性SNP,能准确检测水稻材料不同Pi25等位基因型,尤其是能鉴别区分谷梅2号和Tetep等位基因型;PCR扩增采用常规方法,操作便捷,成本低廉;核酸凝胶染色试剂采用低毒性的染色试剂GelRed,安全可靠。本发明开发的分子标记可广泛应用于水稻抗稻瘟病基因Pi25的分子标记辅助选择育种和水稻种质资源的筛选鉴定。
附图说明
图1Pi25基因SNP2687位点设计的引物对检测结果。
M:DNA Marker1;1:谷梅2号;2:中156;3:Tetep;R1、R2和R3引物对:抗性特异片段以抗性等位基因序列为内引物的上游序列,与外引物的下游序列配对,扩增而得;F1、F2和F3引物对:抗性特异片段以抗性等位基因序列为内引物的下游序列,与外引物的上游序列配对,扩增而得;每个引物对设置了50℃、53℃、55℃和58℃等4个退火温度。
图2标记Pi25-2687和Pi25-2566在部分水稻品种中的检测结果。
M:DNA Marker1;1:谷梅2号;2:中156;3:Tetep;4:中鉴100;5:谷梅4号;6:丽江新团黑谷(LTH);7:LTH-Piz;8:LTH-Pizt;9:LTH-Pi2;10:LTH-Pi9。
图3标记Pi25-2687在选育的水稻恢复系和杂交稻组合中的检测结果。
M:DNA Marker1;+:谷梅2号;-:中156;1~12:选育的水稻恢复系;13~17:选育的杂交稻组合;R:抗稻瘟病;MR:中抗稻瘟病;MS:中感稻瘟病;S:感稻瘟病。
图4标记Pi25-2687在94份水稻种质资源中的检测结果。
M:DNA Marker1;+:谷梅2号;-:中156;1~94:94份水稻品种。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1抗稻瘟病基因Pi25功能特异性PCR分子标记引物的筛选
1.Pi25基因功能特异性PCR分子标记引物的设计
引物设计的基本原理源自四引物扩增受阻突变体系PCR标记(Ye et al.,2001),与特异性共显性PCR标记(专利号:ZL 201610014679.9,为便于描述,以下称之为标记Pi25-2566)的引物设计原理相似,但作了如下修改:
(1)外引物:Pi25基因全长2775bp,SNP775和SNP2687临近基因的首尾两端。为获得抗/感两种等位基因特异性片段以及共有片段的理想扩增效果,对谷梅2号(抗病)和中156(感病)的基因及其上下游200~300bp进行测序,以此作为序列模板,设计外引物。
(2)内引物:为获得抗/感两种等位基因特异性片段的最佳扩增效果,针对SNP775和SNP2687这两个抗/感特异的SNPs,在内引物的3'端倒数第2~4位人为引入1~2个错配碱基。此外,采用双向交叉法,将抗性等位基因SNP两侧序列分别作为内引物的上游序列和下游序列,与外引物的下游和上游序列配对,以扩增抗病特异片段;反之,也将感病等位基因SNP两侧序列分别作为内引物的上游和下游序列,与外引物的下游和上游序列配对,以扩增感病特异片段,选取效果最佳者作为最终内引物组合
2.DNA微量提取
(1)剪取水稻幼苗叶片2~3cm,剪成0.5cm长的碎片,放入2.0mL离心管中。
(2)加入400μL DNA提取液和一颗小钢珠,应用组织研磨仪(Qiagen))进行研磨。
(3)加入400μL氯仿萃取液,盖紧盖子,上下颠倒混匀。
(4)11,000rpm离心2分钟至清晰分相,吸取300μL上清液,转入新的1.5mL离心管中。
(5)加入600μL预冷的无水乙醇,盖紧盖子,上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。
(6)11,000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部,弃上清液,用70%乙醇洗涤沉淀2遍,将1.5mL离心管倒置于纸上,自然干燥。
(7)加入100μL的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。
3.PCR扩增及检测
(1)扩增反应体系:2×Taq MasterMix(含染料,康为世纪)7.5μL,引物(10μM)各0.3μL,DNA模板(谷梅2号、中156和Tetep)1μL,ddH2O 5.3μL,总体积15.0μL。
(2)反应条件:94℃2分钟;94℃30秒,退火温度梯度(50℃、53℃、55℃和58℃)30秒,72℃30秒,30循环;72℃5分钟。
(3)取3μL PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶,分子量标准为DNA Maker1(天根)。接通电极,在120V恒定电压下电泳1小时,关闭电源。
(4)经高灵敏、低毒性的荧光核酸凝胶染色试剂GelRed(Biotium)染色后凝胶成像。
4.结果分析
经测试,SNP775设计的引物组合存在明显的偏扩增现象,只能获得一种等位基因特异片段,而SNP2687设计的多个引物组合可以在谷梅2号、中156和Tetep中扩增出预期产物,其中以R3组合的效果最佳,在50℃、53℃和55℃条件下均能扩增出预期产物,且条带清晰、明亮和均匀(图1)。遂将该引物组合选为SNP2687特异PCR标记Pi25-2687的引物对,四条引物的具体信息如下:
外引物上游序列为5'-CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA-3';
外引物下游序列为5'-ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC-3';
内引物上游序列为其中下划线为SNP2680和SNP2687上抗性等位基因的碱基,红色字体为错配碱基;
内引物下游序列为其中下划线为SNP2687上感病等位基因的互补碱基,红色字体为错配碱基。
扩增产物中,318bp条带为谷梅2号特有,代表Pi25抗性特异片段;196bp条带为中156和Tetep特有,代表pi25感病特异片段;469bp条带三者共有,代表扩增阳性的非特异性片段。
实施例2Pi25-2687检测Pi25基因型的准确性验证
如前所述,ZL 201610014679.9开发的Pi25特异性PCR标记Pi25-2566是针对SNP2566位点,本申请专利设计开发的Pi25特异性PCR标记Pi25-2687是针对SNP2687位点,为验证两者在已知基因型材料的检测效果,应用实施例1中描述的方法,分别利用Pi25-2687和Pi25-2566的引物对进行扩增和电泳检测,其中:
对于Pi25-2687,扩增反应体系如下:2×Taq MasterMix(含染料,康为世纪)7.5μL,引物(10μM)各0.3μL,DNA模板1.0μL,ddH2O 5.3μL,总体积15.0μL。反应条件:94℃2分钟;94℃30秒,53℃30秒,72℃30秒,30循环;72℃5分钟。
对于Pi25-2566,扩增反应体系如下:2×Taq MasterMix(含染料,康为世纪)7.5μL,引物PF和PR(10μM)各0.3μL,引物NF和NR(10μM)各0.45μL,DNA模板1.0μL,ddH2O 5.0μL,总体积15.0μL。反应条件:94℃2分钟;94℃30秒,56℃30秒,72℃30秒,30循环;72℃5分钟。
结果显示,应用Pi25-2687检测到与谷梅2号呈现一样带型的材料有:谷梅4号和LTH-Pi2(以LTH为轮回亲本,携带抗稻瘟病基因Pi2的近等基因系),而应用Pi25-2566检测到与谷梅2号呈现一样带型的材料有:Tetep、谷梅4号和LTH-Pi2(图2)。该结果与王惠梅等(2012)的结果吻合,即:利用SNP位点2687设计的CAPS标记CAP3/Hpy 99I检测到C101A51(抗稻瘟病基因Pi2供体)、G19和谷梅4号呈现与谷梅2号一样的带型;而利用SNP位点2566设计的CAPS标记CAP3/Bgl II检测到C101A51、Tetep、G19和谷梅4号呈现与谷梅2号一样的带型。
结果表明,本发明提供的分子标记Pi25-2687对Pi25等位基因的检测准确可靠,可以用于Pi25基因的分型鉴定。
实施例3Pi25-2687的功能特异性验证
应用分子标记辅助选择培育的12份水稻恢复系以及5份杂交稻组合,于2021年在福建省龙岩市上杭县稻瘟病病区进行抗性鉴定,试验方法和抗性评价分级标准参照国家水稻品种区试办法。
试验感病对照品种的稻瘟病综合指数为8.5,抗性评价为高感,表明试验有效。12份恢复系中,9号和11号材料Pi25特异分子标记Pi25-2687检测为纯合感病基因型,稻瘟病综合指数分别为6.25和5.75,抗性评价分别为感和中感;其余10份材料的分子标记检测均为纯合抗性基因型,稻瘟病综合指数在1.5~3.0范围,抗性评价为抗和中抗(图3)。5份杂交稻组合的分子标记检测结果均为杂合基因型,其稻瘟病综合指数在1.25~2.0范围,抗性评价均为抗(图3)。
结果表明,本发明提供的分子标记Pi25-2687是与稻瘟病抗性水平直接相关的功能标记,可以应用于Pi25基因的分子标记辅助育种,筛选和鉴定抗稻瘟病品种,提高水稻育种效率。
实施例4 Pi25-2687在水稻种质资源中的应用
利用Pi25基因功能特异性分子标记Pi25-2687,对94份来自国外的水稻品种(表1)进行基因型检测。结果显示,仅有2份材料携带谷梅2号抗性等位基因,分别为序号13,来自哥伦比亚的5173和序号66,来自巴拿马的PANAMA 1537(图4)。说明,Pi25抗性等位基因在国外水稻种质中频率较低,分布较少,这2份新发现的水稻材料同样可以作为Pi25基因的供体亲本应用于抗稻瘟病分子育种。
表1 94份水稻种质资源
表1(续)94份水稻种质资源
参考文献
Chen J.,Shi Y.,Liu W.,Chai R.,Fu Y.,Zhuang J.,Wu J.A Pid3 allele fromrice cultivar Gumei2 confers resistance to Magnaporthe oyyzae.J GenetGenomics,2011,38:209-216.
Ye S.,Dhillon S.,Ke X.,Collins A.R.,Day I.N.M.An efficient procedurefor genotyping single nucleotide polymorphisms.Nucleic Acids Research,2001,29(17):e88.
王惠梅,陈洁,施勇烽,潘刚,沈海超,吴建利。稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证。作物学报,2012,38(11):1960-1968.
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
cacacctgaa tgaaattaag atgaca 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
atatacaata ttgagggtat ggaac 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 3
gcttgtggat agagtccttc g 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 4
tcacaaatca ttcgctcttt taact 25
Claims (3)
1.检测水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记Pi25-2687的引物,所述引物为:
外引物上游序列为5'-CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA-3',如序列表SEQ ID No:1所示;
外引物下游序列为5'-ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC-3',如序列表SEQ ID NO:2所示;
内引物上游序列为5'-GCTTGTGGATAGAGTCCTTCG-3',如序列表SEQ ID No:3所示;
内引物下游序列为5'-TCACAAATCATTCGCTCTTTTAACT-3',如序列表SEQ ID NO:4所示。
2.权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记Pi25-2687的引物检测水稻抗稻瘟病基因Pi25基因型的方法,特征在于:
(1)采用待检测样本的基因组DNA为模板,应用权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记的引物进行PCR扩增;
(2)采用2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物;
(3)根据电泳结果判定Pi25的基因型:能够检测到469 bp和318 bp条带的为Pi25纯合抗性基因型;检测到469 bp和196 bp条带的为pi25纯合感病基因型;同时检测到469 bp、318 bp和196 bp条带的为杂合基因型。
3.权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记Pi25-2687的引物在水稻抗稻瘟病基因Pi25的分子标记辅助选择育种和水稻种质资源的筛选鉴定中的应用。
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