CN114736981B - 水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用，特征在于其引物。利用该标记对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增和琼脂糖电泳，可以检测待测材料是否携带水稻抗稻瘟病等位基因Pi25，操作简单、安全经济、且准确性高、特异性强，可应用于水稻抗稻瘟病基因Pi25的分子标记辅助选择育种以及水稻种质资源筛选鉴定。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用。

背景技术

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一，种植抗稻瘟病水稻品种是解决该问题最经济有效的手段。优异抗性基因的挖掘和利用是培育抗稻瘟病水稻品种的前提条件。

Pi25是来源于我国四川籼稻品种谷梅2号中的一个广谱、持久抗稻瘟病基因(Chenet al.,2011)。鉴于Pi25基因的重大利用价值，申请人开发了多个用于检测Pi25的分子标记。但随着技术的发展和需求的提高，这些标记也暴露出一些不足之处。比如：1)SK17(专利号：ZL 200310100888.8)、SA7(专利号：ZL 200310100889.2)以及Si13068、Si13070B2、Si13070C和Si13070D(专利号：ZL 200910155609.5)等标记均为Pi25基因连锁的PCR标记，虽然操作简便，但其准确性略低于基因标记或功能标记；2)P25-1(专利号：ZL200910152617.4)是基于基因编码区1个单核苷酸多态性(SNP)设计的特异性PCR标记，但其为显性标记，无法区分抗性纯合和杂合基因型；3)CAP1/Hinc II、CAP3/Bgl II、CAP3/Nde I和CAP3/Hpy 99I等标记(王惠梅等，2012)是基于基因编码区多个SNPs设计的共显性特异分子标记，但其属于CAPS标记，在操作中需要对PCR产物进行酶切，简便性不如PCR标记。

近几年，基于Pi25基因编码区的SNPs，研究者也开发了特异SNP共显性PCR分子标记(专利号：ZL 201610014679.9)和竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分子标记(专利号：202011457366.3)。前者SNP位于ATG启动子后2566bp(以下简称为SNP2566)，抗性等位基因型为c，感病等位基因型为g；后者SNPs位于ATG启动子后775bp和2687bp(以下简称为SNP775和SNP2687)，抗性等位基因型均为g，感病等位基因型均为a。根据王惠梅等(2012)的报道，Tetep等位基因虽然在SNP2566上具有和抗性等位基因谷梅2号相同的碱基序列c，但是在SNP775和SNP2687上则具有和感病等位基因中鉴100相同的碱基序列a，并且Tetep的全长编码序列均比谷梅2号和中鉴100短了312bp，表明Tetep等位基因有别于谷梅2号抗性等位基因。因此，仅利用SNP2566开发的分子标记可能会导致将Tetep等位基因型误判为谷梅2号抗性等位基因型。而基于SNP775和SNP2687开发的KASP标记尽管可以区分Tetep等位基因型和谷梅2号等位基因型，但操作中需要在引物合成时人为添加荧光标记，且仪器昂贵，检测成本明显偏高。

为精确、简便且经济地鉴定Pi25的谷梅2号抗性等位基因，本发明针对谷梅2号编码区内特有的功能SNPs(SNP775和SNP2687)，开发共显性PCR分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供鉴定抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其检测方法。

本发明通过以下技术方案实现：

以抗稻瘟病基因Pi25的SNP775和SNP2687位点为靶目标，分别以谷梅2号抗性等位基因和中156感病等位基因(Chen et al.,2011)及其上下游约200bp的核苷酸序列为模板，设计不同错配类型的四引物扩增受阻突变体系PCR标记引物对。利用谷梅2号、中156和Tetep检测PCR扩增效果，筛选出扩增效率和特异性俱佳的引物对，并对已知基因型的10份水稻品种进行基因型验证，应用该分子标记对17份选育的水稻恢复系/杂交稻组合进行基因型和表型的功能验证，进一步应用于94份水稻种质资源的基因型检测。

四条引物的具体序列如下：

外引物上游序列为5'-CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA-3'，如序列表SEQ ID No:1所示；

外引物下游序列为5'-ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC-3'，如序列表SEQ ID NO:2所示；

内引物上游序列为5'-GCTTGTGGATAGAGTCCTTCG-3'，如序列表SEQ ID No:3所示；

内引物下游序列为5'-TCACAAATCATTCGCTCTTTTAACT-3'，如序列表SEQ ID NO:4所示。

采用上述特异性分子标记检测Pi25基因型的方法如下：

(1)采用待检测样本的基因组DNA为模板，应用Pi25基因功能特异性分子标记的引物对进行PCR扩增，反应体系为：2×Taq MasterMix 7.5μL，引物(10μM)各0.3μL,DNA模板1.0μL，ddH₂O 5.3μL，总体积15.0μL；反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30循环；72℃5分钟。

(2)采用2％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。

(3)根据电泳结果判定Pi25的基因型：能够检测到469bp和318bp条带的为Pi25纯合抗性基因型；检测到469bp和196bp条带的为pi25纯合感病基因型；同时检测到469bp、318bp和196bp条带的为杂合基因型。

与现有技术相比，本发明具有如下明显的有益效果：

本发明开发的分子标记源自基因内部功能特异性SNP，能准确检测水稻材料不同Pi25等位基因型，尤其是能鉴别区分谷梅2号和Tetep等位基因型；PCR扩增采用常规方法，操作便捷，成本低廉；核酸凝胶染色试剂采用低毒性的染色试剂GelRed，安全可靠。本发明开发的分子标记可广泛应用于水稻抗稻瘟病基因Pi25的分子标记辅助选择育种和水稻种质资源的筛选鉴定。

附图说明

图1Pi25基因SNP2687位点设计的引物对检测结果。

M：DNA Marker1；1：谷梅2号；2：中156；3：Tetep；R1、R2和R3引物对：抗性特异片段以抗性等位基因序列为内引物的上游序列，与外引物的下游序列配对，扩增而得；F1、F2和F3引物对：抗性特异片段以抗性等位基因序列为内引物的下游序列，与外引物的上游序列配对，扩增而得；每个引物对设置了50℃、53℃、55℃和58℃等4个退火温度。

图2标记Pi25-2687和Pi25-2566在部分水稻品种中的检测结果。

M：DNA Marker1；1：谷梅2号；2：中156；3：Tetep；4：中鉴100；5：谷梅4号；6：丽江新团黑谷(LTH)；7：LTH-Piz；8：LTH-Pizt；9：LTH-Pi2；10：LTH-Pi9。

图3标记Pi25-2687在选育的水稻恢复系和杂交稻组合中的检测结果。

M：DNA Marker1；+：谷梅2号；-：中156；1～12：选育的水稻恢复系；13～17：选育的杂交稻组合；R：抗稻瘟病；MR：中抗稻瘟病；MS：中感稻瘟病；S：感稻瘟病。

图4标记Pi25-2687在94份水稻种质资源中的检测结果。

M：DNA Marker1；+：谷梅2号；-：中156；1～94：94份水稻品种。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1抗稻瘟病基因Pi25功能特异性PCR分子标记引物的筛选

1.Pi25基因功能特异性PCR分子标记引物的设计

引物设计的基本原理源自四引物扩增受阻突变体系PCR标记(Ye et al.,2001),与特异性共显性PCR标记(专利号：ZL 201610014679.9，为便于描述，以下称之为标记Pi25-2566)的引物设计原理相似，但作了如下修改：

(1)外引物：Pi25基因全长2775bp，SNP775和SNP2687临近基因的首尾两端。为获得抗/感两种等位基因特异性片段以及共有片段的理想扩增效果，对谷梅2号(抗病)和中156(感病)的基因及其上下游200～300bp进行测序，以此作为序列模板，设计外引物。

(2)内引物：为获得抗/感两种等位基因特异性片段的最佳扩增效果，针对SNP775和SNP2687这两个抗/感特异的SNPs，在内引物的3'端倒数第2～4位人为引入1～2个错配碱基。此外，采用双向交叉法，将抗性等位基因SNP两侧序列分别作为内引物的上游序列和下游序列，与外引物的下游和上游序列配对，以扩增抗病特异片段；反之，也将感病等位基因SNP两侧序列分别作为内引物的上游和下游序列，与外引物的下游和上游序列配对，以扩增感病特异片段，选取效果最佳者作为最终内引物组合

2.DNA微量提取

(1)剪取水稻幼苗叶片2～3cm，剪成0.5cm长的碎片，放入2.0mL离心管中。

(2)加入400μL DNA提取液和一颗小钢珠，应用组织研磨仪(Qiagen))进行研磨。

(3)加入400μL氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。

(4)11,000rpm离心2分钟至清晰分相，吸取300μL上清液，转入新的1.5mL离心管中。

(5)加入600μL预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。

(6)11,000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL离心管倒置于纸上，自然干燥。

(7)加入100μL的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。

3.PCR扩增及检测

(1)扩增反应体系：2×Taq MasterMix(含染料，康为世纪)7.5μL，引物(10μM)各0.3μL,DNA模板(谷梅2号、中156和Tetep)1μL，ddH₂O 5.3μL，总体积15.0μL。

(2)反应条件：94℃2分钟；94℃30秒，退火温度梯度(50℃、53℃、55℃和58℃)30秒，72℃30秒，30循环；72℃5分钟。

(3)取3μL PCR产物上样于2％琼脂糖凝胶，分子量标准为DNA Maker1(天根)。接通电极，在120V恒定电压下电泳1小时，关闭电源。

(4)经高灵敏、低毒性的荧光核酸凝胶染色试剂GelRed(Biotium)染色后凝胶成像。

4.结果分析

经测试，SNP775设计的引物组合存在明显的偏扩增现象，只能获得一种等位基因特异片段，而SNP2687设计的多个引物组合可以在谷梅2号、中156和Tetep中扩增出预期产物，其中以R3组合的效果最佳，在50℃、53℃和55℃条件下均能扩增出预期产物，且条带清晰、明亮和均匀(图1)。遂将该引物组合选为SNP2687特异PCR标记Pi25-2687的引物对，四条引物的具体信息如下：

外引物上游序列为5'-CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA-3'；

外引物下游序列为5'-ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC-3'；

内引物上游序列为其中下划线为SNP2680和SNP2687上抗性等位基因的碱基，红色字体为错配碱基；

内引物下游序列为其中下划线为SNP2687上感病等位基因的互补碱基，红色字体为错配碱基。

扩增产物中，318bp条带为谷梅2号特有，代表Pi25抗性特异片段；196bp条带为中156和Tetep特有，代表pi25感病特异片段；469bp条带三者共有，代表扩增阳性的非特异性片段。

实施例2Pi25-2687检测Pi25基因型的准确性验证

如前所述，ZL 201610014679.9开发的Pi25特异性PCR标记Pi25-2566是针对SNP2566位点，本申请专利设计开发的Pi25特异性PCR标记Pi25-2687是针对SNP2687位点，为验证两者在已知基因型材料的检测效果，应用实施例1中描述的方法，分别利用Pi25-2687和Pi25-2566的引物对进行扩增和电泳检测，其中：

对于Pi25-2687，扩增反应体系如下：2×Taq MasterMix(含染料，康为世纪)7.5μL，引物(10μM)各0.3μL,DNA模板1.0μL，ddH₂O 5.3μL，总体积15.0μL。反应条件：94℃2分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30循环；72℃5分钟。

对于Pi25-2566，扩增反应体系如下：2×Taq MasterMix(含染料，康为世纪)7.5μL，引物PF和PR(10μM)各0.3μL,引物NF和NR(10μM)各0.45μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 5.0μL，总体积15.0μL。反应条件：94℃2分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，30循环；72℃5分钟。

结果显示，应用Pi25-2687检测到与谷梅2号呈现一样带型的材料有：谷梅4号和LTH-Pi2(以LTH为轮回亲本，携带抗稻瘟病基因Pi2的近等基因系)，而应用Pi25-2566检测到与谷梅2号呈现一样带型的材料有：Tetep、谷梅4号和LTH-Pi2(图2)。该结果与王惠梅等(2012)的结果吻合，即：利用SNP位点2687设计的CAPS标记CAP3/Hpy 99I检测到C101A51(抗稻瘟病基因Pi2供体)、G19和谷梅4号呈现与谷梅2号一样的带型；而利用SNP位点2566设计的CAPS标记CAP3/Bgl II检测到C101A51、Tetep、G19和谷梅4号呈现与谷梅2号一样的带型。

结果表明，本发明提供的分子标记Pi25-2687对Pi25等位基因的检测准确可靠，可以用于Pi25基因的分型鉴定。

实施例3Pi25-2687的功能特异性验证

应用分子标记辅助选择培育的12份水稻恢复系以及5份杂交稻组合，于2021年在福建省龙岩市上杭县稻瘟病病区进行抗性鉴定，试验方法和抗性评价分级标准参照国家水稻品种区试办法。

试验感病对照品种的稻瘟病综合指数为8.5，抗性评价为高感，表明试验有效。12份恢复系中，9号和11号材料Pi25特异分子标记Pi25-2687检测为纯合感病基因型，稻瘟病综合指数分别为6.25和5.75，抗性评价分别为感和中感；其余10份材料的分子标记检测均为纯合抗性基因型，稻瘟病综合指数在1.5～3.0范围，抗性评价为抗和中抗(图3)。5份杂交稻组合的分子标记检测结果均为杂合基因型，其稻瘟病综合指数在1.25～2.0范围，抗性评价均为抗(图3)。

结果表明，本发明提供的分子标记Pi25-2687是与稻瘟病抗性水平直接相关的功能标记，可以应用于Pi25基因的分子标记辅助育种，筛选和鉴定抗稻瘟病品种，提高水稻育种效率。

实施例4 Pi25-2687在水稻种质资源中的应用

利用Pi25基因功能特异性分子标记Pi25-2687，对94份来自国外的水稻品种(表1)进行基因型检测。结果显示，仅有2份材料携带谷梅2号抗性等位基因，分别为序号13，来自哥伦比亚的5173和序号66，来自巴拿马的PANAMA 1537(图4)。说明，Pi25抗性等位基因在国外水稻种质中频率较低，分布较少，这2份新发现的水稻材料同样可以作为Pi25基因的供体亲本应用于抗稻瘟病分子育种。

表1 94份水稻种质资源

表1(续)94份水稻种质资源

参考文献

Chen J.,Shi Y.,Liu W.,Chai R.,Fu Y.,Zhuang J.,Wu J.A Pid3 allele fromrice cultivar Gumei2 confers resistance to Magnaporthe oyyzae.J GenetGenomics,2011,38:209-216.

Ye S.,Dhillon S.,Ke X.,Collins A.R.,Day I.N.M.An efficient procedurefor genotyping single nucleotide polymorphisms.Nucleic Acids Research,2001,29(17):e88.

王惠梅，陈洁，施勇烽，潘刚，沈海超，吴建利。稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证。作物学报，2012,38(11):1960-1968.

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

cacacctgaa tgaaattaag atgaca 26

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atatacaata ttgagggtat ggaac 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

gcttgtggat agagtccttc g 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

tcacaaatca ttcgctcttt taact 25

Claims (3)

1.检测水稻抗稻瘟病基因Pi25的功能特异性PCR分子标记Pi25-2687的引物，所述引物为：

外引物上游序列为5'-CACACCTGAATGAAATTAAGATGACA-3'，如序列表SEQ ID No:1所示；

外引物下游序列为5'-ATATACAATATTGAGGGTATGGAAC-3'，如序列表SEQ ID NO:2所示；

内引物上游序列为5'-GCTTGTGGATAGAGTCCTTCG-3'，如序列表SEQ ID No:3所示；

内引物下游序列为5'-TCACAAATCATTCGCTCTTTTAACT-3'，如序列表SEQ ID NO:4所示。

2.权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记Pi25-2687的引物检测水稻抗稻瘟病基因Pi25基因型的方法，特征在于：

（1）采用待检测样本的基因组DNA为模板，应用权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记的引物进行PCR扩增；

（2）采用2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物；

（3）根据电泳结果判定Pi25的基因型：能够检测到469 bp和318 bp条带的为Pi25纯合抗性基因型；检测到469 bp和196 bp条带的为pi25纯合感病基因型；同时检测到469 bp、318 bp和196 bp条带的为杂合基因型。

3.权利要求1所述的功能特异性PCR分子标记Pi25-2687的引物在水稻抗稻瘟病基因Pi25的分子标记辅助选择育种和水稻种质资源的筛选鉴定中的应用。