CN109913580B

CN109913580B - 一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用

Info

Publication number: CN109913580B
Application number: CN201910362959.2A
Authority: CN
Inventors: 韦新宇; 曾跃辉; 黄建鸿; 张锐; 尚伟
Original assignee: SANMING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: SANMING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN109913580A

Abstract

一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，其以待鉴定水稻单株材料的DNA为模板；用该分子标记对DNA进行PCR扩增获得扩增产物；利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对该扩增产物进行凝胶电泳分离分析，通过核酸染料染色观察，出现不同分子量大小的带型；若带型中存在与分子标记对应的特异性条带，则待鉴定水稻单株为含有稻瘟病抗性基因的植株。本发明的分子标记在苗期即可对水稻育种材料是否含有稻瘟病抗性基因进行准确高效的鉴定，有效解决了常规育种方法中存在的育种周期长、选择效率低、鉴定不准确和易受环境影响等问题。

Description

一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用

技术领域

本发明涉及水稻遗传育种和分子生物学领域，尤其是指一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用。

背景技术

水稻是全球最重要的粮食作物之一，养育着世界一半以上的人口。随着水稻常规育种策略的改良和分子育种技术的不断完善，水稻的产量水平也逐渐提高，但水稻病虫害的持续发生阻碍了水稻在育种上的进一步发展，其中，病害造成水稻产量的损失大约超过30%以上，尤其以稻瘟病表现极为严重。由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是水稻最具有毁灭性地病害之一，发生在全国乃至全世界各个稻区，对水稻的种植和生产造成了严重的影响。

当前，防治稻瘟病的一般策略是化学防治和培育抗性品种。化学防治虽然可发挥一定的作用，但往往造成农民种粮成本提高，并且在多次使用后药效会大幅降低，同时会造成环境的污染，对人类有潜在的危害。选育和种植抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的措施，也符合人类对绿色食品的要求，但同时由于稻瘟病病菌生理小种变异频繁以及不同水稻品种对不同的生理小种具有很强的专一性，导致有些单一的抗病品种在种植3-5年后逐渐丧失抗病特性，因此挖掘和利用广谱抗性基因成为选育具有持久抗稻瘟病特性水稻品种最经济有效的方法。同时在生态安全和环境保护方面也具有重要的意义。目前已经报道从不同的水稻品种中分离得到至少有80多个抗稻瘟病主效基因，其中20多个基因已经被成功克隆，但具有广谱抗性的基因很少。

另一方面，传统的水稻稻瘟病抗性育种存在费时、费力、准确性差且易受环境因素影响的弊端。目前，随着分子生物学的发展，基于分子标记辅助选择技术的分子标记辅助育种，利用分子标记与抗稻瘟病目标基因紧密连锁的特点，可在实验室内通过直接检测连锁的分子标记，即可判断目标基因的存在和状态，达到选择目标性状的目的，且在水稻苗期即可检测，具有检测时期早、检测速度快、结果准确并且不受环境条件干扰的优点。因此，挖掘新的具有广谱抗稻瘟病特性的优良基因，并且发展与之紧密连锁的分子标记成为进一步开展水稻稻瘟病抗性育种的关键。

发明内容

本发明提供一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，其主要目的在于开发一种分子标记，能够用于水稻稻瘟病抗性基因的鉴定和水稻抗病品种后代的辅助选择育种，并且利用该分子标记在苗期即可以有效区分抗病水稻材料杂交选育后代中是否含有广谱抗稻瘟病基因，从而克服常规水稻稻瘟病抗性育种方法中周期长，效率低，不准确且易受坏境因素影响的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，用于水稻稻瘟病抗性基因的鉴定，所述鉴定包括如下步骤：

a) 以待鉴定水稻单株材料的DNA为模板；

b) 用所述分子标记对步骤a）中的DNA进行PCR扩增获得扩增产物；

c) 利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对步骤b）中的扩增产物进行凝胶电泳分离分析，通过核酸染料染色观察，出现不同分子量大小的带型；

d) 若所述带型中存在与所述分子标记对应的特异性条带，则所述待鉴定水稻单株为含有稻瘟病抗性基因的植株。

进一步的，步骤b）中，所述PCR扩增的反应体系按总体积10μL计，包括如下各组分：5.0μL PCR MasterMix、0.5μL 正向引物、0.5μL 反向引物、0.8μL DNA、3.2μL ddH₂O。

进一步的，步骤b）中，所述PCR扩增的反应条件为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30S，55℃复性30S，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

进一步的，步骤c中，所述8%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配置方法：按总体积30μL计，包括如下各组分：23.4mL ddH₂O、6mL 40%丙烯酰胺、0.3mL 50×CTAB、0.3mL APS、24.9μLTEMED。

和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:

本发明开发获得的分子标记，用于检测含有的稻瘟病抗性基因，对稻瘟病具有很强的抗性，且抗性稳定，抗谱广，本发明的分子标记在苗期即可对水稻育种材料是否含有稻瘟病抗性基因进行准确高效的鉴定，有效解决了常规育种方法中存在的育种周期长、选择效率低、鉴定不准确和易受环境影响等问题。

附图说明

图1为本发明中SSR分子标记和插入缺失InDel标记与水稻稻瘟病抗性基因Pi-kf2（t）间的遗传连锁图谱及遗传距离示意图。

图2为本发明中连锁分子标记及水稻抗稻瘟病基因Pi-kf2（t）在染色体上的实际物理位置示意图，标记下方括号里面的数字表示相应连锁标记在220个F2感病群体基因型检测过程中发生的交换单株个数。

图3为插入缺失标记InDel-19对45个F2感病单株的基因型检测和连锁分析；图中，1：抗病亲本康丰B（KFB）；2：感病亲本丽江新团黑谷（LTH）；3：抗病基因池（RP）；4：感病基因池（SP）；S：45个F2感病单株。

图4 为插入缺失标记InDel-25对45个F2感病单株的基因型检测和连锁分析；图中，1：抗病亲本康丰B（KFB）；2：抗病基因池（RP）；3：感病亲本丽江新团黑谷（LTH）；4：感病基因池（SP）；S：45个F2感病单株。

图5为插入缺失标记InDel-27对45个F2感病单株的基因型检测和连锁分析1：抗病亲本康丰B（KFB）；2：抗病基因池（RP）；3：感病亲本丽江新团黑谷（LTH）；4：感病基因池（SP）；S：45个F2感病单株。

图6为插入缺失标记InDel-19对康丰B/日本晴杂交F2分离后代5个抗病和5个感病单株的验证；图中，1：抗病亲本康丰B（KFB）；2：感病亲本日本晴；R：F2分离后代抗病单株；S：F2分离后代感病单株。

图7为插入缺失标记InDel-25对康丰B/日本晴杂交F2分离后代5个抗病和5个感病单株的验证；图中，1：抗病亲本康丰B（KFB）；2：感病亲本日本晴；R：F2分离后代抗病单株；S：F2分离后代感病单株。

图8为插入缺失标记InDel-27对康丰B/日本晴杂交F2分离后代5个抗病和5个感病单株的验证；图中，1：抗病亲本康丰B（KFB）；2：感病亲本日本晴；R：F2分离后代抗病单株；S：F2分离后代感病单株。

具体实施方式

下面参照附图说明本发明的具体实施方式。

实施例一

一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记，该分子标记是由与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的插入缺失InDel位点开发转化而来。所述分子标记引物包含正向和反向引物对，其核苷酸序列分别如下：

InDel-19 正向：5’AAGGAGATCTGGTATGTGTGCG 3’；

InDel-19 反向：5’AGTTTGGGGTAGTGAAATGCGA 3’；

InDel-25 正向：5’CCTGGTCTAAAGCGCACCTA 3’；

InDel-25 反向：5’CGCCATGGATTCGTTCGACT 3’；

InDel-27 正向：5’TCGGTGCTTTAGATATGTTTTGCT 3’；

InDel-27 反向：5’ACAACTCAAACCAAGCTTCTCA 3’。

其含有的稻瘟病抗性基因对稻瘟病具有很强的抗性，且抗性稳定，抗谱广。

具体的，该分子标记定位在水稻第6号染色体上，位于Pi2/Pi9复等位基因簇区域内，和Pi2/Pi9复等位基因等位或紧密连锁，因此本发明开发的分子标记可同时作为这些复等位抗病基因的紧密连锁标记，从而能够在水稻抗性育种中可用于Pi2/Pi9基因的分子标记辅助选择或多个抗性基因的聚合育种。

参照图1、图2、图3、图4和图5。一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的制备方法，包括以下步骤：

（一）以具有抗稻瘟病特性的水稻品种为父本，感病品种为母本，构建一个用于稻瘟病抗性基因定位的F2分离群体；

本实施例中，以三明市农业科学研究院自主选育的具有特殊核遗传背景的三系不育保持系抗稻瘟病水稻品种康丰B（KFB）为父本，以感病品种丽江新团黑谷（LTH）为母本进行杂交获得F1，F1自交后获得F2分离群体。在该F2分离群体秧苗3-4叶期进行稻瘟病病菌人工注射接菌，接菌后放入24-26℃恒温培养箱暗培养24h，相对湿度95-100%，然后移入25℃温室内培养8-10天后，观察并统计其发病情况，从该群体后代中鉴定得到220个感病单株用于连锁关系的分析。

（二）从F2分离群体中随机选取至少10个极端抗病单株和至少10个极端感病单株分别构建抗病基因池（RP）和感病基因池（SP）；

本实施例中，从F2分离群体中随机选取15个极端抗病单株和15个极端感病单株，再用改良的CTAB法分别提取其叶片基因组DNA，采用DU800分光光度计测其浓度，并统一稀释为50ng/μL，将稀释后的15个抗病单株DNA和15个感病单株DNA分别等量混合构成抗病基因池和感病基因池用于连锁分析。

（三）采用改良的CTAB法分别提取两亲本幼苗及两亲本杂交后代幼苗的基因组DNA；即提取康丰B（KFB）、丽江新团黑谷（LTH）、F1及F2单株叶片基因组DNA，具体步骤如下：

1) 称取0.1g水稻叶片置于液氮中研磨成粉末并转移至2.0ml离心管中；

2) 往所述2.0ml离心管中加入800μL CTAB提取液，轻轻振荡至充分混匀，放置水浴锅中65℃温浴30min；

3) 把步骤2）制得的从水浴锅中取出冷却至室温后，加入氯仿：异戊醇为24:1的混合液600μL，上下晃动充分混匀，获得混合液；

4) 将所述混合液以12000rpm离心10min，再将该混合液的上清液转移至1.5mL 离心管中；

5) 往所述1.5mL 离心管中加入体积为所述上清液2倍的预冷好的异丙醇，轻轻晃动混匀至可见DNA絮状沉淀产生；

6) 将所述1.5mL 离心管放置离心机中以5000rpm离心3min，弃上清；

7) 往所述1.5mL 离心管加入75%的乙醇500μL清洗，再以5000rpm离心3min，弃上清；

8) 重复步骤7），获得洗涤好的DNA；

9) 将所述洗涤好的DNA放置超净台吹干并溶于200μL高压ddH₂O，放置4℃冰箱保存备用。

（四）根据水稻生物信息学数据库（http://archive.gramene.org/markers/microsat）公开发布的SSR分子标记，通过筛选两亲本及两基因池间多态性，获得和稻瘟病抗性基因连锁的分子标记，从而对稻瘟病抗性基因进行初步定位；

具体的，结合连锁分析软件Mapmaker/EXP 3.0进一步对步骤（一）中的F2感病群体进行基因型鉴定和连锁分析，并通过Kosambi运算函数将重组率转化为相对遗传距离，获得和目标基因连锁的分子标记Rm19776，Rm19781，Rm527，Rm7213，Rm5850和Rm7311，将稻瘟病抗性基因进行初步定位在Rm527和Rm7213之间，这些标记在对220个F2感病群体检测过程中共出现了45个交换重组单株，和目标基因均存在一定的遗传距离；

（五）比对已完成全基因组测序的粳稻和籼稻两亚种在步骤（四）中已初步定位的染色体区域内的基因组序列多态性，再对与稻瘟病抗性相关基因进行精细定位，从而获得和抗稻瘟病基因紧密连锁的插入缺失InDel位点，再将该插入缺失InDel位点利用PrimerPremier 5.0软件设计并转化为相关特异性插入缺失InDel分子标记。

本实施例中，为了开发相关分子标记将目标基因进一步进行精细定位，比对粳稻日本晴和籼稻9311两亚种在步骤（四）中已初步定位的染色体区域内的基因组序列多态性，获得和抗稻瘟病基因紧密连锁的插入缺失InDel位点，利用Primer Premier 5.0软件设计并将其转化为相应的特异性InDel分子标记，获得和目标抗稻瘟病基因紧密连锁的标记InDel-19，InDel-22，InDel-25和InDel-27，在对F2感病群体基因型分析时发现除了InDel-22标记外，其他三个标记均未出现交换重组单株，和目标基因共分离，存在紧密连锁关系。

本申请人通过分离群体分析法和隐性群体分析法，并利用分子标记技术从一个具有特殊核遗传背景的水稻三系不育保持系品种康丰B（KFB）中分离、鉴定到了一个广谱稻瘟病抗性基因，并通过开发紧密连锁的分子标记将其精细定位在水稻第6号染色体上，位于Pi2/Pi9等位基因簇区域内。通过等位基因特异性分子标记鉴定和一系列基因组扩增测序和序列比对分析，发现康丰B中稻瘟病抗性基因不同于其他已报道的Pi2/Pi9等位基因，推测为一个新的具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因。本发明通过紧密连锁分子标记的开发和基因的精细定位为后期该稻瘟病抗性基因的进一步克隆和分子机理研究奠定了基础。

参照图1、图2、图3、图4和图5。一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，用于水稻稻瘟病抗性基因的鉴定和用于水稻抗病品种后代的辅助选择育种。

其中，用于水稻稻瘟病抗性基因的鉴定的方法包括如下步骤：

a) 以待鉴定水稻单株材料的DNA为模板；

b) 用分子标记对步骤a）中的DNA进行PCR扩增获得扩增产物；具体应用到本实施例中，为用分子标记InDel-19，InDel-25和InDel-27进行PCR扩增；本步骤1中PCR扩增的反应体系按总体积10μL计，包括如下各组分：5.0μL PCR MasterMix、0.5μL 正向引物、0.5μL反向引物、0.8μL DNA、3.2μL ddH₂O；PCR扩增的反应条件为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30S，55℃复性30S，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存；

c) 利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对步骤b）中的扩增产物进行凝胶电泳分离分析，通过核酸染料染色观察，出现不同分子量大小的带型；本步骤中，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配置方法：按总体积30μL计，包括如下各组分：23.4mL ddH₂O、6mL 40%丙烯酰胺、0.3mL 50×CTAB、0.3mL APS、24.9μL TEMED；

d) 若带型中存在与该分子标记对应的特异性条带，则该待鉴定水稻单株为含有稻瘟病抗性基因的植株，具体应用到本实施例中，为能分别扩增出241bp（InDel-19），250bp（InDel-25）和243bp（InDel-27）的特异条带的单株为含有目标抗性基因的植株。

本发明通过图位克隆的方法从一个具有特殊核遗传背景的水稻三系不育保持系水稻品种康丰B（KFB）中获得一个新的具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因，并将其定位在水稻第6号染色体上，位于Pi2/Pi9等位基因区域内。且利用籼粳亚种之间基因组序列比对的方法开发得到3个和目标抗性基因紧密连锁的插入缺失InDel分子标记，在后期水稻稻瘟病抗性育种中，可通过这些紧密连锁的分子标记进行辅助选择，不仅可以克服常规育种方法中周期长，效率低，不准确且易受坏境因素影响等缺点，同时可以有目标性地在实验室内进行抗病基因的鉴定，以及有目的性地进行多个抗病基因的聚合，从而培育出具有广谱抗性和持久稳定抗性的水稻新品种。同时，这些紧密连锁分子标记的开发和基因的精细定位对该抗性基因的进一步克隆和分子机理研究具有重要意义。

实施例二

参照图6、图7、图8。为了进一步证明本发明开发的和稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记在水稻抗性辅助选择育种中的应用，本申请人以抗病品种康丰B（KFB）为父本、以感病品种日本晴为母本配置了一个新的杂交组合，并获得了一个新的F2分离群体，通过实施例以中步骤（一）的方法对新的F2分离群体接菌，获得了一定数量的F2抗病单株和感病单株。同时参照实施例一中水稻稻瘟病抗性基因的鉴定方法，利用这三个插入缺失InDel标记分别对两亲本进行多态性分析，发现两亲本在这三个InDel位点均存在多态性，表现为不同分子量大小的扩增带型，进一步对F2部分抗病单株和部分感病单株进行检测，发现抗病单株的带型和抗病亲本康丰B（KFB）一致，感病单株的带型和感病亲本日本晴一致，图6、7、8分别为分子标记InDe-19、InDel-25和InDel-27对日本晴/康丰B（KFB）杂交的F2群体部分抗病单株和部分感病单株的检测。说明本发明开发的和稻瘟病抗性基因紧密连锁的插入缺失InDel标记可以准确的区分抗病和感病单株，因此可很好的应用于后期水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种。利用这些标记对水稻苗期基因组进行PCR扩增即可准确判断稻瘟病抗性基因的有无和状态，可以明显提高水稻抗性育种选择效率，减少后期田间筛选鉴定的工作量，加速育种进程。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

序列表

<110> 三明市农业科学研究院

<120> 一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用

<140> 2019103629728

<141> 2019-04-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

aaggagatct ggtatgtgtg cg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

agtttggggt agtgaaatgc ga 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

cctggtctaa agcgcaccta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

cgccatggat tcgttcgact 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

tcggtgcttt agatatgttt tgct 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

acaactcaaa ccaagcttct ca 22

Claims

1.一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记由以下分子标记引物扩增得到：

InDel-19 正向：5’AAGGAGATCTGGTATGTGTGCG 3’；

InDel-19 反向：5’AGTTTGGGGTAGTGAAATGCGA 3’；

InDel-25 正向：5’CCTGGTCTAAAGCGCACCTA 3’；

InDel-25 反向：5’CGCCATGGATTCGTTCGACT 3’；

InDel-27 正向：5’TCGGTGCTTTAGATATGTTTTGCT 3’；

InDel-27 反向：5’ACAACTCAAACCAAGCTTCTCA 3’；

所述分子标记引物用于水稻稻瘟病抗性基因的鉴定，所述鉴定包括如下步骤：

a)以待鉴定水稻单株材料的DNA为模板；

b)用所述分子标记引物对步骤a）中的DNA进行PCR扩增获得扩增产物；

c)利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对步骤b）中的扩增产物进行凝胶电泳分离分析，通过核酸染料染色观察，出现不同分子量大小的带型；

d)若所述带型中存在由分子标记引物InDel-19、InDel-25和InDel-27分别扩增出的241bp、250bp和243 bp的特异性条带，则所述待鉴定水稻单株为含有稻瘟病抗性基因的植株。

2.如权利要求1所述的一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于：步骤b）中，所述PCR扩增的反应体系按总体积10μL计，包括如下各组分：5.0μL PCRMasterMix、0.5μL 正向引物、0.5μL 反向引物、0.8μL DNA、3.2μL ddH₂O。

3.如权利要求1所述的一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记的应用，其特征在于：步骤b）中_，所述PCR扩增的反应条件为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30S，55℃复性30S，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。