CN1306041C - 抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记及其应用。本发明所提供的抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记为dCAPs1，是用引物对SEQ ID №：22和SEQ ID №：23自水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。本发明的抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记可鉴别目标基因Pi-d2是否存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗病基因的分子标记及其专用引物与应用，特别是涉及抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记及其专用引物与应用。
背景技术
稻瘟病是水稻主要病害之一，严重影响水稻的产量和质量。抗稻瘟病的研究及其利用是培育和种植抗病品种的重要环节。对稻瘟病的防治，在栽培上一般采用传统的化学防治和种植抗性品种来控制稻瘟病害，然而化学防治造价太高又缺乏长期有效的杀菌剂，并且容易污染环境；在育种上实行不同抗源品种轮换种植、培育多系品种以及水平抗性品种可保持品种的抗病性，但品种轮换种植给制种、留种等工作带来不便；多系品种的培育、种植工作繁琐；水平抗性品种的抗性又往往不彻底。传统的抗病育种依赖于抗性的鉴定和植株的表型选择，要求丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间，并且受发病条件的限制，不能对抗病基因有效追踪，难以消除与抗病基因紧密连锁的不利基因(或染色体片段)的连锁累赘。
另外，由于抗性基因多以基因簇或重复基因的形式存在，在进化过程中可能变化较小，基本上仍保留原来的基因簇或重复基因的形式，也可能由于重组或转座等原因，原来基因簇或重复基因的成员散布于基因组不同的染色体区域，其各基因成员因其碱基序列的变化或所处染色体微区不同，而进化成分别能对不同致病生理小种产生抗病性的不同基因，或进化成与抗性根本无关的基因或DNA片段，因此，这些不同基因可能在不同程度上保留了基因簇或重复基因原始成分(如目前提及的抗性保守序列)，成为其表达产生抗性的前提。目前通过对所分离的抗性基因编码的蛋白质结构异同的分析，发现多数抗性基因分别具有如下保守结构域，即：含有核苷酸结合位点(NBS)，富亮氨酸重复(LRR)，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)；含胞外LRR结构的跨膜受体蛋白基因以及同时含有胞外LRR和STK结构的跨膜受体蛋白基因。根据抗病基因的这些共性，以保守序列为基础设计引物，在植物中应用PCR技术扩增和分离抗病基因同源序列，快速筛选侯选基因，然而使用这种方法会得到很多片段长度接近而又不同的DNA片段，需对这些片段逐一克隆、测序及定位，分析的工作量较大，而且难以分离得到与目标抗病基因相关的抗病基因同源序列Resistance Gene Analog(RGA)片段。
分子标记辅助选择是通过分析与抗病基因紧密连锁的分子标记的基因型来鉴别目标基因是否存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率。另外由于稻瘟病其病原菌小种遗传和变异的复杂性以及致病的多样性，单一性的抗病品种的很容易在几年内丧失抗病性。因此，一方面鉴定并开发更多的抗性基因的来源，能为抗稻瘟病育种提供充分的材料资源；另一方面，鉴定出的与抗病基因连锁的分子标记可用于抗病基因的辅助选择，大大提高抗病育种的效率。
地谷是广西地方品种谷龙13与珍汕97杂交育成的一个抗病保持系，其抗性强、抗谱广，是目前杂交水稻主要抗源之一。
发明创造内容
本发明的目的是提供抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记。
抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记，是用下述引物对自水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一：SEQ ID №：1和SEQ ID №：2、SEQ ID №：3和SEQ ID №：4、SEQ ID №：5和SEQ ID №：6、SEQ ID №：7和SEQ ID №：8、SEQ ID №：9和SEQ ID №：10、SEQ ID №：9和SEQ ID №：11、SEQ ID №：12和SEQ ID №：13、SEQ ID №：14和SEQ ID №：15、SEQ ID №：16和SEQ ID №：17、SEQ ID№：18和SEQ ID №：19、SEQ ID №：20和SEQ ID №：21、SEQ ID №：22和SEQ ID №：23、SEQ ID №：24和SEQ ID №：25。
本发明还提供了获得上述抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记的引物。
获得上述抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记的引物如下：
1)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记RM262的引物为序列表中的SEQ ID №：1和SEQ ID №：2；
2)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记G45STS的引物为序列表中的SEQ ID №：3和SEQ ID №：4；
3)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记RM3的引物为序列表中的SEQ ID №：5和SEQ ID №：6；
4)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记RM527的引物为序列表中的SEQ ID №：7和SEQ ID №：8；
5)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记SP001的引物为序列表中的SEQ ID №：9和SEQ ID №：10；
6)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记SP003的引物为序列表中的SEQ ID №：9和SEQ ID №：11；
7)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记CAPs1的引物为序列表中的SEQ ID №：12和SEQ ID №：13；
8)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记CAPs2的引物为序列表中的SEQ ID №：14和SEQ ID №：15；
9)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记CAPs3的引物为序列表中的SEQ ID №：16和SEQ ID №：17；
10)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记CAPs4的引物为序列表中的SEQ ID №：18和SEQ ID №：19；
11)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记CAPs8的引物为序列表中的SEQ ID №：20和SEQ ID №：21；
12)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记dCAPs1的引物为序列表中的SEQ ID№：22和SEQ ID №：23；
13)获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记dCAPs2的引物为序列表中的SEQ ID№：24和SEQ ID №：25。
在上述引物的引导下，利用常规PCR方法可得到上述分子标记。
本发明还利用抗病基因同源序列扩增技术得到了抗稻瘟病基因Pi-d(t)1的分子标记SP001及Pi-d2的分子标记SP003。所述抗病基因同源序列扩增技术是根据抗病保守序列所设计的特异简并性引物结合随机引物对抗病和感病的材料进行Uneven PCR扩增，并得到多态性扩增DNA片段，从而获得与抗病基因紧密连锁的分子标记或抗病基因的部分DNA片段，用于对抗病基因的定位、克隆及分子标记辅助选择。
利用抗病基因同源序列扩增技术获得抗稻瘟病基因Pi-d(t)1的分子标记SP001的具体方法，是以序列表中的SEQ ID №：9和SEQ ID №：10的核苷酸序列为引物，进行Uneven PCR扩增，得到该分子标记。获得抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记SP003的方法，是以序列表中的SEQ ID №：9和SEQ ID №：11为引物，进行Uneven PCR扩增，得到该分子标记。
上述Uneven PCR程序如下：预变性94℃5分钟；然后按94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，94℃15秒，42℃1分钟，72℃1分钟进行3个循环，接着按94℃15秒，57℃30秒，72℃30秒，94℃15秒，42℃30秒，72℃30秒进行32个循环，再在72℃延伸5分钟。
本发明的抗稻瘟病基因Pi-d(t)1和Pi-d2的分子标记可鉴别目标基因Pi-d(t)1和Pi-d2是否存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率。本发明的分子标记及抗病基因同源序列的扩增新技术对培育抗病植物品种尤其是抗病的水稻品种，扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1A为分子标记RM3、RM262在亲本和抗病池感病池间的多态性
图1B为RM262在F2群体I中的分离情况
图1C为RM3在F2群体II中的分离情况
图2A为Pi-d(t)1在第2染色体上的定位及连锁的分子标记
图2B为Pi-d2在第6染色体上的定位及连锁的分子标记
图3A为SP001在F2群体I中的共分离图3B为SP003在F2群体II中的共分离
图4为与Pi-d2的连锁的分子标记
具体实施方式
实施例1、地谷抗稻瘟病基因的鉴定及遗传分析
应用我国南方稻区致病力较强的两个稻瘟病生理小种ZB13和ZB15对地谷和感病的水稻品种丽江新团黑谷(LTH)、江南香糯(JNXN)以及杂交获得的F1、BC1F1、F2群体进行接种鉴定，结果如表1A所示，地谷对ZB13和ZB15均表现为抗病，丽江新团黑谷、江南香糯均表现为感病，地谷与丽江新团黑谷、江南香糯杂交获得的F1植株对ZB13和ZB15也都表现为抗病，而地谷与丽江新团黑谷、江南香糯杂交，进一步回交获得的群体B1F1中的抗病单株与感病单株符合1∶1，而且各F2群体的抗病感病的分离比均符合3∶1。同时，为了检测地谷对ZB13和ZB15的抗性是否相关，以地谷和江南香糯为亲本发展了另外一个F2群体，对该群体各单株先后用ZB13和ZB15进行接种，结果如表1B所示，该F2群体在对ZB13和ZB15的抗感分离比基本上接近9∶3∶3∶1，说明地谷对ZB13和ZB15抗性基本上没有相互影响，在遗传上则是相对独立的。这些结果表明水稻品种地谷对稻瘟病小种ZB13和ZB15的抗性分别受细胞核内的单基因控制，并呈完全显性遗传，并分别定名为Pi-d(t)1，Pi-d2。
表1A亲本地谷(Digu)，丽江新团黑谷(LTH)，江南香糯(JNXN)及其杂交后代对稻瘟病原菌小种ZB13和ZB15的抗病感病情况(R＝抗病，S＝感病)
| 亲本及其后代群体 | 卡方测验(ZB13) | 卡方测验(ZB15) | ||||||||
| 抗病、感病单株数 | 期望比 | χ2 | P0.05，0.01 | 抗病、感病单株数 | 期望比 | χ2 | P0.05，0.01 | |||
| R | S | R∶S | R | S | R∶S | |||||
| Digu | 35 | 37 | ||||||||
| LTH | 40 | 32 | ||||||||
| ‘Digu/LTH’F1 | 22 | 18 | ||||||||
| ‘LTH/Digu’F1 | 15 | 26 | ||||||||
| ‘(Digu/LTH)/LTH’F1 | 27 | 24 | 1∶1 | 0.1764 | 3.84-6.63 | 23 | 18 | 1∶1 | 0.2602 | 3.84-6.63 |
| ‘(LTH/Digu)/Digu’F1 | 16 | 17 | 1∶1 | 0.0018 | 3.84-6.63 | 32 | 28 | 1∶1 | 0.2667 | 3.84-6.63 |
| ‘Digu/LTH’F2 | 212 | 58 | 3∶1 | 1.7827 | 3.84-6.63 | 372 | 100 | 3∶1 | 3.406 | 3.84-6.63 |
| ‘LTH/Digu’F2 | 126 | 30 | 3∶1 | 0.1731 | 3.84-6.63 | 422 | 118 | 3∶1 | 2.8643 | 3.84-6.63 |
| JNXN | 27 | 21 | ||||||||
| ‘Digu/JNXN’F1 | 12 | 17 | ||||||||
| ‘JNXN/Digu’F1 | 15 | 23 | ||||||||
| ‘(Digu/JNXN)/JNXN’F1 | 41 | 37 | 1∶1 | 0.2051 | 3.84-6.63 | 19 | 17 | 1∶1 | 0.1111 | 3.84-6.63 |
| ‘(JNXN/Digu)/Digu’ F1 | 15 | 23 | 1∶1 | 1.6842 | 3.84-6.63 | 21 | 16 | 1∶1 | 1.3889 | 3.84-6.63 |
| ‘Digu/JNXN’F2 | 108 | 45 | 3∶1 | 1.3617 | 3.84-6.63 | 84 | 37 | 3∶1 | 2.0083 | 3.84-6.63 |
| ‘JNXN/Digu’F2 | 229 | 67 | 3∶1 | 1.5450 | 3.84-6.63 | 105 | 39 | 3∶1 | 0.3333 | 3.84-6.63 |
表1B(地谷/江南香糯)F2群体对稻瘟病原菌小种
ZB13和ZB15的抗病感病分离情况(R＝抗病，S＝感病)
| F2植株 | 238 | 卡方测验 | |||||
| ZB13 | R | R | S | S | 期望比 | χ2 | P0.05，0.01 |
| ZB15 | R | S | R | S | |||
| 植株数 | 126 | 40 | 51 | 21 | 9∶3∶3∶1 | 4.3754 | 3.84-6.6 |
注：所有的F2单株都先后独立地用稻瘟病菌ZB13和ZB15接种处理
实施例2、Pi-d(t)1，Pi-d2与其它已知抗稻瘟病基因关系分析
用稻瘟病小种ZB13和ZB15对含已知抗病基因的日本鉴别系和ZYQ8及它们与地谷杂交获得的F1和F2群体进行接种鉴定。如表2A所示，12个日本的稻瘟病鉴别品系和窄叶青8号对ZB13均表现为感病反应，这些水稻品种与地谷杂交获得的F2群体对ZB13的抗病、感病分离比符合3∶1，表明地谷中的抗稻瘟病基因Pi-d(t)1与已知的Piks，Pia，Pik，Pi-b，Pi-kp，Pi-ta2，Pi-ta，Pi-z，Pi-i，Pi-km，Pi-zl，Pi-t，Pi-11等抗稻瘟病基因不同。如表2B所示，BL-1、K60、Pi4号、K1、福锦、藤坂5号、梅雨明等7个品种对ZB15均表现感病反应，而与地谷杂交得到的F1均表现抗病反应，与地谷杂交得到的F2的抗病、感病分离比均符合3∶1，表明地谷所含的抗稻瘟病基因Pi-d2与该7个品种所含的抗稻瘟病基因不同。而水稻品种K59，窄叶青8号和砦1号及它们与地谷杂交获得的F1对ZB15均表现为抗病反应，但其相应的F2群体都分离出现了感病单株，其分离比既不符合3∶1，也不符合15∶1，
表2A地谷与各水稻稻瘟病鉴别品种杂交后代F1和F2群体
对稻瘟病原菌ZB13的抗病感病分离情况(R＝抗病，S＝感病)
| 水稻稻瘟病鉴别品种(抗病基因) | 鉴别品种抗病/感病反应情况 | F1植株的抗病/感病反应情况 | F1植株的抗病/感病反应情况 | |||||
| 植株总数 | 抗病株数 | 感病株数 | 卡方测验 | |||||
| 期望比 | χ2 | P0.05，0.01 | ||||||
| 新2号(Pik)爱知旭(Pia)草笛e(Pik)BL-1(Pi-b)K60(Pi-kp)Pi.No.4(Pi-ta2)K1(Pi-ta)福锦(Pi-z)藤坂5号(Pi-i)梅雨明(Pi-km)砦1号(Pi-zl)K59(Pi-t)窄叶青8号(Pi-11) | SSSSSSSSSSSSS | RRRRRRRRRRRRR | 11890156220230204224240201205204222267 | 8372109155163150163174149145160178208 | 35184765675461665260444459 | 3∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶1 | 1.36721.20002.18802.18791.87830.16340.48210.67220.04151.77071.10462.90691.0499 | 3.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.63 |
表2B地谷与各水稻稻瘟病鉴别品种杂交后代F1和F2群体对
稻瘟病原菌ZB15的抗病感病分离情况(R＝抗病，S＝感病)
| 水稻稻瘟病鉴别品种(抗病基因) | 鉴别品种抗病/感病反应情况 | F1植株的抗病/感病反应情况 | F1植株的抗病/感病反应情况 | |||||
| 植株总数 | 抗病株数 | 感病株数 | 卡方测验 | |||||
| 期望比 | χ2 | P0.05，0.01 | ||||||
| 新2号(Piks)爱知旭(Pia)草笛e(Pik)BL-1(Pi-A)K60(Pi-kp)Pi.No.4(Pi-ta2)K1(Pi-ta)福锦(Pi-z)藤坂5号(Pi-i)梅雨明(Pi-km)砦1号(Pi-zl)K59(Pi-t)窄叶青8号(Pi-11) | SSSSSSSSSSRRR | RRRRRRRRRRRRR | 93117196198215205231195228250231218265 | 7385141141153150155158157157229192227 | 2032555762557637715322638 | 3∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶13∶1------ | 0.60570.34470.98001.38781.49000.27481.81850.86544.26321.7280------ | 3.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.633.84-6.63------ |
表明K59，窄叶青8号和砦1号中可能也含有对ZB15的抗稻瘟病基因，但与地谷中的Pi-d2不同，而且也不等位。
实施例3、与抗病基因连锁分子标记的鉴定
以地谷和丽江新团黑谷为亲本，发展了两个F2群体，分别为F2群体I和F2群体II，用ZB13，ZB15分别对F2群体I和F2群体II进行接种处理，鉴定出抗病和感病的单株，并将抗病单株和感病单株进行抗、感分群，从抗病和感病植株中分别随机选取6个单株，取等量叶片，并将抗病和感病单株的叶片分别混合提取DNA，形成抗病和感病DNA池，对ZB13抗病和感病的DNA池分别定名为BR13和BS13；类似地对ZB15抗病和感病的DNA池分别定名为BR15和BS15。先后用比较平均地分布于水稻12条染色体的127个RFLP标记及322个SSR标记对亲本地谷和丽江新团黑谷进行DNA多态性筛选，发现其中有72个RFLP标记及119个SSR标记能揭示两亲本DNA的多态性，进而用这191个分子标记对抗病感病的DNA池进行分析，发现位于第2染色体的RFLP标记G1314A和SSR标记RM262能明显地揭示DNA池BR13和BS13间的多态性(如图1A所示)，表明地谷对ZB13的抗稻瘟病基因Pi-d(t)1很可能位于第2染色体上，并与分子标记G1314A和RM262连锁，图1A中，1，2，3，4，5，6分别表示地谷，丽江新团黑谷，BR15，BS15，BR13，BS13；M1，M2分别表示DNA分子Marker DL2000和λDNA/HindIII；而位于第6染色体的SSR标记RM3和位于第11染色体上的SSR标记RM209，RM21能明显地显示DNA池BR15和BS15间的多态性，表明地谷对ZB15的抗病基因Pi-d2很可能位于第6染色体的分子标记RM3附近或第11染色体分子标记RM209、RM21附近。由于位于第2染色体上的分子标记G1314A和RM262能揭示BR13和BS13间的多态性，于是用这两个分子标记对F2群体I的抗病和感病单株进行分析，发现这两个分子标记与F2群体I中的抗病感病分离明显相关，RM262在F2群体I中的分离情况如图1B所示，表明抗稻瘟病基因Pi-d(t)1确实位于第2染色体上并与分子标记G1314A和RM262连锁，图中R为抗病单株；S为感病单株；另外，用能揭示BR15和BS15间多态性的分子标记RM3、RM209和RM21对F2群体II的抗病感病单株进行分析，如图1C所示，表明F2群体II的抗病感病分离与RM3明显相关，而与RM209和RM21无关，表明该基因Pi-d2位于第6染色体上，并与分子标记RM3连锁，图1C中R表示抗病单株；S表示感病单株；M表示DNA Marker(DL2000)。进一步用第2染色体上与分子标记G1314A和RM262邻近的其它分子标记以及第6染色体上与分子标记RM3邻近的分子标记分别对F2群体I和F2群体II进行连锁分析，并将分析得到的数据根据MAPMAKER3.0作图，分别构建了抗稻瘟病基因的遗传连锁图，如图2A和图2B所示，其中基因Pi-d(t)1位于第2染色体上的分子标记G1314A与G45之间，遗传距离分别为1.2cM和10.6cM。而基因Pi-d2位于第6染色体上的分子标记RM3和RM527之间，遗传距离分别为3.4cM和3.2cM。
实施例4、开发抗稻瘟病基因的RGA标记
根据抗病保守序列所设计的特异简并性引物结合随机引物对二亲本地谷、丽江新团黑谷DNA及抗病感病池DNA进行Uneven PCR扩增，并分析多态性。特异性简并引物主要根据目前在拟南芥、亚麻、烟草和水稻中所克隆到的抗病基因的保守结构如核苷酸结合位点NBS结构、Kinase-1a(MGGVGKTT)和Domain2(GLPLAL)设计(X3：5’-GGNATGGGNGGNNTNGGNAA(A/G)ACNAC-3’，X3antisense：5’-GTNGT(C/T)TTNCCNANNCCNCCCATNCC-3’，Z7：5’-NAC(T/C)TTNAGNGCNAGNGGNAGNCC-3’，Z7antisense：5’-GGNCTNCCNGTNGCNGTNAA(G/A)GTN-3’)。约100条含10个核苷酸的随机引物由上海生工合成。Uneven PCR程序如下：预变性94℃5分钟；然后按94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，94℃15秒，42℃1分钟，72℃1分钟进行3个循环，接着按94℃15秒，57℃30秒，72℃30秒，94℃15秒，42℃30秒，72℃30秒进行32个循环，再在72℃延伸5分钟。结果发现特异引物X3结合随机引物0A12能揭示双亲及DNA池BR13与BS13间的多态性，并将该多态性标记定名为SP001，而X3结合随机引物0S13能揭示双亲及DNA池BR15与BS15间的多态性，将该多态性标记定名为SP003，进一步分析发现标记SP001和SP003分别在F2群体I和F2群体II中与抗病感病共分离，如图3A和图3B所示。图3A中，M表示DNA Marker(DL-2000)，R表示抗病单株，1表示地谷，2表示BR13，3表示丽江新团黑谷，4表示BS13，*为差异带SP001；图3B中，M表示DNA Marker(DL-2000)，R表示抗病单株，S表示感病单株，**为差异带SP003。同时通过连锁作图也将两个分子标记定位在抗稻瘟病基因Pi-d(t)1和Pi-d2所在的分子遗传连锁图上。
实施例5、开发抗病基因连锁更紧密的分子标记
利用地谷和丽江新团黑谷为亲本构建扩大的F2群体，并将该F2群体种植于温室中，在其三叶一芯期，用稻瘟病生理小种ZB15进行喷雾接种，并保持100％的湿度及25-28℃的培养环境，接种10天后对F2单株进行抗感病鉴定。得到约4000株感病特别明显的F2单株，对这些F2单株的叶片按5株混合建池提取DNA，获得约800个感病DNA池，用于精细定位。用实施例3中用于对Pi-d2定位分析的分子标记，并根据中国华大基因研究中心(http://btn.genomics.org.cn)和国际基因组计划(http://rgp.dna.affrc.go.jp)提供的序列设计引物(见表3所示)，对800个感病的DNA池进行分析，将其定位于分子标记CAPs1和CAPs8之间，其中分子标记CAPs1和CAPs8与目标基因分别有1个和3个交换，而分子标记CAPs2，dCAPs1，dCAPs2则与目标基因共分离，如图4所示。
表3所用的主要引物及序列
| 分子标记 | 上游5’端 | 下游3’端 | 限制性内切酶 |
| RM262 | CATTCCGTCTCGGCTCAACT | CAGAGCAAGGTGGCTTGC | |
| G45STS | TGGGATCAAAGTTGGCTATG | CGGAAACAGGGAAGCCTTTG | |
| RM3 | ACACTGTAGCGGCCACTG | CCTCCACTGCTCCACATCTT | |
| RM527 | GGCTCGATCTAGAAAATCCG | TTGCACAGGTTGCGATAGAG | |
| SP001 | X3：5’GGNATGGGNGGNNTNGGNAA(A/G)ACNAC-3’ | OA12 5’-TCGGCGATAG 3’ | |
| SP003 | X3：5’GGNATGGGNGGNNTNGGNAA(A/G)ACNAC-3’ | OS13 5’-GCACACCAAC-3’ | |
| CAPs1RF | 5’TTCTAGAATACGTCCCATCAG 3’ | 5’TCCAACAGAGGTTGCATCGT 3’ | HpaII |
| CAPs2RF | 5’CTCCTCCACCGTCTTATCCA 3’ | 5’AGGTGGAGAGAGAAGGATG 3’ | AluI |
| CAPs3RF | 5’CCACTCGAGGAGTACACATC 3’ | 5’TCTGAAGTAGAGGAGGAGG 3’ | HaeIII |
| CAPs4RF | 5’ATGAATAGGAAGATGGGGTGAA 3’ | 5’GTGAAGATGGGGACTGAGG 3’ | TagI |
| CAPs8RF | 5’CCAACTGGCACGCTAACAAC 3’ | 5’CCGAACCAAGAATGTACTCC 3’ | AluI |
| dCAPs1RF | 5’ACTGCTCTTGTGTTGCTGTGT 3’ | 5’ATGATAGCCAAAGTTGCGAG 3’ | Cac8I |
| dCAPs2RF | 5’CCTTGGTAGTGATGGATTGA 3’ | 5’TTGCAAACGAGCCGATGG 3’ | BalI |
序列表
<160>25
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cattccgtct cggctcaact 20
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
cagagcaagg tggcttgc 18
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tgggatcaaa gttggctatg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
cggaaacagg gaagcctttg 20
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
acactgtagc ggccactg 18
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
cctccactgc tccacatctt 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
ggctcgatct agaaaatccg 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
ttgcacaggt tgcgatagag 20
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(3，9，12，13，15，18，24)
<223>n＝a或g或c或t
<220>
<221>misc-feature
<222>(21)
<223>n＝a或g
<400>9
ggnatgggng gnntnggnaa nacnac 26
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
tcggcgatag 10
<210>11
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
gcacaccaac 10
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
ttctagaata cgtcccatca g 21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
tccaacagag gttgcatcgt 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
ctcctccacc gtcttatcca 20
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
aggtggagag agaaggatg 19
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
ccactcgagg agtacacatc 20
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
tctgaagtag aggaggagg 19
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
atgaatagga agatggggtg aa 22
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>19
gtgaagatgg ggactgagg 19
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>20
ccaactggca cgctaacaac 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>21
ccgaaccaag aatgtactcc 20
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>22
actgctcttg tgttgctgtg t 21
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>23
atgatagcca aagttgcgag 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>24
ccttggtagt gatggattga 20
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>25
ttgcaaacga gccgatgg 18
Claims (3)
1、抗稻瘟病基因Pi-d2的分子标记，是用引物对SEQ ID №：22和SEQ ID №：23自水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述水稻为地谷。
3、获得抗稻瘟病基因Pi-d2分子标记的引物对，为序列表中的SEQ ID №：22和SEQ ID №：23。
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Granted publication date: 20070321 Termination date: 20141216 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |