CN1831127A - 一种调控叶绿素代谢的关键基因及其创建植物滞绿性状的方法 - Google Patents

Abstract

叶片中叶绿素降解的减缓可以显著地延长叶片的自然衰老和离体衰老进程，进而可能延长光合期和光合总量；因此而导致的滞绿性状(stay－green)可以延长绿叶蔬菜的货价寿命和饲料作物的采后绿期，进而增加其主要营养成分叶绿素和蛋白质的含量；滞绿性状也可以显著地改善草坪植物的绿期和景观效果。本发明是以快中子诱变模式植物拟南芥，筛选获得了滞绿突变体，通过图位克隆的途径分离获得了叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1。运用RNA干扰或其它技术，借助于基因工程的手段，通过变异NYE1基因，或抑制该基因的表达，以及降低NYE1蛋白活性等，创造植物滞绿性状。

Description

一种调控叶绿素代谢的关键基因及其创建植物滞绿性状的方法

技术领域

本发明涉及是一种在植物正常衰老进程中叶绿素降解代谢调控、导致叶片变黄的新颖基因AtNYE1。利用RNAi技术抑制该基因表达，或通过快中子诱导该基因变异，使该蛋白的活性降低或失活，从而获得滞绿的植物性状。

背景技术

植物叶片进入衰老程序后，由于叶绿素的快速降解所导致的黄化现象，是几乎所有植物叶片衰老的共同、也是最显著的表观特征。虽然叶片衰老可以被许多环境因子和发育因子诱导，但是叶片衰老开始的时间以及过程都是被细胞凋亡过程所调控。在过去数十年中，学者们在许多作物上发现了叶片绿期延迟至成熟或衰老之后，即滞绿(stay-green)或非黄化(non-yellowing)突变体。

根据Thomas，H和Howarth，C.J.(J.Exp.Bot.，51：329，2000)的分类，滞绿突变体可以分为五种基本类型。A型滞绿突变体的衰老启动推迟，但是衰老的速率不变；B型滞绿突变体衰老启动正常，但是叶片黄化和光合速率下降减缓。由于这两类滞绿突变体的光合期被延长，因而被称之为“功能型”滞绿。C型滞绿突变体中叶绿素降解功能由于遗传变异导致的异常，叶绿素含量可以长期维持不变；但是，就生理功能退化而言，与野生型无异。因此该类突变体被称之为“非功能型”滞绿，或“表观”滞绿。D型滞绿突变体是由于速冻或骤干所引起的叶片死亡所致。最后一种为E型突变体，在该种突变体内积聚过量的叶绿素，使得叶片呈深绿色，但光合效率维持不变。D型、E型与C型一样，也为“非功能型”滞绿。

迄今为止，研究得最广泛、最深入的滞绿突变体是草地羊毛(Festuca pratensis)滞绿突变体及其衍生遗传材料(Thomas，H.，Planta，137：53，1977；Thomas，H.，Planta，154：212，1982；Thomas，H.，Theor.Appl.Genet.，73：551，1987；Thomas，H.& Matile，P.，Phytochemistry，27：342，1988)。该突变体是一种自然发生的变异体，受核内单隐形位点(sid)的调控；属于非功能型突变。与野生型相比，在衰老叶片中有明显的脱植醇叶绿素酸酯、羟基叶绿素酸酯和脱镁叶绿酸的积累；而且，叶绿素捕光结合蛋白(light harvest chlorophyll-binding protein)的稳定性也显著地增加。但是，可溶性蛋白，特别是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)大亚基的降解速率没有差异。衰老诱导三天后，突变体中脱镁叶绿酸氧化酶(Phaeophorbide aoxyginase)活性只是野生型中的12％，说明突变体中叶绿素降解受阻于脱镁叶绿酸的开环(Roca，M.，et al.，Phytochemistry 65：1231-1238，2004)。

在大豆中，滞绿性状受到三个核基因(G和dld2)和一个胞质基因(cytG)的控制(Guiamet，J.J.，et al.，Plant Cell Physiol.，31：1123，1990)。一个显性基因G使种皮维持绿色。一个胞质基因，cytG和两个隐性基因，dldld2d2和G_dldld2d2调控叶片、果荚、种皮和胚中的绿色色素。据报道，cytG的突变可使得衰老叶片中的叶绿素b比叶绿素a更加稳定，因而抑制了叶绿素的降解。dldld2d2纯合突变可使衰老叶片中叶绿素和可溶性Rubisco蛋白的降解显著延迟(Guiamet，J.J.et al.，Plant Physiol.，96：227，1991；Guiamet，J.J.et al.，Physiol.Plant.，96：655，1996)

在干菜豆(Phaseolus vulgaris)的滞绿突变体中，也报道了衰老叶片中叶绿素滞留的现象(Backmann，A.et al.Biochem.Bioph.Res.Co.203：1362-1362，1994)。但是，在突变体中既没有发现叶绿素酶活性的改变，也没有检测到脱镁叶绿酸的积累。然而，相比于野生型，突变体中的叶绿素酸酯a和b的确有积累，表明脱镁螯合酶活性可能存在缺陷(Fang，Z.，et al.J.Exp.Bot 49：503-510，1998)。

在水稻上，也筛选到了受单隐形核基因调控的滞绿突变体sgr(t)，并被定位在9号染色体长臂上的RFLP标记RG662和C985之间(Cha et al.，TAG.104：526-532，2002)。

时至今日，虽然报道了数种自然突变或通过人工诱变得到的滞绿突变体的生理和形态特征，但是目前还没有分离到具有显著调控衰老叶片中叶绿素降解动力学的关键基因。已克隆出的叶绿素降解代谢途径上的三个关键酶基因中(叶绿素酶基因，脱镁叶绿酸氧化酶基因，RCC基因)，只有脱镁叶绿酸氧化酶基因显示出一定的调控衰老叶片中叶绿素降解的潜力，但是该基因的突变和被过度抑制会引起有毒中间产物的积累，进而导致叶片上出现类似于创伤引起的坏死斑点(Hrtensteiner，S.Annu.Rev.Plant Biol.57：55-77，2006)。

发明内容

本发明的目的是获得调控叶绿素代谢的关键基因AtNYE1及其植物滞绿突变体的创建方法。

本发明的内容之一是从拟南芥中克隆了叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1；内容之二是利用AtNYE1基因，运用RNAi技术和借助于基因工程的手段，创建滞绿植物性状。

本发明提出的一种调控叶绿素代谢的关键基因，该调控基因AtNYE1的核苷酸、氨基酸序列为SEQ ID No：1。

本发明提出了一种利用叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1，创建植物滞绿性状的方法。通过快中子诱变AtNYE1或同源性30％以上的基因，获得滞绿突变体，或抑制AtNYE1基因的表达，获得滞绿植物性状。

本发明中，滞绿植物为绿叶类植物。

本发明中，绿叶类植物为绿叶菜类植物。

本发明中，绿叶类植物为牧草或草坪类植物。

本发明中，T-DNA载体为RNAi载体，通过形成双链RNA抑制基因表达。

本发明中，抑制基因表达的重组载体为35S启动子或者衰老诱导增强启动子。

本发明中AtNYE1基因的克隆及其功能进一步描述如下：

1、快中子诱变拟南芥Columbia生态型

在BARN(Biological Agricultural Reactor Nederlands，Wageningen)的辐射房间内，用快中子处理22℃下经过1.2％DTT浸泡3小时左右的拟南芥种子，辐射强度分别为20，33，47 and 60Gy，辐射剂率(dose rate)为1Gy/min，最大的辐射时间为3.5小时左右。为了使得环境条件均匀，辐射期间种子一直保持浸泡状态，直到辐射结束以后。辐射后的种子用自来水冲洗5分钟，然后播种。辐射一代(M₁)自交产生M₂种子，用于突变体筛选。

2、滞绿突变体的筛选

当植株的第6片叶片完全展开时，取每个植株的第4和第5片叶片(Roca et al.Phytochemistry 65：1231-1238，2004)，将叶柄浸没在水中，并转移至黑暗处进行离体处理(Weaver et al.，Plant Mol.Biol.，37：455-469，1998)，3天后连续观察叶绿素降解情况，直至第10天。活体整株黑暗处理时，将三周大的野生型和突变体植株转移至连续黑暗的条件下，对照植株继续放在正常条件下培养，3天后观察处理效果，直至第10天。实验重复3次。在所筛选到的突变体中，其中一个的滞绿性状特别明显，离体叶片黑暗处理一周后其中的叶绿素还保留15％，而对照的野生型只剩下41％。该突变体与Col-O野生型回交4次，纯化其遗传背景，命名为nye1(见附图1)。

3、nye1的遗传分析

纯合突变体nye1与野生型Col进行杂交。突变体作为母本、野生型作为父本，进行正交；突变体作为父本，野生型作为母本进行反交。正反交得到F1代，根据F1代表型分析基因变异的显隐性，即与野生型表型相似的为隐性变异，与突变体表型相似的为显性变异，介于两者之间的为半显性变异。F1代自交产生F2代，观察F2代的分离情况，进而确定突变体表型所涉及的基因数目。遗传分析表明，nye1的表型是由单个位点的半显性突变引起的。

4、作图群体的构建

纯合的nye1突变体与野生型Ler杂交得到F1代，F1代自交产生F2代分离群体，从F2代中挑选出具有纯合滞绿突变体表型的植株，经过F3代验证，作为基因定位的作图群体。

CTAB法小管抽取植物基因组DNA：

(1)单株收取拟南芥叶片1-2片于1.5ml Eppendorf管中，液氮保存，将2％的CTAB溶液在65℃的水浴锅中预热；

(2)用液氮预冷的研磨棒充分研磨植物材料，加入预热的CTAB溶液600ul，混匀；

(3)65℃水浴20-30min，中间轻摇数次；

(4)13,000rpm，离心10min，转移上清到新的Eppendorf管中；

(5)加等体积酚：氯仿：异戊醇，约500ul，混匀；

(6)13,000rpm，离心10min，转移上清到新的Eppendorf管中；

(7)加2/3体积的异丙醇，约400ul，颠倒混匀，静置10min；

(8)13,000rpm，离心10min，弃上清；

(9)约400ul的70％乙醇洗涤沉淀1-2次；

(10)55℃下干燥5min，加50μlTE，1μl RNA酶溶解沉淀；

(11)-20℃下保存DNA样品，

[CTAB缓冲液：CTAB(2％)，Tris.Cl pH8.0(100mmol/L)，EDTA pH8.0(20mmol/L)，NaCl(1.4mol/L)]

5、突变位点的染色体定位

利用拟南芥染色体上已知的SSLP分子标记(www.arabidopsis.org)与突变体的突变位点之间的连锁交换关系来确定突变位点的位置。将已经抽提的DNA样品随机选取100株左右，每个样品取1μlDNA混合，作为混合样。在拟南芥5条染色体上分别选用4-5个的不同SSLP分子标记(表2)，分别以混合样品、突变体与野生型Col杂交产生的F1代、野生型Col、野生型Ler作为模板进行PCR扩增，并进行琼脂糖电泳检测。突变位点距SSLP分子标记的厘摩距离根据(Kosambi，Ann Eugen，12：172-175，1994)文献中提到的方法计算。

                表1基因粗定位所采用的SSLP分子标记

染色体序号遗传距离	标记名称	引物序列(5’-3’)	PCR产物在Col中的大小(bp)	PCR产物在Ler中的大小(bp)	染色体上的遗传距离(cM)
						1131cM	nga63	AACCAAGGCACAGAAGCG	111	89	9.37
ACCCAAGTGATCGCCACC
	nga248	TACCGAACCAAAACACAAAGG	143	129	40.06
TCTGTATCTCGGTGAATTCTCC
							CTGATCTCACGGACAATAGTGC

	na280	GGCTCCATAAAAAGTGCACC	105	85	81.71
						na111	TGTTTTTTAGGACAAATGGCG	128	162	115.55
	CTCCAGTTGGAAGCTAAAGGG
		298cM	Ciw2	CCGGGTTAATAATAAATGT	105		90				11
CCCAAAAGTTAATTATACTGT
	Ciw3			TGAACTTGTTGTGAGCTTTGA		230		200	30
GAAACTCAATGAAATCCACTT
			Nga1126	CGCTACGCTTTTCGGTAAAG	191		199			50.65
GCACAGTCCAAGTCACAACC
	Nga168			TCGTCTACTGCACTGCCG		151		135	73.77
GAGGACATGTATAGGAGCCTCG
			AthBIO2b	TGACCTCCTCTTCCATGGAG	141		209			76.11
TTAACAGAAACCCAAAGCTTTC
	3101cM			Nga172		AGCTGCTTCCTTATAGCGTCC		162	136		6.91
CATCCGAATGCCATTGTTC
		Nga126	GAAAAAACGCTACTTTCGTGG		119	147	16.35
CAAGAGCAATATCAAGAGCAGC
			Ciw11	GAAGAAATTCCTAAAGCATTC				179	230	43
CCCCGAGTTGAGGTATT
		Ciw4		TACGGTCAGATTGAGTGATTC	190	215	70
GTTCATTAAACTTGCGTGTGT
			Nga6	TGGATTTCTTCCTCTCTTCAC				143	123	86.41
ATGGAGAAGCTTACACTGATC
		4116cM		Ciw5	AGATTTACGTGGAAGCAAT	164	144				9.82-23.9
GGTTAAAAATTAGGGTTACGA
	Nga8		GAGGGCAAATCTTTATTTCGG		154			198	26.56
TGGCTTTCGTTTATAAACATCC
			Ciw6	CACATGGTTAGGGAAACAATA		162	148			48.73-69.5
CTCGTAGTGCACTTTCATCA
				TAAAGGAAAATGGACCTAACTA	213			183	79.5

	T32A16	CTTGTTTGGTTTTGAGGTTC
						Nga1107	GCGAAAAAACAAAAAAATCCA	150	140	104.73
	CGACGAATCGACAGAATTAGG
		5140cM	nga106	GTTATGGAGTTTCTAGGGCACG	157		123				33.35
TGCCCCATTTTGTTCTTCTC
	Nga76			GGAGAAAATGTCACTCTCCACC		231		250	68.4
AGGCATGGGAGACATTTACG
			Ciw9	GACTACTGCTCAAACTATTCGG	165		145			88
CAGACGTATCAAATGACAAATG
	MBK5			ATCACTGTTGTTTACCATTA		207		180	121.65
GAGCATTTCACAGAGACG

表2

	PCR反应体系(50μl体系)
		H2O10×PCR缓冲液10×dNTP(1mM)DNA模版Primer1(20μM)Primer2(20μM)Taq酶	40.8μl5.0μl1.0μl1.0μl1.0μl1.0μl0.2μl

            表3PCR反应条件

Step1Step2Step3Step4Step5

94℃94℃55℃72℃Step2～4循环30次延伸72℃

5min45sec45sec90sec5min

注：根据不同的引物，可适当的调节退火温度和延伸时间。

利用分离群体分组分析法(BSA)(Lukowitz et al.，Plant Physiol，123：795-805，2000)，以及利用22个SSLP分子标记分别进行PCR检测，仅发现突变位点与位于第4条染色体上臂的分子标记T32A16(79.5cM)连锁(图1)。在T32A16附近设计一系列新的SSLP分子标记(表4)，利用这些SSLP分子标记在作图群体的1800多个突变体DNA中分别进行PCR扩增，检测重组子，结果表明突变位点位于第4条染色体的SSLP分子标记F7H19和T12H17之间(图2)。

表4

                        精细定位滞绿基因新设计的SSLP分子标记

标记名称	所在BAC	在染色体上的位置		引物序列		PCR产物大小(bp)
								起点	终点	Forward primer	Reverse primer	Col-O Ler
		AtF10M23AtF7J7AtF7K2AtT12H17AtF7H19AtT32A16	F10M23F7J7F7K2T12H17F7H19T32A16	134971401129379411857443119532771210795212459190	134971501129381011857462119532891210797112459221	5’AGAGTGGTGGATAGGAGGAC3’5’TTGATGATTCCCTTGTTTGA3’5’ACCAAATGCCTACCACAA3”5’ATAACAACCCACTCACACAA3’5’CAATGGAAGGCTATTTGTCTA3’5’TAAAGGAAAATGGACCTAACTA3’	5’AGTTATGTTCAAATCTGTCGTT3’5’TAGTGGCTGAAAAGGAGAAA3’5’ATGTATTTTTTGCCTTTTCC3’5’AAATCGTTTCTTATCCTTCC3’5’ACTCAGATAGAGAAATTAGGTGATA3’5’CTTGTTTGGTTTTGAGGTTC3’							169149165150139213	153134147137121183

6、测序确定候选基因

分子标记F7H19和T12H17之间的物理距离约为121kb，对其中最有可能存在目标基因的30kb左右的基因组DNA进行了精确测序。在at4g22920的阅读框内发现了一个单碱基变异，即由A变成了T，使得第十个密码子由亮氨酸(Leu)变成了中止密码子(TAA)(图3)。蛋白质序列中推测含有一个叶绿体转运肽和一个跨膜区(图4)。

7、基因组拷贝的遗传互补。

用带PstI和BamHI酶切位点的引物(SEQ ID No：2)，通过PCR方法将野生型(Col-O)中AtNYE1基因及其上游1.9kb，下游1.0kb，总计4.1kb(SEQ ID No：3)的区域扩增出来；割胶回收，并测序鉴定。借助于T4 DNA连接酶，该片断和经过PstI和BamHI双酶切、电泳、割胶回收的双元载体pPZP221连接，获得基因组拷贝互补载体pPZPAtNYE1(图5)。通过大肠杆菌表达，抽质粒、回收、并通过电转化的方法将质粒导入农杆菌LBA4404中。用含有该质粒农杆菌培养液侵染处于花苞期的nye1突变体。收得的种子经90mg/L的庆大霉素筛选，获得的抗性苗移栽至土壤中。根据对T1代转基因植株进行的PCR检测和Southern blot分析的结果，以及对T1和T2转基因植株滞绿性状的互补效果分析，确认了nye1突变体的滞绿性状是AtNYE1变异的直接结果。

8、NYE1基因的生物信息学分析

Blast分析发现AtNYE1在拟南芥中有两个同源性较高的基因，分别为at4g11910和at1g44000，其中与at4g11910的同源性非常高，部分氨基酸序列达76％同源性(图6-1)，因此at4g11910被命名为AtNYE2。另外，AtNYE1在物种间也非常保守，通过b12seq程序分析( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/wblast2.cgi)，AtNYE1在大豆，水稻，西红柿，玉米等重要农作物中均含有高保守性同源基因。AtNYE1与大豆GmNYE1，GmNYE2部分氨基酸分别具有67％和65％的同源性；与水稻OsNYE 1部分氨基酸有64％同源性；与西红柿LeNYE 1部分氨基酸有65％同源性；与玉米ZmNYE 1部分氨基酸有56％同源性，(图6)

本发明首次获得了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1，通过基因工程的途径和借助于RNAi技术，可以创建植物滞绿品系。与此同时，建立了通过快中子诱变叶绿素降解代谢的关键调控基因，特别是AtNYE1，创建滞绿品系的新方法。该基因的变异和被抑制，除了导致衰老叶片滞绿以外，不引起任何可见的不利形态变异。

附图说明

图1是BSA法分析nye1的突变位点与分子标记的连锁关系。用22个SSLP分子标记分别对混合样品进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测结果显示，只有在用T32A16时才显示唯一典型的Col条带特征，说明突变位点只与第4条染色体T32A16分子标记连锁。

图2是突变位点的确定图。图中，横线上面为分子标记名称；下面斜体数字为分子标记间的物理距离(bp)；有阴影的数字表示遗传距离(cM)；★代表定位到的突变位点。

图3是NYE1与BAC F7H19序列对比图。

图4是AtNYE1序列的特征分析图。图中下划线表示预测的叶绿体转运肽，波浪线表示预测的跨膜区域，带阴影的方框表示突变位点。

图5是基因组拷贝互补载体pPZPAtNYE1图。

图6-a是AtNYE1与AtNYE2部分氨基酸序列比较图。相同氨基酸在中间栏标出，“+”代表生化性状相近的氨基酸(下同)。

图6-b是AtNYE1与大豆GmNYE1部分氨基酸序列比较图。

图6-c是AtNYE1与大豆GmNYE2部分氨基酸序列比较图。

图6-d是AtNYE1与水稻OsNYE1部分氨基酸序列比较图。

图6-e是AtNYE1与西红柿LeNYE1部分氨基酸序列比较图。

图6-f是AtNYE1与玉米ZmNYE1部分氨基酸序列比较图。

图7a-d为基于clustalW方法的物种间多序列比对。

图7-a是NYE1蛋白在不同物种间的保守性。黑色背景表示完全一致的残基，灰色背景表示部分一致的残基图(下同)。

图7-b是玉米，水稻，大麦等单子叶植物NYE1氨基酸序列比对图。

图7-c是拟南芥，大豆，西红柿等双子叶植物NYE1氨基酸序列比对图。

图7-d是结缕草(Zoysia)同其他植物相比部分氨基酸区域缺失图。

图8是拟南芥nye1突变体，右上方为nye1，左上方为野生型Columbia对照。

图9上是pPZPY122简图；下是表达载体构建示意图。

图10是被RNAi抑制的拟南芥植株的滞绿效果图。图中左边为被抑制的植株(上)和离体叶片(下)，右边为野生型Columbia对照植株(上)和叶片(下)。

图11利用RNAi技术抑制黑麦草中LpNYE1表达导致的滞绿效果。

左上为转基因植株的根部滞绿性状，左下为叶部的滞绿性状；右上为对照根部黄化性状，右下为叶部黄化性状。

具体实施方式

利用RNAi技术抑制AtNYE1基因的表达创造拟南芥滞绿性状

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA特异性地诱发与其序列同源的mRNA分子被降解，从而抑制相应基因的表达的现象(Fire et al.Nature 391：806-811.1998)，是一种特殊的转录后基因表达沉默(post transcriptional gene silence，PTGS)现象。

本试验构建了AtNYE1的RNAi表达载体。方法是用带XbaI和SmaI酶切位点的引物(SEQID No.4)扩增正义链(SEQ ID No.5)，产物回收后用XbaI和SmaI双酶切，再同收酶切产物；用同样酶切处理pPZPY122质粒载体。将产物酶切回收片断与载体酶切回收片断通过T4 DNA连接酶连接燃后用自带引物测序，筛选鉴定正确的克隆。以此载体作为二次克隆的载体，通过类似的过程继续连入反义链(SEQ ID No.6，SEQ ID No.7)和loop区段(图9中的intron)。最后得到插入了sense：loop：antisense结构片断的RNAi表达载体pPZPYAtNYE1(图9)。该质粒载体通过电转化导入农杆菌LBA4404，在含有氯霉素，利福平，链霉素的YEB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。用蘸花法侵染拟南芥Col-O野生型。收得获的种子在含90mg/L庆大霉素的培养基上筛选，抗性苗移至土壤。对T1代转基因植株进行PCR检测，DNA(southern blots)分析和滞绿性分析，以及对T2代进行抗性分离和滞绿特性分析，结果表明运用RNAi技术抑制AtNYE1基因的表达能够创建滞绿性状。

利用RNAi技术抑制LpNYE1基因的表达创造草坪型黑麦草滞绿性状

利用上述RNAi载体，通过农杆菌LBA4404介导，转化黑麦草胚性愈伤组织，在抗性培养基上筛选转基因愈伤，在再生培养基上再生成苗，抗性苗移至土壤中。已对T1代转基因植株进行PCR检测，DNA(southern blots)分析和滞绿性进行分析，结果表明利用RNAi技术抑制LpNYE1的表达也能够创建滞绿性状。

本发明涉及的序列

SEQ ID No：1的信息

    长度：807碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：CDS

    序列描述：SEQ ID No：1

ATGTGTAGTTTGTCGGCGATTATGTTGTTACCAACGAAGCTGAAACCAGCTTATTCAGAC  60

AAACGGAGTAACAGTAGCAGCAGCAGCTCACTCTTCTTCAACAATAGAAGATCCAAGAAG  120

AAGAACCAATCGATTGTTCCCGTTGCAAGGTTGTTTGGACCGGCGATTTTCGAATCATCC  180

AAATTGAAAGTACTCTTCTTAGGGGTTGATGAGAAGAAGCATCCTTCAACGCTCCCTAGG  240

ACTTACACACTCACTCACAGTGACATTACAGCTAAACTAACCTTAGCTATTTCTCAATCC  300

ATAAACAACTCTCAGTTGCAAGGATGGGCAAATAGGCTATACCGGGATGAAGTTGTGGCA  360

GAATGGAAGAAAGTGAAAGGGAAAATGTCGCTTCACGTTCATTGTCACATAAGCGGTGGC  420

CATTTCCTTTTAGATCTCTTTGCAAAGTTTCGATATTTCATCTTTTGCAAAGAACTACCT  480

GTGGTGTTGAAGGCTTTTGTGCATGGAGATGGGAACTTGTTGAACAACTATCCTGAGCTA  540

CAAGAAGCTCTTGTTTGGGTCTATTTCCATTCTAATGTCAATGAGTTCAACAAAGTCGAG  600

TGTTGGGGTCCGCTTTGGGAAGCTGTTTCGCCTGATGGTCACAAGACTGAGACTCTTCCC  660

GAGGCTCGGTGTGCGGACGAGTGTAGTTGTTGTTTTCCAACCGTTAGCTCGATTCCATGG  720

TCTCATAGTCTTAGTAATGAAGGTGTAAATGGTTACTCTGGGACTCAGACTGAGGGAATT  780

GCTACTCCAAATCCGGAGAAACTCTAG

SEQ ID No：2的信息

    长度：29，25碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：寡核苷酸

    序列描述：SEQ ID No：2

正义5′CAC AACAAGATCTAACCCTTTTG  3′BamHI

反义5′CAG TGGAGGTGACAGGAGG  3′PstI

SEQ ID No：3的信息

    长度：4091碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：基因组DNA

    序列描述：SEQ ID No：3

CTTCAGATTCGGCATCACAATCGCTCTCTTAA

AATTACTCGCActgcacataattacatacaccattaaccatcatgtacagcacaagcatcaacgccagcacaagattgtgattgaggaa

ttcatacataacaaacaatggttccacaagaaacaccaatagcaaacaaaaaagtggctgcaaaacaaagtaaagcaaggaaagaaaagaaa

gattgcaggatgtttataagacCTGTGGGGAACAACAGCATGAAGAAGATCACCGTCACGGAGATGA

AGATGCCAATCATCAGGTTGAGTGATTGTGAGCTCCATTCTTACTGCTCTCGTCTTCACTT

TCTCAGAAGATCTGTCAAACTTCAACTTCTGAGATCCAAATCCctacataaagaataaaatagttgacttt

aacagacgcataggaggaattaaataaaattaaaactggatcacgtggattgaactaaacaagaataagactcaaagagtggtggaggtagagt

acatacACTATAAGGAGAGACCAAAGTCTTTATCATctgaaagctgctcaaggctttgcaagaattcacctgttccaaa

gcaaatgacaagtagactcagattctataacatgaccttaaaaaattgactctgttctaaagtattagcaggcactaaaactattcaatcatcatcaaa

agatttcgcattcctttggttcaatgtttctccaaacgaaatttagtatccagattaatcaaatttctatacacacaaatgggtatcagcaaaatccaaa

gaaatcaaattatccaaacaataaaccacaaaatggcgaaactggtaaacacctagaaaccaaaatcgaaaactt gaacttgtttaggtaagcaa

tacgaacctggataaacgaaatgcacaacagggatgcttacaacacaaacaaaacgaaccccaaaaagagtgatttgaggaagagattgaa

ggagaaagaagaagaaaaaacagtactcgtgttttgttgtttacaagatacgacgtcgcttaacgtaaaagaagaagaaaaaaataaaagctctg

taacaggccagcccaattttagcccgatatttttaatggacctggacctgatcacaaatttcagccctttttaacatccttatggatcaacatgggact

ctctgactcctccggttccatcaatacctgcgtttgttgtccttgttcacgacgattcaagcgaagaagcctctcgagtttcacaggtctaataactaa

accgagtaatcgagtcgaatgacattaaattgaaccgaaactaaaccgtattgctttaggttcgactgacaactacagtacgtgagttaggttcggt

tagagccgaatctgtgtctctttgtcgcaacgagatggctaaagttatccaaaaagacggttagagccagttgttagccccaccatgacgacacat

ggggaagctcatgcaaagattagagaacacgtggcactctctcgtgttcagaaaaattccaaaagagtgttcagatttgggcacggaagtgtga

aacgtgaagcaacaatcccttttaaacacaagaaccaactcaatacgcatcacaaagaaccctaaattcctggaagatctcaaaaggaaaattca

aaaccaaagcttcaagcaatcatcaagcaaaggaaaagctcaaattttgggtcttttatatatttatttcttaaagttacaatctttttgattgtggtttca

gtgtacgaacacgcaagaactcgcgtgaaaaaattgtatccaagcttcgtgaaaggagtctctctgtatttagtggcgttttgttctgttgttatttctg

aaatattgaagcttttgatttgggtttcaagagagcagagATGTGTAGTTTGTCGGCGATTATGTTGTTACCAACG

AAGCTGAAACCAGCTTATTCAGACAAACGGAGTAACAGTAGCAGCAGCAGCTCACTCT

TCTTCAACAATAGAAGATCCAAGAAGAAGAACCAATCGATTGTTCCCgtaaggatttgttctcttaatc

attttgacatatctttgttttatgtgtctcagttatggatatatctatgcctctgtctttattgatggaacttgaaacttttgggatcggtgcagGTTGC

AAGGTTGTTTGGACCGGCGATTTTCGAATCATCCAAATTGAAAGTACTCTTCTTAGGGGT

TGATGAGAAGAAGCATCCTTCAACGCTCCCTAGGACTTACACACTCACTCACAGTGACA

TTACAGCTAAACTAACCTTAGCTATTTCTCAATCCATAAACAACTCTCAGgtaaaaacacctctctct

ctggtcttaacatatctacatggctctgtttataggagtagaatgtttatgtatttgattatttggagcaaatattagaggcttatgtatgattgttttaacct

atgtatgtgtctatattcaccagaatctcttaacactttagaggctgatatgtatagaaatgttttttatagTTGCAAGGATGGGCAAAT

AGGCTATACCGGGATGAAGTTGTGGCAGAATGGAAGAAAGTGAAAGGGAAAATGTCGC

TTCACGTTCATTGTCACATAAGCGGTGGCCATTTCCTTTTAGATCTCTTTGCAAAGTTTCG

ATATTTCATCTTTTGCAAAGAACTACCTGTGgtaagttcccaaattcataagaaactttttattggtttcatgtaaaacaa

aatgtttattgttttgatatatacagGTGTTGAAGGCTTTTGTGCATGGAGATGGGAACTTGTTGAACAAC

TATCCTGAGCTACAAGAAGCTCTTGTTTGGGTCTATTTCCATTCTAATGTCAATGAGTTCA

ACAAAGTCGAGTGTTGGGGTCCGCTTTGGGAAGCTGTTTCGCCTGATGGTCACAAGACT

GAGACTCTTCCCGAGGCTCGGTGTGCGGACGAGTGTAGTTGTTGTTTTCCAACCGTTAG

CTCGATTCCATGGTCTCATAGTCTTAGTAATGAAGGTGTAAATGGTTACTCTGGGACTCA

GACTGAGGGAATTGCTACTCCAAATCCGGAGAAACTCTAGtgactaaatatcaaattacaagtttttcttttgg

tagtttgtacaaagtgaaaaggaaatggcaggactttccttttggtggatctaaatattggtttggtttggtgtacataatgtggtataggaaaataatg

attatttgtaggttaaatacagattttaaagtttcaaatggtattttgtgtctactctgaagtctttatcatagttgtatacttgtattgtatctcatccacaag

atcaaaatgtaaatttcttacagattagctaatattaaaggtgacagactggtatagtactactgcaatgcaaacataaagatgaataaattgttgttta

atgaacatatatattttaatatatcaaaacattcatgagaatcatcaccaatttaaagttatactaatatcccaaataagaatagtttagaaatatgaaga

tattcatgagaatcatcaccaaagtaacaatagacgtatattaaggaccgaattcgtcggtgtaacggtgagaaactaaggagaaacgtgaaggt

aaagagatggcaaaagactttgtctctctggtggttttgcaaagcgtatcagccacttcttgctcctaatgattccaaattattttcttggatttatttggt

ctctttcttcaatatctttttcattttataaccaaatcaagatgactttttttctctgaccccattcgtctatctaatttacgaccaaatacaccaaatacaga

aagagaagaagaacaagtaatataagagaatggtaacgaattattgcattattatcatgggcttattttataaaatgttgtgttcgtaagtaaataaata

caaaagaaactatattttgatatatgaagaaaaattgaataaagatatacactttggaaaattttgggggaaaatgttgtgcatcttgatggaaaccc

aaagatcgtgattaaat

SEQ ID No：4的信息

    长度：29，28碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：寡核苷酸

    序列描述：SEQ ID No：4

正义5’aat tct aga att cag aca aac gga gta ac 3

反义5’tat ccc ggg gga aat aga ccc aaa caa g 3

SEQ ID No：5的信息

    长度：534碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：基因组DNA

    序列描述：SEQ ID No：5

aat ATTCAGACAAACGGAGTAACAGTAGCAGCAGCAGCTCACTCTTCTTCAACAAT

AGAAGATCCAAGAAGAAGAACCAATCGATTGTTCCCGTTGCAAGGTTGTTTGGACCGG

CGATTTTCGAATCATCCAAATTGAAAGTACTCTTCTTAGGGGTTGATGAGAAGAAGCATC

CTTCAACGCTCCCTAGGACTTACACACTCACTCACAGTGACATTACAGCTAAACTAACCT

TAGCTATTTCTCAATCCATAAACAACTCTCAGTTGCAAGGATGGGCAAATAGGCTATACC

GGGATGAAGTTGTGGCAGAATGGAAGAAAGTGAAAGGGAAAATGTCGCTTCACGTTCA

TTGTCACATAAGCGGTGGCCATTTCCTTTTAGATCTCTTTGCAAAGTTTCGATATTTCATC

TTTTGCAAAGAACTACCTGTGGTGTTGAAGGCTTTTGTGCATGGAGATGGGAACTTGTT

GAACAACTATCCTGAGCTACAAGAAGCTCTTGTTTGGGTCTATTTCC ata

SEQ ID No：6的信息

    长度：29，28碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：寡核苷酸

    序列描述：SEQ ID No：6

正义5’taa gag ctc att cag aca aac gga gta ac 3

反义5’aga gtc gac gga aat aga ccc aaa caa g 3

SEQ ID No：7的信息

    长度：534碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：基因组DNA

    序列描述：SEQ ID No：7

aga

GGAAATAGACCCAAACAAGAGCTTCTTGTAGCTCAGGATAGTTGTTCAACAAG

TTCCCATCTCCATGCACAAAAGCCTTCAACACCACAGGTAGTTCTTTGCAAAAGATGAA

ATATCGAAACTTTGCAAAGAGATCTAAAAGGAAATGGCCACCGCTTATGTGACAATGAA

CGTGAAGCGACATTTTCCCTTTCACTTTCTTCCATTCTGCCACAACTTCATCCCGGTATAG

CCTATTTGCCCATCCTTGCAACTGAGAGTTGTTTATGGATTGAGAAATAGCTAAGGTTAG

TTTAGCTGTAATGTCACTGTGAGTGAGTGTGTAAGTCCTAGGGAGCGTTGAAGGATGCT

TCTTCTCATCAACCCCTAAGAAGAGTACTTTCAATTTGGATGATTCGAAAATCGCCGGTC

CAAACAACCTTGCAACGGGAACAATCGATTGGTTCTTCTTCTTGGATCTTCTATTGTTGA

AGAAGAGTGAGCTGCTGCTGCTACTGTTACTCCGTTTGTCTGAAT tta

                            序列表

<110>复旦大学

<120>一种调控叶绿素代谢的关键基因及其创建植物滞绿性状的方法

<130>11

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>植物

<400>1

atgtgtagtt tgtcggcgat tatgttgtta ccaacgaagc tgaaaccagc ttattcagac     60

aaacggagta acagtagcag cagcagctca ctcttcttca acaatagaag atccaagaag    120

aagaaccaat cgattgttcc cgttgcaagg ttgtttggac cggcgatttt cgaatcatcc    180

aaattgaaag tactcttctt aggggttgat gagaagaagc atccttcaac gctccctagg    240

acttacacac tcactcacag tgacattaca gctaaactaa ccttagctat ttctcaatcc    300

ataaacaact ctcagttgca aggatgggca aataggctat accgggatga agttgtggca    360

gaatggaaga aagtgaaagg gaaaatgtcg cttcacgttc attgtcacat aagcggtggc    420

catttccttt tagatctctt tgcaaagttt cgatatttca tcttttgcaa agaactacct    480

gtggtgttga aggcttttgt gcatggagat gggaacttgt tgaacaacta tcctgagcta    540

caagaagctc ttgtttgggt ctatttccat tctaatgtca atgagttcaa caaagtcgag    600

tgttggggtc cgctttggga agctgtttcg cctgatggtc acaagactga gactcttccc    660

gaggctcggt gtgcggacga gtgtagttgt tgttttccaa ccgttagctc gattccatgg    720

tctcatagtc ttagtaatga aggtgtaaat ggttactctg ggactcagac tgagggaatt    780

gctactccaa atccggagaa actctag                                        807

<210>2

<211>4091

<212>DNA

<213>植物

<400>2

cagctgcagt ggaggtgaca ggaggcttca gattcggcat cacaatcgct ctcttaaaat     60

tactcgcact gcacataatt acatacacca ttaaccatca tgtacagcac aagcatcaac    120

gccagcacaa gattgtgatt gaggaattca tacataacaa acaatggttc cacaagaaac    180

accaatagca aacaaaaaag tggctgcaaa acaaagtaaa gcaaggaaag aaaagaaaga    240

ttgcaggatg tttataagac ctgtggggaa caacagcatg aagaagatca ccgtcacgga    300

gatgaagatg ccaatcatca ggttgagtga ttgtgagctc cattcttact gctctcgtct    360

tcactttctc agaagatctg tcaaacttca acttctgaga tccaaatccc tacataaaga    420

ataaaatagt tgactttaac agacgcatag gaggaattaa ataaaattaa aactggatca    480

cgtggattga actaaacaag aataagactc aaagagtggt ggaggtagag tacatacact    540

ataaggagag accaaagtct ttatcatctg aaagctgctc aaggctttgc aagaattcac    600

ctgttccaaa gcaaatgaca agtagactca gattctataa catgacctta aaaaattgac    660

tctgttctaa agtattagca ggcactaaaa ctattcaatc atcatcaaaa gatttcgcat    720

tcctttggtt caatgtttct ccaaacgaaa tttagtatcc agattaatca aatttctata    780

cacacaaatg ggtatcagca aaatccaaag aaatcaaatt atccaaacaa taaaccacaa    840

aatggcgaaa ctggtaaaca cctagaaacc aaaatcgaaa acttgaactt gtttaggtaa    900

gcaatacgaa cctggataaa cgaaatgcac aacagggatg cttacaacac aaacaaaacg    960

aaccccaaaa agagtgattt gaggaagaga ttgaaggaga aagaagaaga aaaaacagta   1020

ctcgtgtttt gttgtttaca agatacgacg tcgcttaacg taaaagaaga agaaaaaaat   1080

aaaagctctg taacaggcca gcccaatttt agcccgatat ttttaatgga cctggacctg   1140

atcacaaatt tcagcccttt ttaacatcct tatggatcaa catgggactc tctgactcct   1200

ccggttccat caatacctgc gtttgttgtc cttgttcacg acgattcaag cgaagaagcc   1260

tctcgagttt cacaggtcta ataactaaac cgagtaatcg agtcgaatga cattaaattg   1320

aaccgaaact aaaccgtatt gctttaggtt cgactgacaa ctacagtacg tgagttaggt   1380

tcggttagag ccgaatctgt gtctctttgt cgcaacgaga tggctaaagt tatccaaaaa   1440

gacggttaga gccagttgtt agccccacca tgacgacaca tggggaagct catgcaaaga   1500

ttagagaaca cgtggcactc tctcgtgttc agaaaaattc caaaagagtg ttcagatttg   1560

ggcacggaag tgtgaaacgt gaagcaacaa tcccttttaa acacaagaac caactcaata   1620

cgcatcacaa agaaccctaa attcctggaa gatctcaaaa ggaaaattca aaaccaaagc   1680

ttcaagcaat catcaagcaa aggaaaagct caaattttgg gtcttttata tatttatttc   1740

ttaaagttac aatctttttg attgtggttt cagtgtacga acacgcaaga actcgcgtga   1800

aaaaattgta tccaagcttc gtgaaaggag tctctctgta tttagtggcg ttttgttctg   1860

ttgttatttc tgaaatattg aagcttttga tttgggtttc aagagagcag agatgtgtag   1920

tttgtcggcg attatgttgt taccaacgaa gctgaaacca gcttattcag acaaacggag   1980

taacagtagc agcagcagct cactcttctt caacaataga agatccaaga agaagaacca   2040

atcgattgtt cccgtaagga tttgttctct taatcatttt gacatatctt tgttttatgt   2100

gtctcagtta tggatatatc tatgcctctg tctttattga tggaacttga aacttttggg   2160

atcggtgcag gttgcaaggt tgtttggacc ggcgattttc gaatcatcca aattgaaagt   2220

actcttctta ggggttgatg agaagaagca tccttcaacg ctccctagga cttacacact   2280

cactcacagt gacattacag ctaaactaac cttagctatt tctcaatcca taaacaactc   2340

tcaggtaaaa acacctctct ctctggtctt aacatatcta catggctctg tttataggag   2400

tagaatgttt atgtatttga ttatttggag caaatattag aggcttatgt atgattgttt   2460

taacctatgt atgtgtctat attcaccaga atctcttaac actttagagg ctgatatgta   2520

tagaaatgtt ttttatagtt gcaaggatgg gcaaataggc tataccggga tgaagttgtg   2580

gcagaatgga agaaagtgaa agggaaaatg tcgcttcacg ttcattgtca cataagcggt   2640

ggccatttcc ttttagatct ctttgcaaag tttcgatatt tcatcttttg caaagaacta   2700

cctgtggtaa gttcccaaat tcataagaaa ctttttattg gtttcatgta aaacaaaatg   2760

tttattgttt tgatatatac aggtgttgaa ggcttttgtg catggagatg ggaacttgtt   2820

gaacaactat cctgagctac aagaagctct tgtttgggtc tatttccatt ctaatgtcaa   2880

tgagttcaac aaagtcgagt gttggggtcc gctttgggaa gctgtttcgc ctgatggtca   2940

caagactgag actcttcccg aggctcggtg tgcggacgag tgtagttgtt gttttccaac   3000

cgttagctcg attccatggt ctcatagtct tagtaatgaa ggtgtaaatg gttactctgg   3060

gactcagact gagggaattg ctactccaaa tccggagaaa ctctagtgac taaatatcaa   3120

attacaagtt tttcttttgg tagtttgtac aaagtgaaaa ggaaatggca ggactttcct   3180

tttggtggat ctaaatattg gtttggtttg gtgtacataa tgtggtatag gaaaataatg   3240

attatttgta ggttaaatac agattttaaa gtttcaaatg gtattttgtg tctactctga   3300

agtctttatc atagttgtat acttgtattg tatctcatcc acaagatcaa aatgtaaatt   3360

tcttacagat tagctaatat taaaggtgac agactggtat agtactactg caatgcaaac   3420

ataaagatga ataaattgtt gtttaatgaa catatatatt ttaatatatc aaaacattca   3480

tgagaatcat caccaattta aagttatact aatatcccaa ataagaatag tttagaaata   3540

tgaagatatt catgagaatc atcaccaaag taacaataga cgtatattaa ggaccgaatt   3600

cgtcggtgta acggtgagaa actaaggaga aacgtgaagg taaagagatg gcaaaagact   3660

ttgtctctct ggtggttttg caaagcgtat cagccacttc ttgctcctaa tgattccaaa   3720

ttattttctt ggatttattt ggtctctttc ttcaatatct ttttcatttt ataaccaaat   3780

caagatgact ttttttctct gaccccattc gtctatctaa tttacgacca aatacaccaa   3840

atacagaaag agaagaagaa caagtaatat aagagaatgg taacgaatta ttgcattatt   3900

atcatgggct tattttataa aatgttgtgt tcgtaagtaa ataaatacaa aagaaactat   3960

attttgatat atgaagaaaa attgaataaa gatatacact ttggaaaatt ttgggggaaa   4020

atgttgtgca tcttgatgga aacccaaaga tcgtgattaa atcaaaaggg ttagatcttg   4080

ttggatccgt g                                                        4091

<210>3

<211>534

<212>DNA

<213>植物

<400>3

aattctagaa ttcagacaaa cggagtaaca gtagcagcag cagctcactc ttcttcaaca     60

atagaagatc caagaagaag aaccaatcga ttgttcccgt tgcaaggttg tttggaccgg    120

cgattttcga atcatccaaa ttgaaagtac tcttcttagg ggttgatgag aagaagcatc    180

cttcaacgct ccctaggact tacacactca ctcacagtga cattacagct aaactaacct    240

tagctatttc tcaatccata aacaactctc agttgcaagg atgggcaaat aggctatacc    300

gggatgaagt tgtggcagaa tggaagaaag tgaaagggaa aatgtcgctt cacgttcatt    360

gtcacataag cggtggccat ttccttttag atctctttgc aaagtttcga tatttcatct    420

tttgcaaaga actacctgtg gtgttgaagg cttttgtgca tggagatggg aacttgttga    480

acaactatcc tgagctacaa gaagctcttg tttgggtcta tttcccccgg gata          534

<210>4

<211>534

<212>DNA

<213>植物

<400>4

agagtcgacg gaaatagacc caaacaagag cttcttgtag ctcaggatag ttgttcaaca     60

agttcccatc tccatgcaca aaagccttca acaccacagg tagttctttg caaaagatga    120

aatatcgaaa ctttgcaaag agatctaaaa ggaaatggcc accgcttatg tgacaatgaa    180

cgtgaagcga cattttccct ttcactttct tccattctgc cacaacttca tcccggtata    240

gcctatttgc ccatccttgc aactgagagt tgtttatgga ttgagaaata gctaaggtta    300

gtttagctgt aatgtcactg tgagtgagtg tgtaagtcct agggagcgtt gaaggatgct    360

tcttctcatc aacccctaag aagagtactt tcaatttgga tgattcgaaa atcgccggtc    420

caaacaacct tgcaacggga acaatcgatt ggttcttctt cttggatctt ctattgttga    480

agaagagtga gctgctgctg ctactgttac tccgtttgtc tgaatgagct ctta          534

Claims (7)

1、一种调控叶绿素降解代谢的关键基因，其特征是该调控基因AtNYE1的核苷酸、氨基酸序列为SEQ ID No：1。

2、一种利用叶绿素降解代谢的关键基因AtNYE1创建植物滞绿性状的方法，其特征是通过快中子诱变AtNYE1或同源性30％以上基因，获得滞绿突变体，或者抑制AtNYE1基因的表达，获得滞绿植物性状。

3、如权利要求2所述的滞绿植物为绿叶类植物。

4、如权利要求3所述的绿叶类植物为绿叶菜类植物。

5、如权利要求3所述的滞绿植物为牧草或草坪类植物。

6、如权利要求2所述的方法，其特征是T-DNA载体为RNAi载体，通过形成双链RNA抑制基因表达。

7、如权利要求6所述的方法，其特征是抑制基因表达的重组载体为35S启动子或者衰老诱导增强启动子。

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