CN101831450B

CN101831450B - 一种调控植物衰老进程中叶绿素降解的关键基因及其应用

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Publication number: CN101831450B
Application number: CN 200910047482
Authority: CN
Inventors: 蒯本科; 任国栋; 魏强; 梁宁菁
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2029-03-12
Also published as: CN101831450A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与叶绿素降解调控的关键新基因及其应用。滞绿性状可以延长绿叶蔬菜的货价寿命和饲料作物的采后绿期，进而增加其主要营养成分叶绿素和蛋白质的含量；滞绿性状也可以显著地改善草坪植物的绿期和景观效果。本发明提供了一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1，该基因的氨基酸编码序列特征为Seq IDNo：2。本发明还提供了一种创建滞绿植物品系的方法，即通过化学或物理因子诱变目标植株中AtCRN1基因发生突变，破坏或降低AtCRN1基因的表达。此外，检测植物基因组中是否含有全长AtCRN1基因，还可以作为一种筛选/鉴定滞绿植物品系的分子辅助育种方法。

Description

一种调控植物衰老进程中叶绿素降解的关键基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种参与叶绿素降解调控的关键新基因CRN1及其应用。本发明还提供了一种创建滞绿植物品系的方法，以及一种筛选/鉴定滞绿植物品系的分子辅助育种方法。

背景技术

植物叶片进入衰老程序后，由于叶绿素的快速降解所导致的黄化现象，是几乎所有植物绿色器官衰老的共同、也是最显著的表观特征。虽然叶片衰老可以被许多环境因子和发育因子诱导，但是叶片衰老开始的时间以及过程都是被细胞凋亡过程所调控。在过去数十年中，学者们在许多作物上发现了叶片绿期延迟至成熟或衰老之后，即滞绿(stay-green)或非黄化(non-yellowing)突变体。

根据Thomas，H和Howarth，C.J.(J.Exp.Bot.，51：329，2000)的分类，滞绿突变体可以分为五种基本类型。A型滞绿突变体的衰老启动推迟，但是衰老的速率不变；B型滞绿突变体衰老启动正常，但是叶片黄化和光合速率下降减缓。由于这两类滞绿突变体的光合期被延长，因而被称之为“功能型”滞绿。C型滞绿突变体中叶绿素降解功能由于遗传变异导致的异常，叶绿素含量可以长期维持不变；但是，就生理功能退化而言，与野生型无异。因此该类突变体被称之为“非功能型”滞绿，或“表观”滞绿。D型滞绿突变体是由于速冻或骤干所引起的叶片死亡所致。最后一种为E型突变体，在该种突变体内积聚过量的叶绿素，使得叶片呈深绿色，但光合效率维持不变。D型、E型与C型一样，也为“非功能型”滞绿。

叶绿素降解代谢途径上的三个关键酶基因中(叶绿素酶基因，脱镁叶绿酸氧化酶基因，RCC基因)，只有脱镁叶绿酸氧化酶基因显示出了一定的调控衰老叶片中叶绿素降解的潜力，但是该基因的突变和被过度抑制会引起有毒中间产物的积累，进而导致叶片上出现类似于创伤引起的坏死斑点(

，S.Annu.Rev.Plant Biol.57：55-77，2006)。

迄今为止，研究得最广泛、最深入的滞绿突变体是草地羊毛(Festucapratensis)滞绿突变体及其衍生遗传材料(Thomas，H.，Planta，137：53，1977；Thomas，H.，Planta，154：212，1982；Thomas，H.，Theor.Appl.Genet.，73：551，1987；Thomas，H.& Matile，P.，Phytochemistry，27：342，1988)。该突变体是一种自然发生的变异体，受核内单隐形位点(sid)的调控；属于非功能型突变。与野生型相比，在衰老叶片中有明显的脱植醇叶绿素酸酯、羟基叶绿素酸酯和脱镁叶绿酸的积累；而且，叶绿素捕光结合蛋白(light harvest chlorophyll-binding protein)的稳定性也显著地增加。但是，可溶性蛋白，特别是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)大亚基的降解速率没有差异。

在大豆中，滞绿性状受到三个核基因(G和dld2)和一个胞质基因(cytG)的控制(Guiamet，J.J.，et al.，Plant Cell Physiol.，31：1123，1990)。一个显性基因G使种皮维持绿色。一个胞质基因，cytG和两个隐性基因，d1d1d2d2和G_d1d1d2d2调控叶片、果荚、种皮和胚中的绿色色素。据报道，cytG的突变可使得衰老叶片中的叶绿素b比叶绿素a更加稳定，因而抑制了叶绿素的降解。d1d1d2d2纯合突变可使衰老叶片中叶绿素和可溶性Rubisco蛋白的降解显著延迟(Guiamet，J.J.et al.，Plant Physiol.，96：227，1991；Guiamet，J.J.et al.，Physiol.Plant.，96：655，1996)

在干菜豆(Phaseolus vulgaris)的滞绿突变体中，也报道了衰老叶片中叶绿素滞留的现象(Backmann，A.et al.Biochem.Bioph.Res.Co.203：1362-1362，1994)。但是，在突变体中既没有发现叶绿素酶活性的改变，也没有检测到脱镁叶绿酸的积累。然而，相比于野生型，突变体中的叶绿素酸酯a和b的确有积累，表明脱镁螯合酶活性可能存在缺陷(Fang，Z.，etal.J.Exp.Bot 49：503-510，1998)。

在水稻上，也筛选到了受单隐形核基因调控的滞绿突变体sgr(t)，并被定位在9号染色体长臂上的RFLP标记RG662和C985之间(Cha et al.，TAG.104：526-532，2002)。

最新研究表明，sid，水稻sgr(t)，番茄(gf)以及辣椒(cl)等均编码拟南芥AtNYE1直系同源基因，其在豌豆中的同源基因控制着子叶黄/绿性状(Armstead et al.New Phytol.，172，592-597.2006，Armstead et alScience，315，73.2007；Park et al.Plant Cell，19，1649-1664.2007；Ren et al.Plant Physiol.，144，1429-1441.2007；Barry et al.PlantPhysiol.147：179-187)。

发明内容

本发明的目的是获得调控叶绿素降解代谢的关键调控基因。

本发明的另一个目的是获得一种创建植物滞绿性状的方法。

本发明的内容之一是从拟南芥中克隆了叶绿素降解代谢的关键调控基因AtCRN1；内容之二是利用CRN1基因，可以但不仅限于运用RNAi等基因工程手段，创建植物滞绿性状。

本发明提供了一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1，其中该基因的氨基酸编码序列特征如Seq ID No：2所示。

本发明还提供了一种调控植物叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1，其中该基因的核苷酸编码序列特征如Seq ID No：1所示。

本发明的AtCRN1基因可以根据Seq ID No：1通过人工合成方法获得其核苷酸编码序列。

另一方面，本发明提供了滞绿植物的一种制备方法，即通过化学或物理因子诱变目标植株中AtCRN1基因发生突变，破坏或降低AtCRN1基因的表达。

本发明的制备方法中，所述的化学因子可以是EMS(甲基磺酸乙酯)等。

本发明的制备方法中，所述的物理因子可以是快中子等辐射诱变因子。

本发明的制备方法中，可以将AtCRN1基因或基因片断导入T-DNA载体，用T-DNA载体转化目标植物，抑制AtCRN1基因的表达。可以通过农杆菌介导T-DNA插入AtCRN1以破坏或降低AtCRN1基因的表达。

本发明的制备方法中，所述的目标植株可以为绿叶菜类植物、饲草或草坪类植物。

本发明的制备方法中，所述的T-DNA载体可以为siRNA或者miRNA载体等反义RNA载体。

本发明的制备方法中，用于抑制AtCRN1基因表达的重组载体含有35S、actinl、ubiquitinl或者衰老增强启动子等，以便更好更强的产生滞绿性状。

在本发明中，术语“AtCRN1基因核苷酸编码序列”指编码AtCRN1基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1-1452位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框1-1452位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1-1452位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-1452位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-1452位同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

在本发明中，“AtCRN1蛋白”指氨基酸编码序列如SEQ ID NO.2的多肽。该术语还包括具有与该蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括该蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的AtCRN1基因可以根据其核苷酸编码序列通过人工合成方法获得。也可以用分子克隆的常规手段，按照AtCRN1基因序列设计引物，从植物基因组中克隆得到。

本发明对已有滞绿性状相关文献结果中选出的827个在各种衰老条件下都表达的基因进行了G0分类，然后利用expression angler程序(Toufighet al Plant J.43，153-163 2005)分析获得了若干与NYE1表达谱最为相似的基因(见附图1)。接着，本发明从拟南芥生物资源中心(ABRCwww.arabidopsis.org/abrc/)订购了这些基因的T-DNA插入突变体，播种于1/2MS+30mg/L Kan的平板上，对出现明显滞绿效应得小苗的基因组DNA进行PCR分析，结果表明，该T-DNA插入在目的基因At5g13800位置的第3个外显子上，是纯合的插入突变体。进一步半定量PCR分析证明，纯合突变体中全长基因没有表达(见附图6)，我们将该基因命名为CRN1(co-regulatedwith NYE1，SEQ ID No.1)，突变体crn1-1。

验证实验结果表明，crn1-1中叶绿素的降解速率较nye1-1更为缓慢(见附图2-4，7)，显示CRN1在创造植物滞绿品系上具有更大的应用前景。

本发明提出的一种利用调控叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1创建植物滞绿的方法，通过各种诱变/插入突变方法突变AtCRN1或同源度40％以上AtCRN1的同源基因，获得滞绿突变体，抑制AtCRN1基因的表达，获得植物滞绿性状。

本发明提出的一种利用调控叶绿素降解代谢的关键基因AtCRN1创建植物滞绿方法，将AtCRN1基因或基因片断导入T-DNA载体，用T-DNA载体转化野生型植株，获得植物滞绿性状。

本发明中，插入突变为T-DNA插入。T-DNA载体为RNAi载体，通过形成双链RNA抑制目的基因表达。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA特异性地诱发与其序列同源的mRNA分子被降解，从而抑制相应基因的表达的现象(Fire et al.Nature 391：806-811.1998)，是一种特殊的转录后基因表达沉默(posttranscriptional gene silence，PTGS)现象。

本发明构建了AtCRN1的RNAi表达载体。方法是用带XbaI和SmaI酶切位点的引物(SEQ ID No.3和4)扩增正义链，PCR产物连接用同样酶切处理pPZPY122质粒载体。通过类似的过程继续连入反义链(使用带SacI的SEQ IDNo.5和带有Sal I酶切位点的带XbaI和SmaI酶切位点6为引物)和loop区段。最后得到插入了sense:loop:antisense结构片断的RNAi表达载体pPZPYAtCRN1。该质粒载体通过电转化导入农杆菌LBA4404，在含有氯霉素，利福平，链霉素的YEB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。对T1代转基因植株进行PCR检测，DNA(southern blots)分析和滞绿性分析，以及对T2代进行抗性分离和滞绿特性分析，结果表明运用RNAi技术抑制AtCRN1基因的表达能够创建滞绿性状。

利用RNAi技术抑制CRN1基因的表达创建绿叶菜和牧草类植物的滞绿性状。

利用上述RNAi载体，构建旨在抑制青菜体内BnCRN1或黑麦草体内LpCRN1表达的载体，通过农杆菌LBA4404介导，转化青菜花蕊或黑麦草胚性愈伤组织，在含有选择压力的培养基上筛选可能的转化体，获得可能的转化植株。对T1代植株进行PCR检测和目的基因表达分析，以量化内源CRN1基因被抑制的水平。在CRN1基因被显著抑制的植株中，衰老叶片表现典型的滞绿性状，没有观察到不利的表型特征。

检测植物基因组中是否含有全长AtCRN1基因，还可以作为一种筛选/鉴定滞绿植物品系的分子辅助育种方法。

本发明获得了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因AtCRN1，通过抑制该基因的表达可以创建植物滞绿品系。该基因的变异和被抑制，除了导致衰老叶片滞绿以外，不引起任何可见的不利形态变异。滞绿性状可以延长绿叶蔬菜的货价寿命和饲料作物的采后绿期，进而增加其主要营养成分叶绿素和蛋白质的含量；滞绿性状也可以显著地改善草坪植物的绿期和景观效果。

附图说明

图1是67个衰老诱导响应的、叶绿体定位的蛋白的基因表达模式图。其中，框内为与NYE1表达模式最为接近的几个基因：At3g44880(ACD1)，At2g25625，At4g22920(ATNYE1)，At5g13800，At5g39520。

图2是在黑暗诱导4天后的crn1-1突变体叶片。其中，Col-0叶片已经基本全部呈黄色，crn1-1叶片则基本为绿色，nye1-1叶片略微发黄。

图3是自然衰老的叶片表型照片。其中Col-0叶片与crn1-1叶片相比，发黄的速度和面积明显增加。

图4是整株自然衰老表型图。其中，crn1-1的植株为绿色，而Col-0的叶片至少有半数已呈黄色。

图5是crn1-1突变体的鉴定图。图示T-DNA插入在CRN1基因的第三个外显子中。

图6是crn1-1中CRN1全长基因表达的半定量PCR分析结果图。使用模板DNA为黑暗处理3天后叶片中RNA的反转录产物，PCR反应循环数为29。可见，crn1-1没有CRN1全长基因。

图7是黑暗处理过程中crn1-1叶片中叶绿素降解的柱形图。与Col-0和nye1-1相比，crn1-1的叶绿素含量下降幅度明显减少。

图8.AtCRN1与大豆GmCRN1部分氨基酸序列的比较。相同氨基酸在中间栏标出，“+”代表生化性状相近的氨基酸(下同)。

图9.AtCRN1与水稻OsCRN1部分氨基酸序列的比较。

图10.AtCRN1与玉米ZmCRN1部分氨基酸序列的比较。

图11.AtCRN1与青菜BnCRN1部分氨基酸序列的比较。

图12.基于clustalW方法的物种间多序列的比较图。黑色背景表示完全一致的残基，灰色背景表示部分一致的残基图。

具体实施方式

实施例1：AtNYE1共表达基因筛选

Buchanan-Wollaston等(Buchanan-Wollaston et al.Plant J.42，567-585，2005)比较了各种衰老条件下拟南芥全基因组基因表达的水平，我们对文献结果中选出的827个在各种衰老条件下都表达的基因进行了GO分类，结果表明这些基因中有67个编码叶绿体定位蛋白，NYE1，PaO等叶绿素降解相关基因也在其中。利用expression angler程序(Toufigh et al PlantJ.43，153-163 2005)分析这67个基因，获得了若干与NYE1表达谱最为相似的基因(见附图1)。

实施例2：T-DNA插入突变体分析和CRN1的鉴定

我们从拟南芥生物资源中心(ABRC www.arabidopsis.org/abrc/)订购了这些基因的T-DNA插入突变体，播种于1/2MS+30mg/L Kan的平板上，10天后移出具有抗性的小苗到土壤中，当植株的第6片莲座叶完全展开时，取第3-4片叶片进行黑暗处理，结果发现有一株(突变体编号SALK_000095)呈现明显的滞绿性状(见附图2-4)。对基因组DNA进行PCR分析的结果表明，该T-DNA插入在目的基因At5g13800位置的第3个外显子上，是纯合的插入突变体(见附图5)。半定量PCR分析表明，SALK_000095纯合突变体中全长基因没有表达(见附图6)，我们将该基因命名为CRN1(co-regulated withNYE1，SEQ ID No.1)，突变体crn1-1。

CTAB法小管抽取植物基因组DNA：

(1)单株收取拟南芥叶片1-2片置于1.5ml Eppendorf管中，液氮保存，将2％的CTAB溶液在65℃的水浴锅中预热；

(2)用液氮预冷的研磨棒充分研磨植物材料，加入预热的CTAB溶液600ul，混匀；

(3)65℃水浴20-30min，中间轻摇数次；

(4)13,000rpm，离心10min，转移上清到新的Eppendorf管中；

(5)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇，约500ul，混匀；

(6)13,000rpm，离心10min，转移上清到新的Eppendorf管中；

(7)加2/3体积的异丙醇，约400ul，颠倒混匀，静置10min；

(8)13,000rpm，离心10min，弃上清；

(9)约400ul的70％乙醇洗涤沉淀1-2次；

(10)55℃下干燥5min，加50μlTE，1μl RNA酶溶解沉淀；

(11)-20℃下保存DNA样品，

[CTAB缓冲液：CTAB(2％)，Tris.Cl pH8.0(100mmol/L)，EDTA pH8.0(20mmol/L)，NaCl(1.4mol/L)]

T-DNA突变体鉴定所用引物：

LP：CTACCAATCCTGGACTCCTCC(见SEQ ID NO 7)

RP：TGTACAGGTTATCGGTGAGCC(见SEQ ID NO 8)

LBb1：ATTTTGCCGATTTCGGAAC(见SEQ ID NO 9)

半定量PCR引物

ACT2-S CGCTCTTTCTTTCCAAGCTC(见SEQ ID NO 10)

ACT2-A AACAGCCCTGGGAGCATC(见SEQ ID NO 11)

CRN1-FL-S ATGGAGATAATCTCACTGAACG(见SEQ ID NO 12)

CRN1-FL-A CTATGCAGACTTCCCTCCAAAC(见SEQ ID NO 13)

PCR反应体系(50μl体系)

H₂O 40.3μl

10×PCR缓冲液 5.0μl

10×dNTP(1mM) 1.0μl

DNA模板 1.0μl

LP(20μM) 0.5μl

RP(20μM) 0.5μl

LBb1(20um) 0.5μl

Taq酶 0.2μl

PCR反应条件

Step1 94℃ 5min

Step2 94℃ 45sec

Step3 55℃ 45sec

Step4 72℃ 90sec

Step2～4循环30次

Step5 延伸72℃ 5min

注：退火温度依据引物特性做相应调整(step3，一般为引物Tm-5℃)和延伸时间(step 4，一般为1min/kb)

实施例3：插入突变体表型分析和叶绿素含量测定

当植株的第6片莲座叶完全展开时，取第3-4片叶片进行黑暗处理；叶片置于垫有2层湿润滤纸的培养皿中处理不同天数后取样，进行总叶绿素含量测定。结果表明，crn1-1中叶绿素的降解速率较nye1-1更为缓慢(见附图7)，显示CRN1在创造植物滞绿品系上具有更大的应用前景。

叶绿素测定：

0.1g新鲜叶片，加液氮研磨后，用3ml丙酮萃取。黑暗条件下静置，防止叶绿素分解。待叶绿素完全萃取溶入丙酮后，用分光光度计测定A645，A663值，并通过下列公式计算它们的含量：

Chl a(mg.ml-1)＝0.0127A663-0.00269A645

Chl b(mg.ml-1)＝0.0229A663-0.00468A645

实施例4：CRN1基因的生物信息学分析

CRN1属于esterase/lipase超家族成员，我们猜测可能具有叶绿素酶类似的功能。运用Chlorop(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)和PPDB(http://ppdb.tc.cornell.edu/)分析表明，CRN1 N末端的46个残基为叶绿体定位信号肽(cTP)。Blast分析发现同CRN1基因在拟南芥中与其同源性较高的是NP_195371(At4g36530)，其部分序列一致性仅为29％(95/324)，以及NP_568381(At5g19850)，其部分序列一致性仅为25％(80/318)。因此认为，CRN1在拟南芥中为单拷贝基因。CRN1在其他物种中普遍存在同源性较高的基因，可能是CRN1的直系同源基因。tBLASTn结果表明CRN1在水稻、玉米、大豆和青菜等重要农作物中均含有高保守性同源基因。AtCRN1与大豆GmCRN1部分氨基酸具有60％(270/448)的同源性，与水稻OsCRN1部分氨基酸有59％(269/449)同源性，与玉米ZmCRN1部分氨基酸有66％(259/392)同源性，与青菜BnCRN1部分氨基酸序列有75％(183/243)同源性(图8-11)。

实施例5利用RNAi技术抑制CRN1基因的表达创建有滞绿性状的植株

构建AtCRN1的RNAi表达载体。方法是用带XbaI和SmaI酶切位点的引物(SEQ ID No.3和4)扩增正义链，产物回收后用XbaI和SmaI双酶切，再回收酶切产物；用同样酶切处理pPZPY122质粒载体。将产物酶切回收片断与载体酶切回收片断通过T4DNA连接酶连接，然后用自带引物测序，筛选鉴定正确的克隆。以此载体作为二次克隆的载体，通过类似的过程继续连入反义链(SEQ ID No.5和6)和loop区段(图12中的intron)。最后得到插入了sense:loop:antisense结构片断的RNAi表达载体pPZPYAtCRN1。该质粒载体通过电转化导入农杆菌LBA4404，在含有氯霉素，利福平，链霉素的YEB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆。用蘸花法侵染拟南芥Col-0野生型。收获的种子在含90mg/L庆大霉素的培养基上筛选，抗性苗移至土壤。对T1代转基因植株进行PCR检测，DNA(southern blots)分析和滞绿性分析，以及对T2代进行抗性分离和滞绿特性分析，结果表明运用RNAi技术抑制AtCRN1基因的表达能够创建滞绿性状。

实施例6利用RNAi技术抑制CRN1基因的表达创建绿叶菜和牧草类植物的滞绿性状。

序列表

<210>1

<211>1455

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1455)

<223>

<400>1

atg gag ata atc tca ctg aac gtt gtg ccc cag tgc tct gtg gtt act 48

Met Glu Ile Ile Ser Leu Asn Val Val Pro Gln Cys Ser Val Val Thr

1 5 10 15

tgg agt agt aaa tta gca acg aaa aga ttg gtc cca aat cgg tca agt 96

Trp Ser Ser Lys Leu Ala Thr Lys Arg Leu Val Pro Asn Arg Ser Ser

20 25 30

ttg tta ttc tca ggg gtc aaa aaa tcc aga ctt gtg att cga agt gga 144

Leu Leu Phe Ser Gly Val Lys Lys Ser Arg Leu Val Ile Arg Ser Gly

35 40 45

aat tcc gat ggt tat gtt gtt ggt gag aat gat gac ttg ggt cgt ata 192

Asn Ser Asp Gly Tyr Val Val Gly Glu Asn Asp Asp Leu Gly Arg Ile

50 55 60

gcc aga aga gga gaa tca acg tca aag gtt ttg att cct ggt ttg cct 240

Ala Arg Arg Gly Glu Ser Thr Ser Lys Val Leu Ile Pro Gly Leu Pro

65 70 75 80

gat gaa tca aat ggt gaa att gct gct cga atc agt cat tct cac tgc 288

Asp Glu Ser Asn Gly Glu Ile Ala Ala Arg Ile Ser His Ser His Cys

85 90 95

gag tgg aag ccc aag ctt aga gta cat tat gag aaa gcc ggt tgt gac 336

Glu Trp Lys Pro Lys Leu Arg Val His Tyr Glu Lys Ala Gly Cys Asp

100 105 110

aat ctc gat gct cct gcg gtg ttg ttt ctt cct ggc ttt ggc gtt ggt 384

Asn Leu Asp Ala Pro Ala Val Leu Phe Leu Pro Gly Phe Gly Val Gly

115 120 125

tca ttt cac tat gag aag cag ctt acc gat ttg gga agg gat tat cga 432

Ser Phe His Tyr Glu Lys Gln Leu Thr Asp Leu Gly Arg Asp Tyr Arg

130 135 140

gta tgg gct att gat ttt ctt gga cag ggt tta tct ctc cct act gaa 480

Val Trp Ala Ile Asp Phe Leu Gly Gln Gly Leu Ser Leu Pro Thr Glu

145 150 155 160

gat cct act acc atg act gaa gaa acc agt tcc tcg gaa gat aag gaa 528

Asp Pro Thr Thr Met Thr Glu Glu Thr Ser Ser Ser Glu Asp Lys Glu

165 170 175

cca ttt tgg gga ttt ggt gac aaa act gaa ccg tgg gct gat caa ctt 576

Pro Phe Trp Gly Phe Gly Asp Lys Thr Glu Pro Trp Ala Asp Gln Leu

180 185 190

gta ttc tct ctg gat ctc tgg agg gat caa gtt cag tat ttt gta gaa 624

Val Phe Ser Leu Asp Leu Trp Arg Asp Gln Val Gln Tyr Phe Val Glu

195 200 205

gag gtt atc ggt gag cct gtg tac att gca ggg aac tca ctt gga ggg 672

Glu Val Ile Gly Glu Pro Val Tyr Ile Ala Gly Asn Ser Leu Gly Gly

210 215 220

tat gta gct ctc tac ttt gca gca acc cat cct cac ctg gtt aag ggt 720

Tyr Val Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Thr His Pro His Leu Val Lys Gly

225 230 235 240

gtt acc ttg ctt aat gca aca cct ttc tgg ggt ttc ttc cct aat cca 768

Val Thr Leu Leu Asn Ala Thr Pro Phe Trp Gly Phe Phe Pro Asn Pro

245 250 255

gta aga tcc cca aag cta gca cgt ctc ttt cca tgg ccc gga gca ttc 816

Val Arg Ser Pro Lys Leu Ala Arg Leu Phe Pro Trp Pro Gly Ala Phe

260 265 270

cct ctg ccg gaa aga gtg aaa aaa atc aca gaa ttg gtg tgg caa aag 864

Pro Leu Pro Glu Arg Val Lys Lys Ile Thr Glu Leu Val Trp Gln Lys

275 280 285

ata agt gat cct gaa agc ata gct gag ata ctt aaa cag gtc tac aca 912

Ile Ser Asp Pro Glu Ser Ile Ala Glu Ile Leu Lys Gln Val Tyr Thr

290 295 300

gac cat tct atc aat gtg gat aaa gta ttc tca cgt att gtg gag gtc 960

Asp His Ser Ile Asn Val Asp Lys Val Phe Ser Arg Ile Val Glu Val

305 310 315 320

aca cag cat ccg gct gct gca gca tcg ttt gct tca atc atg ctt gct 1008

Thr Gln His Pro Ala Ala Ala Ala Ser Phe Ala Ser Ile Met Leu Ala

325 330 335

cct ggt gga gag cta tct ttc tcc gaa gct tta tct agg tgt aag gaa 1056

Pro Gly Gly Glu Leu Ser Phe Ser Glu Ala Leu Ser Arg Cys Lys Glu

340 345 350

aac aat gtt cag ata tgt ctc atg tat gga aga gaa gat cca tgg gtg 1104

Asn Asn Val Gln Ile Cys Leu Met Tyr Gly Arg Glu Asp Pro Trp Val

355 360 365

aga ccg tta tgg gga aag aag ata aag aag gaa atc ccc aac gct cca 1152

Arg Pro Leu Trp Gly Lys Lys Ile Lys Lys Glu Ile Pro Asn Ala Pro

370 375 380

tac tac gag atc agc cca gcg ggt cac tgc cca cac gat gaa gtc cct 1200

Tyr Tyr Glu Ile Ser Pro Ala Gly His Cys Pro His Asp Glu Val Pro

385 390 395 400

gag gtg gtg aac tat ctg atg cgc ggg tgg atc aag cac ctg gag tct 1248

Glu Val Val Asn Tyr Leu Met Arg Gly Trp Ile Lys His Leu Glu Ser

405 410 415

ggt ggt ttt gaa gcg ctc ccg ctt ttg gag gac act gaa gaa gat tgg 1296

Gly Gly Phe Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Trp

420 425 430

gag gag tcc agg att ggt aga gaa att gag ttc ccg aga gat ggt tgg 1344

Glu Glu Ser Arg Ile Gly Arg Glu Ile Glu Phe Pro Arg Asp Gly Trp

435 440 445

aaa aaa gca gtg aat ctg tgg tta tat ggg tca aac tat acg tac tgg 1392

Lys Lys Ala Val Asn Leu Trp Leu Tyr Gly Ser Asn Tyr Thr Tyr Trp

450 455 460

aga gga gtt aga gaa tct ttc aga tcc agt ttt ata agg gtg ttt gga 1440

Arg Gly Val Arg Glu Ser Phe Arg Ser Ser Phe Ile Arg Val Phe Gly

465 470 475 480

ggg aag tct gca tag 1455

Gly Lys Ser Ala

<210>2

<211>484

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>2

Met Glu Ile Ile Ser Leu Asn Val Val Pro Gln Cys Ser Val Val Thr

1 5 10 15

Trp Ser Ser Lys Leu Ala Thr Lys Arg Leu Val Pro Asn Arg Ser Ser

20 25 30

Leu Leu Phe Ser Gly Val Lys Lys Ser Arg Leu Val Ile Arg Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Asp Gly Tyr Val Val Gly Glu Asn Asp Asp Leu Gly Arg Ile

50 55 60

Ala Arg Arg Gly Glu Ser Thr Ser Lys Val Leu Ile Pro Gly Leu Pro

65 70 75 80

Asp Glu Ser Asn Gly Glu Ile Ala Ala Arg Ile Ser His Ser His Cys

85 90 95

Glu Trp Lys Pro Lys Leu Arg Val His Tyr Glu Lys Ala Gly Cys Asp

100 105 110

Asn Leu Asp Ala Pro Ala Val Leu Phe Leu Pro Gly Phe Gly Val Gly

115 120 125

Ser Phe His Tyr Glu Lys Gln Leu Thr Asp Leu Gly Arg Asp Tyr Arg

130 135 140

Val Trp Ala Ile Asp Phe Leu Gly Gln Gly Leu Ser Leu Pro Thr Glu

145 150 155 160

Asp Pro Thr Thr Met Thr Glu Glu Thr Ser Ser Ser Glu Asp Lys Glu

165 170 175

Pro Phe Trp Gly Phe Gly Asp Lys Thr Glu Pro Trp Ala Asp Gln Leu

180 185 190

Val Phe Ser Leu Asp Leu Trp Arg Asp Gln Val Gln Tyr Phe Val Glu

195 200 205

Glu Val Ile Gly Glu Pro Val Tyr Ile Ala Gly Asn Ser Leu Gly Gly

210 215 220

Tyr Val Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Thr His Pro His Leu Val Lys Gly

225 230 235 240

Val Thr Leu Leu Asn Ala Thr Pro Phe Trp Gly Phe Phe Pro Asn Pro

245 250 255

Val Arg Ser Pro Lys Leu Ala Arg Leu Phe Pro Trp Pro Gly Ala Phe

260 265 270

Pro Leu Pro Glu Arg Val Lys Lys Ile Thr Glu Leu Val Trp Gln Lys

275 280 285

Ile Ser Asp Pro Glu Ser Ile Ala Glu Ile Leu Lys Gln Val Tyr Thr

290 295 300

Asp His Ser Ile Asn Val Asp Lys Val Phe Ser Arg Ile Val Glu Val

305 310 315 320

Thr Gln His Pro Ala Ala Ala Ala Ser Phe Ala Ser Ile Met Leu Ala

325 330 335

Pro Gly Gly Glu Leu Ser Phe Ser Glu Ala Leu Ser Arg Cys Lys Glu

340 345 350

Asn Asn Val Gln Ile Cys Leu Met Tyr Gly Arg Glu Asp Pro Trp Val

355 360 365

Arg Pro Leu Trp Gly Lys Lys Ile Lys Lys Glu Ile Pro Asn Ala Pro

370 375 380

Tyr Tyr Glu Ile Ser Pro Ala Gly His Cys Pro His Asp Glu Val Pro

385 390 395 400

Glu Val Val Asn Tyr Leu Met Arg Gly Trp Ile Lys His Leu Glu Ser

405 410 415

Gly Gly Phe Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Trp

420 425 430

Glu Glu Ser Arg Ile Gly Arg Glu Ile Glu Phe Pro Arg Asp Gly Trp

435 440 445

Lys Lys Ala Val Asn Leu Trp Leu Tyr Gly Ser Asn Tyr Thr Tyr Trp

450 455 460

Arg Gly Val Arg Glu Ser Phe Arg Ser Ser Phe Ile Arg Val Phe Gly

465 470 475 480

Gly Lys Ser Ala

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

catctagatt gggtcgtata gccagaag 28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cacccgggaa gaaacaacac cgcaggag 28

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

cagagctctt gggtcgtata gccagaag 28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

cagtcgagaa gaaacaacac cgcaggag 28

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ctaccaatcc tggactcctc c 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

tgtacaggtt atcggtgagc c 21

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

attttgccga tttcggaac 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

cgctctttct ttccaagctc 20

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

aacagccctg ggagcatc 18

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

atggagataa tctcactgaa cg 22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

ctatgcagac ttccctccaa ac 22

Claims

1.核苷酸序列如Seq ID No：1所示的AtCRN1基因的抑制表达载体在构建滞绿性状植株中的用途，其特征是，所述的抑制表达载体是插入了sense:loop:antisense结构片断的RNAi表达载体，即pPZPYAtCRN1；

所述的pPZPYAtCRN1的构建方法是用引物SEQ ID No.3和4扩增正义链，PCR产物连接用同样酶切处理pPZPY122质粒载体；利用引物SEQ ID No.5和6通过类似的过程继续连入反义链和loop区段；最后得到插入了sense:loop:antisense结构片断的RNAi表达载体pPZPYAtCRN1。

2.如权利要求1所述的用途，其特征是所述的滞绿性状植株为具有滞绿性状的绿叶菜类植物、饲草或草坪类植物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的滞绿性状植株为具有滞绿性状的青菜或黑麦草植株。

4.权利要求1所述的AtCRN1基因的抑制表达载体，其特征在于，所述载体为siRNA或miRNA载体；

所述抑制表达载体的构建方法包括步骤：

（1）用带XbaI和SmaI酶切位点的、序列如SEQ ID NO 3和4所示的引物扩增正义链，产物回收后用XbaI和SmaI双酶切，再回收酶切产物；

（2）用同样酶切处理pPZPY122质粒载体；

（3）将步骤（1）获得的产物酶切回收片断与步骤（2）获得的载体酶切回收片断通过T4DNA连接酶连接,然后用自带引物测序，筛选鉴定正确的克隆；

（4）以步骤（3）获得的载体作为二次克隆的载体，利用序列如SEQ ID NO5和6所示的引物继续连入反义链和loop区段；

（5）得到插入了sense:loop:antisense结构片断的RNAi表达载体，即pPZPYAtCRN1。

5.含有权利要求4所述的抑制表达载体的农杆菌LBA4404。

6.权利要求4所述的抑制表达载体转化拟南芥材料的方法，其特征在于，权利要求4所述的抑制表达载体通过电转化导入农杆菌LBA4404，在含有氯霉素，利福平，链霉素的YEB培养基上挑单克隆，并用PCR鉴定阳性克隆；用蘸花法侵染拟南芥Col-0野生型。