CN104320968B - 棉花PHYA1 RNAi改善陆地棉的纤维品质、根伸长、开花、成熟和产量潜力 - Google Patents
棉花PHYA1 RNAi改善陆地棉的纤维品质、根伸长、开花、成熟和产量潜力 Download PDFInfo
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Abstract
改善陆地栽培品种(陆地棉)的纤维品质同时保持早成熟和产量是常规的棉花育种的主要问题。光敏色素在植物发育、开花和棉花纤维长度中起重要的作用。靶向棉花的PHYA1基因的RNAi抑制PHYA1和/或PHYB的表达，导致剩余PHYA2/B/C/E基因的过表达。该改变的表达诱导许多光敏色素相关的表型，包括与对照植株相比，增加的根长度和质量、增加的花青素色素、旺盛的芽发育和营养生长、早开花、棉铃早成熟、增加的纤维长度和增加的籽棉产量。这些RNAi表型稳定遗传，贯穿四代(T0‑3)表达并且经常规的杂交从RNAi Coker‑312植株转移至陆地栽培品种。陆地棉花育种中的这些作用可提供棉花育种的新典范，导致开发出具有增加的纤维长度和纤维强度的多产的、早成熟陆地栽培品种。
Description
发明背景
技术领域
本发明涉及陆地棉植物中光敏色素基因调节开花、纤维起始和伸长以及受光形态发生改变影响的其他特征；包含多核苷酸编码光敏色素A1蛋白质的PHYA1基因沉默构建体，包含PHYA1 RNAi多核苷酸的转基因棉花植株和使用光敏色素PHYA1基因的RNA干扰产生新型转基因植物的方法，所述新型转基因植物由于PHYA1的抑制和其他光敏色素基因表达的数倍增加，展示改善的棉花纤维品质、早开花和早棉铃成熟，增强的根伸长和增加的籽棉产量。背景技术
光是控制植物发育和生理学的最重要环境因素。其本质上影响植物生长的所有方面，从种子萌发到植物形态、花芽发生、生理节奏的控制、基因调节和表达、向重力性和向光性(Fankhauser和Chory.1997.Ann.Rev.Cell Dev.Biol.13:203-229；Furuya和Kim.2000.Trends in Plant Sci.3:87-88；Tepperman等2001.Proc.Natl.Acad.Sci.美国98(16):9437-9442)。植物通过数种光感受器系统对光作出反应。光敏色素光感受器基因家族的最佳表征为模式植物拟南芥属，其具有五个光敏色素基因PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE(Sharrock和Quail.1989.Genes Dev.3:1745-1757；Clack等1994.PlantMol.Biol.25:413-427；Cowl等1994.Plant Physiol.106:813-814)。光敏色素与隐花色素、生物钟、植物激素和其他信号相互作用，调节花芽发生(Devlin等1998.Plant Cell 10:1479-1487；Devlin等1999.Plant Physiol.119:909-915；Koornneef等1997.Plant Cell&Environ.20:779-784；Koornneef等1998.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49:345-370)。在拟南芥属中，PHYA促进植物开花。该基因中的突变造成拟南芥属中的晚开花表型(Neff和Chory.1998.Plant Physiol.118:27-35)。相反，PHYB是开花诱导的抑制因子(Koornneef等1998，前文；Reed等2000.Plant Physiol.122:1149-1160)。PHYB的突变造成拟南芥属(Bagnall等1995.Plant Physiol.108:1495-1503)、豌豆(Mockler等1999.Dev.106:2073-2082)和高粱(Childs等1997.Plant Physiol.97:714-719)在短日照(SD)和长日照(LD)条件下都早开花。过表达PHYA、对光周期低敏感的植物在SD和LD下都表现出光依赖性矮小、暗绿色叶子、顶端优势降低和早开花表型(Bagnall等，前文)。PHYB/D/E过表达与下胚轴长度的变短(Clough等1995.Plant Physiol.109:1039-1045；Devlin等1999，前文；Devlin等1998，前文；Lin，C.2000.Plant Physiol.1239:39-50)以及如在例如phyb突变体中观察到的早开花表型相关，表明PHYB更复杂的作用机制(Bagnall等，前文；Lin，前文)。在拟南芥属的花期PHYC也促进光周期开花和天然表型变异(Franklin等2003.Plant Cell 15:1981-1989；Monte等2003.Plant Cell15:1962-1980；Balasubramanian等2006.Nat.Genet.38:711-715)。另外，光敏色素基因调节植物营养生长参数诸如高度、叶和莲座丛产量(Bagnall等，前文)。
在栽培的棉花中，光敏色素基因家族具有额外的重要性，因为有证据显示远红/红(FR/R)光子比影响正在发育的纤维的长度和直径。例如，暴露于高远红/红光子比的棉花纤维比暴露于提高的光合作用光的棉花纤维更长(Kasperbauer,M.J.1994.Physiol.Plantarum 91:317-321；Kasperbauer.M.J.2000.Crop Sci.40:1673-1678)。纤维产量和纤维品质，即，纤维长度和纤维强度的遗传改良是世界上棉花育种计划的主要目标(Perkins等1984.In:Cotton Agron.Monogr.Kohel and Lewis,Eds.,ASA,CSSA,and SSSA,Madison,WI,437-509页)。因为纺织工业的技术改变，纤维品质已经成为最近几年的主要问题(Perkins等，前文；El-Mogahzy and Chewning.2001.In:Cotton Fiberto Yarn Manufacturing.Cotton Incorporated,Cary,NC)。皮马(Gossypium barbadens)棉花纤维比广泛生长的、早成熟的和高产量的陆地棉(Gossypium hirsutum)细、遗传更强并且更均一(El-Mogahzy和Chewning，前文)。找到容易的方法来改善陆地栽培品种的纤维性质同时保持产量和早成熟是世界上常规棉花育种中要解决的基本问题。
因此，需要开发改良的栽培棉花植株，其产生高产量的显示改良的纤维长度和纤维强度的优质棉花纤维。
发明内容
我们已经发现棉花PHYA1基因的RNA干扰导致靶PHYA1基因的抑制以及也导致其他光敏色素基因的表达数倍增加；棉花光敏色素基因家族表达谱的这种改变导致植物结构改变，包括叶柄、果枝、棉铃花梗和根系伸长、营养生长旺盛、早开花和棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉积、纤维品质(长度、强度、马克隆值等)和纤维产量表型提高；并且这些改变在后代中稳定表达并且通过基因杂交和选择可从转化的Coker 312基因型转移至陆地栽培品种。
根据该发现，本发明的目的是提供针对棉花中的PHYA1基因的有效的内源基因沉默的策略，以便改变棉属植物的光形态发生。
本发明的进一步目的是提供新的分离的或重组的多核苷酸分子，其包括编码陆地棉的PHYA1多肽的一部分铰链区的DNA序列。
本发明的另一目的是提供分离的或重组的多核苷酸分子，其包括编码PHYA1多肽的一部分铰链区包括213个碱基对连续核苷酸分子的DNA序列。
本发明的另外目的是提供编码PHYA1多核苷酸基因序列的发夹核酸构建体，其包括棉属PHYA1基因铰链区的213个连续的有义核苷酸部分(SEQ ID NO:1)和其反义-互补物，使得当第一和第二多核苷酸序列转录成核糖核酸时杂交以形成发夹样双链核苷酸分子。
本发明的另外目的是提供用于降低棉花植株中光敏色素A1水平的方法，该方法包括在植株中表达编码PHYA1基因序列的异源核酸构建体，该异源核酸构建体包括棉属PHYA1基因的213bp连续的有义核苷酸部分和其反义-互补物，其中该表达诱导植株中的RNA干扰(RNAi)产生这样的植物，相对于正常阳光下的野生型棉花植株，其叶柄、果枝、棉铃花梗和根系伸长、营养生长旺盛、早开花和棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉积、纤维品质(长度、强度、马克隆值、均一性等)和纤维产量表型提高。
本发明的进一步目的是提供用于修饰或抑制陆地棉种细胞中PHYA1基因表达的方法，该方法包括：用包括可操作地连接至启动子的编码dsRNA的核酸序列和转录终止序列的载体转化植株；选择已经将核酸序列整合进入它们的基因组中的转化植株；筛选表达该核酸序列编码的dsRNA的转化植株；和选择表达该dsRNA和/或siRNA的植株。
本发明的另一目的是提供包括双元载体、PHYA1 RNAi构建体的重组核苷酸序列，其中PHYA1 RNAi构建体包括来自PHYA1基因铰链区的213bp核苷酸序列，其中花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子存在于靠近PHYA1发夹的上游核苷酸序列中，每个构建体由农杆菌介导的接种递送，产生体外重组和PHYA1基因的抑制和其他光敏色素的表达水平的改变。
本发明的另一目的是提供包括PHYA1 RNAi双元载体构建体的宿主细胞。
本发明的另外目的是提供用于生产其中棉花PHYA1基因被抑制的转基因棉花植株的方法，该方法包括：(a)用本发明的PHYA1 RNAi构建体稳定转化宿主棉花植株细胞，(b)从稳定转化的宿主棉花植株细胞体细胞再生转基因植株；和(c)使所述转基因植株在借以所述植株显示改变的光敏形态发生特征的条件下生长，所述改变的光敏形态发生特征包括与野生型非转化的棉花植株相比改变的植株株型，包括更长的叶柄、果枝和棉铃花梗，增强伸长的根系，旺盛的营养生长，早开花和棉铃早成熟，茎叶中增强衰老的花青素色素沉淀。
本发明的另外目的是提供通过本发明的方法产生的包括本发明PHYA1RNAi构建体的转基因棉花植株或其子代，所述植物显示光敏形态发生特征的改变表达，包括与野生型非转化的棉花植株相比，植株株型变化，果枝和棉铃花梗更长、根系延伸增强、营养生长旺盛、早开花和棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉淀。
本发明的另外目的是提供包括本发明的PHYA1 RNAi构建体的转基因棉花细胞。
本发明的另外目的是提供包括本发明的PHYA1 RNAi构建体的转基因棉花植株，其中转基因植株相对于野生型棉花植株显示棉花纤维的长度和强度增加以及马克隆值、伸长率和纤维均匀性改善。
本发明的另外目的是提供上述包括本发明的PHYA1 RNAi构建体的转基因植物的转基因种子。
本发明的另一目的是提供已经由本发明的PHYA1 RNAi构建体转化的植株、植物细胞和植物部分以及植物种子。
本发明的另一目的是提供一种诱导棉花植株相对于野生型棉花植株优良的纤维品质的方法；所述优良的纤维品质包括长度和强度增加，马克隆值、伸长率和纤维均匀性改善，籽棉产量增加；该方法包括抑制PHYA1基因。
本发明的另一目的是提供一种启动棉花植株相对于野生型棉花植株早开花和棉铃早成熟的方法，该方法包括抑制PHYA1基因。
本发明的另外目的是提供增强棉花植株相对于野生型棉花植株根发育的方法，该方法包括抑制PHYA1基因。
本发明的另外目的是提供增强棉花植株相对于野生型棉花植株旺盛的营养生长、茎叶中增强衰老的花青素色素沉淀和叶柄、果枝和棉铃花梗伸长的方法，该方法包括抑制PHYA1基因。
本发明的另外目的是提供通过改变本发明的PHYA1 RNAi构建体的拷贝数以增强抑制而改变植物特征的方法。
本发明的另外目的是提供通过改变本发明的PHYA1 RNAi构建体的拷贝数以增强PHYB/C/E基因的表达而改变植物特征的方法。
本发明的另外目的是提供包括本发明的PHYA1 RNAi构建体的转基因棉花细胞，其中由所述细胞再生的转基因植物显示PHYA1基因的抑制和PHYB/C/E基因的过表达，由此产生的植物相对于野生型棉花植株显示植株株型改变，包括叶柄和果枝更长、根系延伸增加、营养生长旺盛、早开花和棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉淀、优良的纤维品质以及籽棉产量增加，所述优良的纤维品质包括长度和强度增加和马克隆值、伸长率和纤维均匀性改善。
由下面的说明书本发明的其他目的和优势将更显而易见。
附图说明
专利或专利申请文件包含至少一副彩色图。当请求并且支付必要费用后，该专利或专利申请公布的附图以及彩色附图将由美国专利和商标局提供。
图1A-1C描绘PHYA1 RNAi在棉花中的作用：图1A是PHYA基因、RNAi片段位置和pHellsgate-8::PHYA1 RNAi质粒的示意性表示；图1B描绘芽和根发育；图1C描绘组织培养中体细胞再生的T0-代PHYA1 RNAi和对照棉花植株的纤维长度特征。
图2A-2D显示与对照相比PHYA1 RNAi植株物中光敏色素相关的发育变化：图2A显示与同一天种植的对照植株相比经体细胞胚发生再生的T0RNAi植株中营养生长增强以及早开花。图2C显示与相同环境下同一天种植的对照植株(图2B)相比，T1代RNAi植株的早开花。图2D显示与Coker-312对照相比，叶柄长度(T0)的不同，图2E显示根发育(T3)的不同。
图3描绘来自T1代RNAi棉花植株的纤维的纤维长度。绿条是3株个体Coker-312植物(标记为K-312)的纤维长度指数；琥珀色条是来自单株T1代RNAi植株的纤维长度指数；黄色条是皮马棉的纤维长度指数。对照和RNAi Coker-312植物在相同的温室环境下生长。
图4A-4D显示在源自RNAi Coker 312和AN-Boyovut-2(Uzbek variety)栽培品种之间杂交的RNAi系中光敏色素相关的RNAi作用：图4A显示田间中生长的植物衰老相关的花青素色素沉积；图4B和4D显示叶盘和棉花棉铃中的花青素积聚以及叶柄和棉铃花梗的伸长；图4C显示使用本发明开发的RNAi系的从生型(bush type)和产量。
图5显示与在相同条件下生长的对照相比，Coker-312的第二代RNAi植株中主要纤维品质性状变化的一般性趋势。
图6A-6H描绘与相同环境和条件下生长的对照棉花植株相比，选择的T2-代PHYA1RNAi植株家族(T2-1_7和T2-31_10)的平均表型特征的柱状图：图6A描绘上半部平均(UHM)；图6B，马克隆值(MIC)；图6C，纤维强度(STR)；图6D，纤维均匀性；图6E，纤维伸长(ELO)；图6F，平均下胚轴长度；图6G，2009年7月15日花的平均数；图6H，2009年9月15日开放棉铃的平均数。在威氏配对符号秩次检验中RNAi基因型和对照之间测量的性状的统计显著性在p≤0.05下用字母“a”、“b”和“c”定义。
图7A描绘与相同环境和条件下生长的对照棉花植株相比，选择的T3-代PHYA1RNAi植株家族(T3-1_7和T3-31_10)的纤维长度特征，图7C和7D描绘与相同环境和条件下生长的对照棉花植株相比，选择的T3-代PHYA1 RNAi植株家族(T3-1_7和T3-31_10)的根发育特征。这些选择的植物的PCR-确认显示在图7B中：M-100bp Ladder，1-T3-1_7；2-T3-31_10；3–Coker 312；4-pHellsgate-8::PHYA1质粒；5-无DNA模板对照。这些植株用于利用qPCR的拷贝数鉴定和相对表达分析。
图8A和8B显示2009年实验管理的田间测试中田间生长的T3RNAi和对照植株之间营养生长的差异(图8A)。从RNAi Coker-312到陆地栽培品种(AN-Boyovut-2)的光敏色素相关的RNAi作用的可转移性显示在图8A和8B中。图8C比较在相同环境下生长的原始栽培品种(左)和RNAi F2杂种(右)之间的纤维样品的改善。
图9显示与在相同条件下生长的对照相比，第二代AN-Boyovut-2×RNAiCoker-312杂种中主要纤维品质性状变化的一般性趋势。
发明详述
本发明涉及光敏色素基因在棉花中调节特定表型性状的作用。基于我们最初在绘制纤维长度隔离双亲群体中光敏色素基因图谱上的努力表明PHYA1基因多态性与纤维长度数量性状基因座(QTL)的显著相关(Abdurakhmonov 2001，前文)的发现，我们已经假设光敏色素基因在调节棉花纤维伸长中具有作用(Abdurakhmonov,I.Y.2001.Thesis.Texas A&MUniversity,美国)。使用被子植物，尤其，系统发生学上密切相关的真双子叶植物(属于菊类植物(Asteroids)类和蔷薇类植物(rosids)类)诸如拟南芥、西红柿、马铃薯、柑桔、萝卜、胡萝卜和其他蔬菜、水果、油料和草料作物的光敏色素基因铰链区的保守序列，我们成功克隆并测序了植物光敏色素基因家族的棉花直系同源基因(Abdurakhmonov 2001，前文；Abdurakhmonov 2010，前文)。我们最近已经报道了对棉花中光敏色素基因家族的分子-进化特征的研究(Abdurakhmonov等2010.BMC Plant Biol.10:119)。其他人已经显示RNA-诱导的基因沉默技术是用于研究包括植物的数种有机体中基因功能的成功手段(Waterhouse和Helliwell.2003.Nature Reviews Genetics 4:29-38；Wesley等2001.Plant Journal27:581-590；Helliwell等2002.Funct.Plant Biol.29:1217-1225)。
我们已经研究了棉花植株中通过光敏色素基因RNA干扰的基因-沉默的作用。尤其，根据之前研究的纤维性状之间的遗传相关性，我们已经研究了RNAi对产生更长棉花纤维和对改善其他重要的纤维品质性状的作用。光敏色素基因表达的变化影响开花时间。由于之前的研究已经表明植物光敏色素基因参与硝酸还原酶(Jonassen等2008.Planta 227(3):559-564；Lillo,C.2008.Biochem J.415(1):11-19)和耐盐性同源物2和同源物3(Datta等2007)Plant Cell 19(10):3242-3255；Datta等2008.Plant Cell 20(9):2324-2338)的调节，还评估了光敏色素基因的RNA干扰对根和芽发育的作用。另外，已经有数种报道针对光敏色素和其信号转导因子参与拟南芥的耐低温/耐冷冻和耐旱(Kim等2002.PlantJ.29(6):693-704；Franklin和Whitelam.2007.Nat.Genet.39(11)1410-1413；Beck等2007.J.BioSci.32(3):501-510)。
我们之前已经表征了棉花基因组的所有棉花光敏色素并且研究了它们的分子进化(Abdurakhmonov 2001，前文；Abdurakhmonov等2010，前文)。在二倍体棉花中鉴定了两个同源基因PHYA1和PHYA2基因，它们起源于A和D基因组祖先趋异之前的约1400万年之前的Malvaceae-特定基因复制(MYA)。在二倍体棉花中检测到PHYB、PHYC和PHYE的单基因拷贝。具有异源四倍体基因组(AD)的棉花很大程度上保留全部基因互补体，包括至少四个PHYA基因和两个编码PHYB、PHYC和PHYE的基因。在任何检查的棉花基因组中都没有发现PHYD基因(Abdurakhmonov等2010，前文)。
这里，我们报道了来自我们的研究的结果：使用纤维品质QTL相关的PHYA1基因序列通过RNA干扰(RNAi)研究光敏色素基因的生物学作用。这里我们提供了关于光形态发生-相关因子在复杂的棉花纤维发育过程中的重要性和光敏色素-特异RNAi在改善棉花的重要的农艺学性状中的有用性的第一个分子证据。此外，我们表明这些作用可通过有性杂交转移至陆地栽培品种。
在该工作中，我们能够诱导棉花的光敏色素相关的RNAi表型，其产生据认为对棉花育种重要但是通过常规的育种难以实现的数种改良的复杂农艺学性状。棉花光敏色素A、B、C和E的铰链区的特征(Abdurakhmonov 2001，前文；Abdurakhmonov等2010，前文)和PHYA1基因与纤维品质的显著相关促使我们选择和使用PHYA1-特定序列用于开发RNAi构建体。选择的213bp长的PHYA1片段与棉花PHYA2基因具有87％的核苷酸相似性，与拟南芥PHYA具有75％的核苷酸相似性，与棉花PHYB基因具有59％的核苷酸相似性，与棉花PHYE基因具有53％的核苷酸相似性和与棉花PHYC基因具有～50％核苷酸相似性。有效的基因沉默通常需要80-100％的核苷酸同源性，以诱导强的和特异的RNAi(Holzberg等2002.Plant J.30:315-327)；因此我们的RNAi构建体设计为优先靶向棉花的PHYA基因。
我们对棉花转化的结果显示了早期胚幼苗中感兴趣的光敏色素相关的表型。例如，我们观察到强健的芽和侧根发育以及早开花表型。观察到在HY5基因突变的拟南芥中观察到这种强健的侧根发育；HY5是光形态发生的正向调节物(Oyama等1997.Genes Dev.11:2983-2995)。已知棉花纤维由种子表皮发育，因此解剖学上与表皮根尖相似，T0PHYA1 RNAi植株的根伸长过程的观察对于评估相同植物中更长纤维的存在是重要的。的确，我们的结果表明在实验管理田间条件下、在正常太阳光下生长的T1、T2和T3代植物中稳定表达的不同RNAi棉花家族中纤维长度以及其他纤维品质特征的改善是显著的但是是不同的。我们的结果与对增加的远红光/红光比对纤维长度和直径作用的早期观察(Kasperbauer 2000，前文)以及我们对棉花中PHYA1与纤维长度QTL相关性的初步结果(Abdurakhmonov 2001，前文)一致。
由于光敏色素介导的植物激素信号，诸如被认为是与纤维发育相关的关键因子的植物生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、油菜素内酯(BR)、乙烯和细胞分裂素，(Lee等2007.Ann.Bot.100:1391-1401)，光敏色素相关的纤维伸长可能发生(Neff等2000.GenesDev.3:257-271；Colon-Carmona等2000.Plant Physiol.124(4):1728-1738；Stamm和Kumar.2010.J.Exp.Bot.61(11):2889-2903)。例如，对棉花胚珠发育中植物生长素生物合成的时空操纵的最近所作的努力证明棉花的纤维产量和品质参数的提高(Zhang等2011.Nature Biotechnol.29(5):453-458)。通过密切的植物生长素-光敏色素相互作用，尤其PHYA(Neff等2000，前文；Colon-Carmona等，前文)，关于植物生长素和光信号之间的分子交互作用存在充分支持的证据。这可解释在我们的RNAi植株中纤维品质改善并且表明了PHYA基因在该过程中的作用。此外，通过来自正在发育的胚珠中的小RNA种类的特征(Abdurakhmonov等2008.BMC Plant Biol.8:93；Devor等2009.Int.J.PlantGenomics.PubMedID：19551152)，我们观察到负责远红光/红光感知和光信号转导、向光性、向重力性和生理节奏的光形态发生-相关的因子(PHYC、SPA1、FAR1、COP1/9、CIP7/8和RTP2)在纤维起始阶段，更显著地在纤维发育的纤维伸长阶段，被胚珠-衍生的siRNA靶向。
但是，应提到我们在来自不同转化事件的T2RNAi植株中观察到纤维性状改善的不同趋势，因此表明我们使用的PHYA1基因序列片段诱导不同类型和水平的RNAi。该结果可能与RNAi相关，原因是基因组中不同水平的光敏色素基因的抑制和RNAi构建体的不同拷贝数的组合。我们的结果表明具有特定RNAi表型的两个明显不同的单粒传(single seeddecent)RNAi棉花家族在插入到它们基因组中的RNAi质粒的拷贝数以及基因-敲除水平和基因组合的抑制方面不同。我们观察到三个拷贝数样品与更深度的PHYA1基因抑制相关。如我们所提议，我们基于PHYA1序列的RNAi构建体主要仅仅靶向棉花PHYA1序列并且不影响其他棉花光敏色素基因，更不用提在选择的两个RNAi家族中具有87％核苷酸同源性的PHYA2基因。但是，在T3-31_10，我们观察到与PHYA1 RNAi片段具有～60％核苷酸同源性的10％棉花PHYB基因的抑制。这些结果支持我们的假设，不同组合的光敏色素基因被在我们的转化中使用的PHYA1基因序列抑制。除了PHYA1敲除，T3-31_10中PHYB的轻微抑制产生与T3-1_7相比的早开花表型。
同时，PHYA1-抑制RNAi植株中其他光敏色素基因，即，PHYA2、PHYB、PHYC和PHYE的表达水平增加了～2至20-倍，这是出人意料的结果。有趣地是，T3-1_7中PHYA1的更深度抑制导致比T3-31_10事件中其他光敏色素的表达更多。该发现大体上与光敏色素基因可能的重叠功能的报道一致(Reed等1994.Plant Physiol.1104:1139-1149)。换句话说，在调节一些光敏色素-相关的表型诸如开花时，光敏色素之间可彼此替换。PHYA1 RNAi家族中PHYA2和PHY C水平的增加可以是这种替代的结果，因为在水稻植物中PHYC如PHYA一样响应恒定的远红光(Takano等2005.Plant Cell 17:3311-3325；Kneissl等2008.Mol.Plant.1(1):84-102)，尽管PHYC的感光特异性与弱红光传感器(Schepens等2004.Curr.Opin.PlantBiol.7(5):564-569)PHYB/D/E(Monte等，前文)类似。另外，在我们的PHYA1 RNAi植株中观察到的PHYE/B基因表达增加了～5至20-倍，这表明棉花PHYAs和PHYE/Bs之间可能的功能重叠可能对棉花光敏色素种类是特异性的。
我们推测棉花中PHYA基因的抑制将产生晚开花表型，因为PHYA通常促进植物开花(Neff和Chory 1998，前文)。可选地，在我们选择的RNAi棉花家族中增加的PHYA2表达维持早开花。而且，增加的PHYC表达可有助于在PHYA1抑制背景下的早开花表型，因为在长日照条件下在不存在PHYA的情况下PHYC能够促进开花(Franklin等2003，前文；Monte等，前文；Balasubramanian等，前文)。RNAi植株中该改变的光敏色素基因表达水平可能已经诱导‘避荫’过程，导致植物生长加速。作为对遮蓬的响应，当遮蔽成为问题时植物试图完成它们的生命周期并且加速开花(Devlin等1999，前文；Salter等2003.Nature 426(6967):680-683)。我们观察到作为PHYA1和PHYA1/BRNAi棉花植株中的标记表型的叶柄和果枝的伸长，表明诱导了作为长得超过邻近的植物的尝试的避荫过程(Salter等，前文)。在PHYA1 RNAi棉花植株中观察到的棉花棉铃的早成熟也可与对遮阴的响应相关，其与拟南芥中包括早开花和早产生种子的避荫响应几乎一样(Devlin等1999，前文；Salter等，前文)。
值得提到的是，已知棉花的纤维长度和这些特性之间负相关，在RNAi家族中观察到衣分率、种子和衣分指数特性降低(Miller和Rawlings。1967。Crop Sci.7:637-640；Meredith和Bridge.1973.Crop Sci.13:698-701)，这导致总体棉花产量受影响。但是，在RNAi植株中观察到的增加的产量潜力可由光敏色素相关的强健的芽和根发育来解释，光敏色素相关的强健的芽和根发育产生了更多的果枝、花和棉铃，增加了来自土壤养分的同化作用的效率，因此潜在地有助于观察到的产量增加。之前的研究显示，与对照相比，马铃薯中拟南芥PHYB基因的过表达导致更高的光合性能，并且具有花青素色素沉积增加的转基因马铃薯植株产生增加的生物质和增加的块茎产量(Thiele等1999.Plant Physiol.120(1):73-82)，另一种可能性是，由于光敏色素基因的表达改变，尤其PHYB/E和PHYC表达的增加，改变的光合光感可能已经影响光合速度，因此导致RNAi植株产量潜力增加。作为红光光感受器，如PHYB，在PHYA1/BRNAi背景下棉花PHYE/C的数倍过表达可能也产生上面提到的PHYB过表达马铃薯植株表型，其具有增加的产量潜力和在PHYA1 RNAi植株衰老中的花青素色素沉积。
我们也评估了由于观察到的强健的根发育，开发的PHYA1/B RNAi植株在耐干旱、耐盐、耐低温/冷冻特征方面的改善，因为之前的研究已经报道了光敏色素基因与这些作用的相关性(Jonassen等，前文；Lillo，前文；Datta等2007，前文；Datta等2008，前文；Kim等，前文；Franklin和Whitelam，前文；Beck等，前文)。为了该目标，在评估在自然田间条件下以及胁迫环境下这些转基因植物的更高代方面，正在进行研究和付出大量的努力。
我们使用Coker 312，具有差产量潜力的品系，因为其充分证明的体外高体细胞胚发生和高再生效率。转基因Coker 312品系与改良的栽培品种的杂交表明来自RNAi Coker312的相同表型和遗传效果的转移。如本文我们通过PHYA1 RNAi所实现的数种复杂性状的同时改善且不影响其他参数在常规的育种中受到限制。例如，由于在随后的杂交后代中广泛的遗传隔离、连锁累赘和遗传畸变而通常产生晚熟和差的农艺学品质的杂种，使用种间基因杂交使来自皮马棉花的良好纤维品质基因基因渗入至陆地棉花栽培品种具有挑战性(Endrizzi等1985.Adv.Genetics 23:271-375)。我们的RNAi研究结果解决了这些主要问题并且使得具有改善的纤维品质的早熟栽培品种，例如，具有提高的纤维品质的早成熟的陆地变种快速发育。因此，我们已经开发了优良的乌兹别克棉花栽培品种，其适应本地棉花生产同时保持原始栽培品种特定的所有其他特征。更长且强度更大的棉花棉绒纤维的新市场以及早成熟和提高的产量潜力将增加该技术的预计经济价值。经光敏色素RNAi对非生物胁迫抗性的改善进一步增加其商业潜力。
我们的结果支持并强调植物光形态发生在棉花纤维发育中的重要性以及其对纤维品质的作用。我们得出这样的结论：棉花PHYA1基因的RNAi导致靶向基因的抑制并且也改变残留其余光敏色素的表达水平。所以，棉花中观察到的RNAi作用是由于PHYA1的抑制和其他光敏色素表达的数倍增加。棉花光敏色素基因家族表达谱的这种改变导致植株株型的改变，包括叶柄和果枝伸长、早开花、棉铃早成熟、纤维品质和纤维产量表型增强。这些改变在后代中稳定表达并且通过基因杂交和选择可从转化的Coker 312基因型转移至陆地栽培品种。所以，基于棉属-来源的光敏色素基因的RNAi，优良品质的长-纤维质RNAi棉花植株的发育将使得育种人员快速改善成熟、主要纤维品质性状和产量。转移的PHYA1 RNAi构建体可在陆地栽培品种中产生对非生物胁迫的抗性。该RNAi策略不仅仅提供对常规棉花育种的根本问题的解决方案，而且也产生来自世界上的棉花生产的显著的经济收入并且将开启用于陆地棉花育种的新篇章。
在本发明优选的实施方式中，包含本发明核苷酸序列的宿主细胞是细菌细胞，尤其，是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。
对于直接的基因转移和农杆菌介导的转移，通常(但不是必须)采取具有可提供对抗生素(卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤)或除草剂(磺酰脲、咪唑啉酮或basta)抗性的标记的转化。但是，选择标记的选择对本发明不是至关重要的。
如本文所使用，术语“核酸分子”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸片段”、“分离的核酸片段”在本文交换使用。这些术语包括核苷酸序列和类似序列。多核苷酸可以是RNA或DNA的多聚体，其是单链或双链并且其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。以DNA多聚体形式的多核苷酸可由一个或多个cDNA、基因组DNA、合成DNA的区段，或其混合物组成。
术语“分离的”多核苷酸指基本上没有通常在发现其的天然存在的环境下相伴或与其相互作用的其他核酸序列，诸如其他染色体和染色体外的DNA和RNA多核苷酸。但是，分离的多核苷酸可包含可初始作为染色体外的DNA存在但是在分离的多核苷酸中作为核苷酸插入存在的多核苷酸序列。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。术语也包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
如本文所使用，“重组体”指通过使用限制酶、连接酶和类似的基因工程技术操作遗传材料获得的核酸分子，如通过，例如下述所描述：Sambrook等1989.MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring公顷rbor Laboratory Press，ColdSpring公顷rbor，NY or DNA Cloning:A Practical Approach，I和II卷(Ed.D.N.Glover)，IRL Press，Oxford，1985。“重组体”如本文所使用，不指天然存在的遗传重组体。
如本文所使用，术语“嵌合”指源自不同来与、菌株或物种在自然条件下不重组的的两条或更多条DNA分子，或来自相同物种以在天然基因组中不存在的方式连接的两条或更多条DNA分子。“构建体”或“嵌合基因构建体”指编码蛋白质、可操作地连接至启动子和/或其他调控序列的核酸序列。
如本文所使用，术语“表达(express)”或“表达(expression)”定义为意思是仅仅转录。“改变的水平”或“改变的表达”指转基因生物体中基因产物(一种或多种)的生产的量或比例与正常的或非转化生物体的不同。
如本文所使用，术语“编码(encoding)”、“编码(coding)”或“编码的(encoded)”当在具体核酸背景下使用时，意思是核酸包括必要的信息以引导核苷酸序列翻译成具体的蛋白质。蛋白质编码的信息由使用的密码子指定。编码蛋白质的核酸可包括非翻译的序列(例如，内含子)核酸的翻译区域中或可缺失这种插入的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上两条或更多条核酸片段的相关性，使得一个片段的功能受另一片段的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，该启动子与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以可操作地以有义或反义方向上连接至调控序列。
“调控序列”指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA处理或稳定性，或翻译。这里，调控序列可包括启动子：T7启动子、CaMV 35S启动子和亚基因组启动子(两个，在MCS的每一侧)、翻译前导序列、内含子，和多腺苷酸化鉴定序列。
“启动子”指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'。启动子序列由相邻的和更远的上游元件组成，后者元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可刺激启动子活性的核苷酸序列并且可以是启动子的先天元件或插入的异源元件，以增强启动子的水平或组织-特异性。启动子整体上可源自天然基因，或由源自自然中出现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成核苷酸区段。本领域技术人员理解，不同启动子可引导不同组织或细胞类型中，或在发育不同阶段，或响应不同环境条件的基因的表达。使得核酸片段在大部分细胞类型中的大部分时间表达的启动子通常称为“组成型启动子”。经常发现在植物细胞中使用的各种类型的新启动子；许多例子可见Okamuro和Goldberg.编辑的1989.Biochemistry of Plants 15:1-82。进一步认识到，因为在大部分情况下还未完全限定调控序列的精确边界，不同长度的核酸片段可具有相同的启动子活性。
“RNA转录体”指源自DNA序列的RNA聚合酶催化的转录的产物。当RNA转录体是DNA序列的完美互补副本时，称为初级转录体或其可以是源自转录后处理的RNA序列初级转录体并且称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指在内含子外部并且可由细胞翻译成多肽的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并且源自其的DNA。cDNA可以是单链的或使用，例如，DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。“有义”RNA指包括mRNA并且所以可被细胞翻译成多肽的RNA转录体。“反义”，当在具体的核苷酸序列背景下使用时，指参考转录产物的互补链。“反义RNA”指与所有的或部分目标初级转录体或mRNA互补并且妨碍目标基因表达的RNA转录体。反义RNA的互补可与具体核苷酸序列的任何部分，即，在5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”指有义RNA、反义RNA、核酶RNA，或可能未被翻译但是仍对细胞过程有作用的其他RNA。
“基因抑制”意思是抑制蛋白质从基因表达的任何熟知的方法，包括反义抑制或RNAi抑制。在抑制基因以提供具有期望的表型的植物时，反义抑制和RNAi基因抑制方法是优选的。对于植物细胞中基因表达的反义调节的描述，见美国专利号5,107,065。对于植物中通过dsRNA转录的RNAi基因抑制的描述，见美国专利号6,506,559、美国专利申请公布号2002/0168707A1和美国专利申请系列号09/423,143(见WO 98/53083)、09/127,735(见WO99/53050)09/084,942(见WO 99/61631)，其所有通过引用并入本文。通过RNAi的基因抑制可使用具有启动子的重组体DNA构建体实现，试试启动子可操作地连接至DNA元件，包括基因的基因组DNA区段的有义和反义元件，例如，至少大约23个核苷，更优选地大约50至200个核苷的区段，其中有义和反义DNA组件可通过内含子或人工DNA区段直接连接或结合，所述内含子或人工DNA区段当转录RNA杂交以形成发夹结构时可形成环。
“转化”指核酸片段转移进入宿主生物体的基因组中导致基因地稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”生物体。植物转化方法的例子包括农杆菌介导的转化(De Blaere等1987.Meth.Enzymol.143:277)和粒子-加速或“基因枪”转化技术(Klein等1987.Nature(London)327:70-73；美国专利号4,945,050，通过引用并入本文)。下面公开了其他转化方法。因此，本发明分离的多核苷酸可合并到重组体构建体，通常DNA构建体，其能够引入宿主细胞中并且在其中复制。这种构建体可以是载体，其包括能够在给定的宿主细胞中转录和翻译多肽-编码序列的复制系统和序列。适于植物细胞中稳定转染或用于建立转基因植物的许多载体已经在下述中描述，例如，Pouwels等1985.Supp.1987.克隆载体(Cloning Vectors):实验室手册(ALaboratory Manual)；Weissbach和Weissbach.1989.植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)，Academic Press，New York；和Flevin等1990.植物分子生物学手册(Plant MolecularBiology Manual)，Kluwer Academic Publishers，Boston。典型地，植物表达载体包括，例如，在5'和3'调控序列的转录控制下的一个或多个克隆的植物基因和显性选择标记。这种植物表达载体也可包含启动子调控区域(例如，控制可诱导的或组成型的，环境调控的或发育调控的，或细胞特异性表达的或组织特异性表达的调控区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
“蛋白质”或“多肽”是以由编码多肽的多核苷酸中的编码序列确定的特定顺序排列的氨基酸的链。每个蛋白质或多肽具有独特的功能。
本发明包括功能多肽和其功能片段以及具有相同生物功能或活性的突变体和变异体。如本文所使用，术语“功能片段”、“突变体”和“变异体”指具有通过确定的功能试验鉴定的并且与细胞中特定的生物学的、形态学的或表型的改变相关联的生物功能或活性的多肽。功能片段，例如，可从与能够结合抗体分子的抗原决定部位一样小的多肽片段至能够参与细胞中典型诱导或表型改变生物编程的大的多肽大小变化。
异源编码序列指编码与上面提供的多肽不相关或除上面提供的多肽之外的肽或蛋白质的编码序列，在嵌合基因构建体中提供的位置上未固有地发现该编码序列。
编码光敏色素蛋白质PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE的光敏色素基因PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE可使用根据本发明的各种技术克隆。克隆这种基因的最简单程序需要从的病毒基因组RNA或鉴定为生产所述蛋白质的生物体的基因组DNA克隆互补的DNA以及在适当的质粒或载体上将克隆的DNA转移至不产生蛋白质的宿主生物体，随后鉴定已经被赋予生产该蛋白质能力的转化的宿主。被赋予转化的蛋白质功能的DNA可切割成更小的片段并且维持蛋白质功能赋予能力的最小片段可被进一步表征。适于通过同源性克隆的技术包括通过DNA杂交的标准文库筛选或使用源自保守序列的引物的聚合酶链式反应(PCR)扩增。如本文所限定，当至少80％(优选地至少85％和最优选地90％)的核苷酸在确定的序列长度上使用诸如CLUSTAL或PILEUP的算法匹配时，两个DNA序列基本上是同源的。基本上同源的序列可在如本领域已知的Southern杂交实验中在严格条件下鉴定。参见，例如，Sambrook等，前文。Sambrook等描述了高度严格条件为杂交温度低于最佳匹配的靶标和探针Tm的5-10℃；因此，“基本上同源的”序列在这种条件下杂交。
如本文所使用，“基本上类似”指其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的替换，但是不影响由该核苷酸序列编码的多肽的功能性质的核酸片段。“基本上类似”也指本发明的核酸片段的修饰，诸如基本上不影响所得转录体功能性质的核苷酸的缺失或插入。所以，应理解本发明包括不只所述具体的示例性核苷酸或氨基酸序列并且包括其功能等价物。在给定位点产生化学等价氨基酸，但是不影响编码多肽的功能性质的核酸片段的改变是本领域熟知的。因此，疏水的氨基酸，氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一疏水性较小的残基，诸如甘氨酸，或疏水性更大的残基，诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子替换。类似地，导致一种带负电的残基替换另一带负电的残基，诸如天冬氨酸替换谷氨酸，或一种带正电的残基替换另一带正电的残基，诸如赖氨酸替换精氨酸的改变也可以被预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N末端和C末端部分改变的核苷酸变化也未被预期改变多肽的活性。每种所推荐的修饰是本领域常规技术中熟知的，如测定编码的产物的生物活性的保留。影响病毒或宿主细胞(真核，诸如植物、酵母、真菌或藻类；原核，诸如细菌)中多肽的表达水平的分离的多核苷酸的选择方法可包括下述步骤：构建本发明分离的多核苷酸或本发明分离的嵌合基因；将分离的多核苷酸或分离的嵌合基因引入宿主细胞；测量在包含分离的多核苷酸的宿主细胞中多肽的水平；以及对包含分离的多核苷酸的宿主细胞中的多肽的水平与不包含分离的多核苷酸的宿主细胞中多肽的水平进行比较。
而且，基本上类似核酸片段也可由它们杂交的能力表征。这种同源性的评估由在本领域技术人员理解的严格条件下的DNA-DNA或DNA-RNA杂交提供(1985.Nucleic AcidHybridization，Hames和Higgins，Eds.，IRL Press，Oxford，U.K.)。严格条件可被调整以筛选中度类似的片段诸如来自远亲生物体的同源序列至高度类似的片段诸如复制来自近亲生物体的功能酶的基因。
因此，编码PHYA1多肽并且在严格条件下与本文公开的序列或其片段杂交的分离的序列在本发明的范围内。
本发明的基本上类似的核酸片段也可由它们编码的氨基酸序列与本文公开的氨基酸序列相比的同源性百分比来表征，如通过本领域技术人员通常使用的算法测定。
用于比较的序列比对的方法是本领域熟知的。因此，任何两条序列之间的同源性百分比的测定可使用数学算法来实现。此类数学算法的非限制性例子是Myers和Miller的算法(1988.CABIOS 4:11-17)，Smith等的局部同源性算法(1981.Adv.Appl.Math.2:482)；Needleman和Wunsch的同源性比对算法(1970.J.Mol.Biol.48:443-453)；Pearson和Lipman的相似性查找方法(1988.Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448；Karlin和Altschul的算法(1990.Proc.Natl.Acad.Sci.美国87:2264)，Karlin和Altschul修改的算法(1993.Proc.Natl.Acad.Sci.美国90:5873-5877)。
这些数学算法的计算机执行可用于序列的比较以测定序列同源性。此类执行包括，但不限于：PC/基因程序中的CLUSTAL(获得自Intelligenetics公司，山景城，加利福尼亚.)；ALIGN程序(2.0版本)和威斯康辛州遗传学软件包中(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，版本8(获得自遗传计算机组(GeneticsComputer Group，GCG)，575Science Drive，麦迪逊，威斯康辛州，美国)。使用这些程序的比对可使用默认参数进行。
除非另外指出，使用LASERGENE生物信息计算套件的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康辛州)或任何等价的程序进行序列比对和同源性百分比计算。除非另外指出，使用比对的Clustal W方法(Higgins和Sharp(1989.CABIOS 5:151-153)以默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝1.0)进行序列的多重比对，而使用Clustal W方法的双序列比对的默认参数是空位罚分＝10，空位长度罚分＝1.0，Slow-Accurate算法。
如本文所使用的，在两个核酸或多肽序列的背景下，“序列同源性”或“同源性”指当对指定比较窗口进行最大对应比对时两条序列中相同的残基。当提及蛋白质使用序列一致性的百分比时，认识到不同的残基位置通常保守氨基酸替换不同，其中氨基酸残基被替换为具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并且因此不改变分子的功能性质。
如本文所使用，“序列一致性的百分比”意思是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列测定的值，其中与用于两条序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)比较时，比较窗口中的多核苷酸序列部分可包括添加或缺失(即，空位)。计算百分比如下：测定在两条序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量；匹配的位置数除以比较窗口的总位置数；以及结果乘以100产生序列一致性的百分比。
如本文所使用，“参考序列”是用作序列比较基础的确定序列。参考序列可以是特定序列的子集或全部；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。
术语“基本上一致性”的多核苷酸序列意思是使用描述的比对程序之一使用标准参数，多核苷酸与参考序列比较包括具有至少80％序列一致性，优选地至少85％，更优选地至少90％，最优选地至少95％序列一致性的序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等，这些值可被适当地调整以确定由两条核苷酸序列编码的蛋白质的一致性。为了这些目的，氨基酸序列的基本上一致性通常意思是至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，最优选地至少95％的序列一致性。优选地，使用Needleman等的同源性比对算法进行最佳比对(1970.J.Mol.Biol.48:443)。
核苷酸序列基本上相同的另一标示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。一般而言，严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低大约5℃。但是，严格条件包括范围为大约1℃至大约20℃的温度，这取决于期望的严格程度，如本文其他地方所限定的。
氨基酸或核苷酸序列的“大部分”包括足以提供氨基酸或核苷酸序列包括的蛋白质或基因的推定鉴定的氨基酸或核苷酸序列。氨基酸和核苷酸序列可由本领域技术人员手动评估或通过使用基于计算机的序列比较和采用诸如BLAST算法的鉴定工具评估。一般而言，十个或更多个连续的氨基酸或三十个或更多个连续的核苷序列是必要的，以便推定鉴定与已知的蛋白质或基因同源的多肽或核酸序列。而且，就核苷酸序列而言，包括30个或更多个连续的核苷酸的基因特异的寡核苷酸探针可用于基因鉴定和分离的依赖序列方法。另外，12个或更多个核苷酸的短寡核苷酸可用作PCR的扩增引物，以便获得包括该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“大部分”包括将提供包括该序列的核酸片段的特异性鉴定和/或分离的核苷酸序列。本说明书教导编码包括特定植物蛋白的多肽的氨基酸和核苷酸序列。获得本文报道的序列的利益的熟练的技术人员现在可使用所有或大部分公开的序列用于本领域技术人员已知的目的。因此，这种部分表示“大部分”并且可用于建立“基本上一致性”，即，与参考序列PHYA1相比具有至少80％的序列一致性。因此，本发明包括如在所附序列表中报道的全部序列以及如上定义的那些序列的大部分。
公开的核苷酸序列的片段和变异体以及由其编码的蛋白质也在本发明的范围内。“片段”旨在指一部分核苷酸序列或一部分氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可编码保留天然蛋白质的生物活性并且因此具有类似PHYA1蛋白质活性的蛋白质片段。可选地，用作杂交探针的核苷酸序列的片段可能不编码保持生物活性的片段蛋白质。
“变异体”旨在指基本上类似的序列。对于核苷酸序列，因为遗传密码的简并性，保守的变异体包括编码本发明PHYA1多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因变异体诸如可用使用熟知的分子生物学技术，例如，用于扩增特定DNA区段的技术聚合酶链式反应(PCR)鉴定的等位基因变异体。一般而言，本发明的特定核苷酸序列的变异体与该特定核苷酸序列具有一般至少大约90％，优选地至少大约95％和更优选地至少大约98％的序列一致性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序测定的。
“变异体蛋白质”旨在指通过缺失(所谓的截断)或添加一个或多个氨基酸至天然蛋白质的氮末端和/或C-末端；在天然蛋白质的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质的一个或多个位点替换一个或多个氨基酸而由天然蛋白质获得的蛋白质。本发明包括的变异体蛋白质具有生物活性，即它们继续拥有期望的天然蛋白质的生物活性。这种变异体可源自，例如，遗传多态性或人为操作。本发明天然PHYA1蛋白质的生物活性变异体与天然蛋白质的氨基酸序列将具有至少大约90％，优选地至少大约95％，更优选地至少大约98％序列一致性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序测定的。本发明的蛋白质的生物活性变异体与该蛋白质的差异可以少至1-15个氨基酸残基或甚至1个氨基酸残基。
本发明的多肽可以不同的方式发生改变包括氨基酸替换、缺失、截断和插入。可通过将本发明的蛋白质的元件和片段组合，也可以通过将本发明的蛋白质的元件和片段与其他蛋白质组合产生具有感兴趣性质的新型蛋白质。这种操作的方法通常是本领域已知的。因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体形式。同样地，本发明的蛋白质包括天然存在的蛋白质以及其变异体和修饰形式。此类变异体将继续具有期望的PHYA1活性。明显地，在编码变异体的DNA中制造的突变不应当把该序列置于阅读框之外并且优选地不产生将产生二级mRNA结构的互补区域。
期望本文包括的蛋白质序列的缺失、插入和替换不产生蛋白质特征方面的根本改变。但是，当在这样做之前难以预测替换、缺失或插入的精确作用时，本领域技术人员将理解通过可观察到PHYA1蛋白质的作用的常规筛选试验评估该作用。
应当理解，如本文所使用术语“转基因”包括基因型已经通过存在异源核酸而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初因此改变的基因转移以及通过来自最初基因转移的有性杂交或无性繁殖而产生的那些。如本文所使用的，术语“转基因”不包括通过常规的植物育种方法或通过天然存在的事件，诸如随机异花受精、非重组体病毒感染、非重组体细菌转化、非重组体转座或自发突变而发生的基因组(染色体或染色体外)改变。
如本文所使用的，术语“棉花”包括用于商业纤维生产的棉花属的任何种，优选地陆地棉或海岛棉。
如本文所使用的，术语“植物”包括提及完整的植物、植物器官(例如，页、茎、根等)、种子、植物细胞和其子代。在本发明的范围内，转基因植物的部分理解为包括，例如，来源用本发明的DNA分子转化之前的转基因植物或它们的子代并且因此至少部分由转基因细胞组成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶、根，其也是本发明的目的。
如本文所使用，术语“植物细胞”包括，但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明的方法的植物种类一般与转化技术可处理的高等植物种类一样广发，包括单子叶植物和双子叶植物植物。
实施例
已经大体上描述了本发明，通过参考某些具体的实施例，将更好地理解本发明。具体的实施例被包括在本文中仅仅进一步阐释本发明而不旨在限制本发明的范围为权利要求所限定的。
实施例1
植物材料
在本文的研究中使用的植物材料是体细胞可再生的棉花基因型陆地棉系Coker312和用pHellsgate-8::PHYA1载体转化的其转基因衍生系。可再生的Coker-312种子(由Keerti Rathore博士提供，德州农机大学，德州大学城，德克萨斯州，美国)。为了检查观察到的RNAi作用的可转移性，我们使用数种商业上重要的乌兹别克棉花栽培品种，例如陆地棉栽培品系AN-Boyovut-2用于与RNAi Coker-312植物的常规基因杂交实验。
实施例2
RNAi载体构建
我们使用高通量pHellsgate-8GateWay质粒载体(由P.Waterhouse博士和C.Helliwell博士提供，CSIRO，澳大利亚)构建了PHYA1基因特异RNAi双元载体构建体(Wesley等，前文；Helliwell等，前文)。RNAi载体被转化进入农杆菌菌株LBA4404并且用于植物转化实验。
对于棉花PHYA1基因的attB位点(attB1和attB2)，设计并且自综合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies Inc)(爱荷华州，美国)购买所附的基因特异引物Gos_PHYA1attB1-F和Gos_PHYA1attB2-R(表1)。这些引物对特异性扩增棉花的213bp PHYA1基因片段(SEQ ID NO:1)，其对应棉花光敏色素A基因的铰链区的一部分。值得提到四倍体棉花具有两个不同的PHYA1基因，一个获得自二倍体D-基因组祖先，另一个获得自二倍体A基因组祖先(Abdurakhmonov等2010，前文)。这两个PHYA1基因在213bp RNAi部分具有99％核苷酸一致性；它们的差异在于在由SEQ ID NO:1提供并鉴定的序列的Y(C或T)和R(G或A)位置有两个单核苷酸多态性。首先，根据制造商的说明和手册，用KODHiFi高保真校对DNA聚合酶(Novagen，美国)和非attB基因特异引物，由棉花基因组DNA扩增PHYA1的特异的棉花光敏色素基因片段。使用琼脂糖凝胶电泳验证预期的基因特异性PCR产物。然后在第二循环PCR反应中以纯化的第一PCR扩增子用作模板用attB-侧翼基因-特定引物(表1)将attB1和attB2位点连接至获得的PCR产物上。使用凝胶电泳验证获得的attB-侧翼PCR产物的大小和正确性。用聚乙二醇(PEG)溶液(包含26％PEG 8000、6.5mM MgCl2和0.6mM pH 5.2醋酸钠)纯化PCR产物去除剩余的attB引物。如Helliwell等(前文)描述的进行attB位点-侧翼基因产物和载体之间的位点特异性重组反应。
与pDONOR221(Invitrogen，美国)的重组反应在总体积10μl的反应混合物中进行，其中2μl BP克隆酶缓冲液(Invitrogen，美国)、2μl attB位点侧翼PCR产物、150ng质粒载体和2μl BP克隆酶(Invitrogen，美国)。反应混合物在25℃下孵化过夜。重组混合物(2μl)被转化进入化学感受态DH5-α大肠杆菌细胞(Invitrogen，美国)。转化的细胞在包含50mg/L奇霉素的LB(Lysogene Broth)平板上生长。通过使用M13引物的PCR，菌落进一步经过质粒分离和插入分析。通过NaOH/SDS裂解方法分离质粒(Sambrook等，前文)。根据制造商的说明，来自包含插入pHellsgate-8的attB-PHYA1的pDONOR221质粒的重组反应以10μl的总体积进行，其中2μl LR克隆酶缓冲液(Invitrogen，美国)、2μl重组体pDONOR221-attB-PHYA1(150ng)、300ng pHellsgate-8和2μl LR克隆酶(Invitrogen，美国)。反应混合物在室温下孵化过夜，用蛋白酶K处理并且2μl的等分试样被转化进入DH5-细胞(Invitrogen，美国)。细胞在包含选择性抗生素奇霉素的LB平板上生长。挑取菌落用于进一步确认与attB-位点的正确重组。用XhoI(用于有义方向)和Xba(反义方向)进行限制性酶切分析；如Helliwell等描述(前文)的，选择经验证的克隆用于进一步的RNAi载体制备。
表1.PCR-扩增、载体构建和实时定量PCR.ll的引物对和探针
*attB1和attB2序列加下划线
实施例3
棉花转化和体细胞胚发生
对于棉花转化和体细胞胚发生，我们使用基于棉花的其他组织培养研究(Stewart和Hsu.1977.Planta 137:113-117；Firoozabady等1987.Plant Mol.Biol.10:105-116)对植物再生培养基进行了修饰的Sunilkumar和Rathore的方法(2001.Mol.Breeding 8:37-52)。用于棉花组织培养的所有试剂购买自Phytotechnology美国。在2008年，T0幼苗转移至盆中的土壤并且在温室环境下生长。
硫酸脱纤维的Coker-312棉花种子表面灭菌10分钟，用70％乙醇冲洗并且在排风罩下短暂灼烧以去除痕量乙醇。种子种植在0.7％琼脂培养基中并且在28℃保持在黑暗条件下3天进行萌发。萌发的种子置于16小时光照随后8小时黑暗的光周期条件下进行幼苗发育。从一周龄的幼苗中分离5-7mm的下胚轴部分。这些下胚轴部分的75％用于转化实验；剩余25％的部分被分开作为阴性对照。下胚轴部分用实验室刀片在数个地方产生创伤，并且放置在培养基P1上(4.31g/L MS盐、0.4mg/L硫胺HCL、100mg/L肌醇、0.75mg/L MgCl2、3％葡萄糖、0.2％植物凝胶(Phytagel)、5mg/L 2ip、0.1mg/L NAA，pH 5.8)。承载pHellsgate-8::PHYA1 RNAi载体的LBA4404悬浮液(5μl)涂敷到创伤的下胚轴部分，然后在22℃的黑暗条件下培养72小时。pHellsgate-8::PHYA1RNAi载体在含有抗生素利福平(10m/L)和奇霉素(50mg/L)的YEP培养基(10g/L细菌蛋白胨、5g/L NaCl、10g/L酵母提取物，pH 7.0)中生长。细菌培养物在管中在26℃下200rpm振荡生长36h。将来自5个管的细胞合并，通离心收集，再悬浮在10ml含有100μM乙酰丁香酮的预诱导培养基(10g/L葡萄糖、14.62g/L MES、20ml/L磷酸钠缓冲液pH 5.6、50ml/L 20×AB盐母液(Chilton等1974.Proc.Nat.Acad.Sci.美国71(9):3672-3676)。为了对照，5μl无菌水代替细菌悬浮液被应用。
72小时后，感染的和对照下胚轴部分转移至新鲜的含有卡那霉素(50mg/L)和cephabol(500mg/L；阿莫西林的类似物)的P1培养基，培养物在16h光周期下生长(10μmolm-2s-1)。三周后，在选择性P1培养基生长的3mm愈伤组织转移至新的P7培养基(4.31g/L MS盐、0.4mg/L硫胺HCL、100mg/L肌醇、0.75mg/L MgCl、3％葡萄糖、0.2％植物凝胶、0.1mg/L2ip、5mg/L NAA，pH 5.8)，连续培养生长，每个月继代培养该组织。小于3mm的愈伤组织在P1培养基中保持再三周，随后转移至P7培养基。16周的体细胞胚发生诱导之后，在选择性P7培养基上生长的愈伤组织生长转移至新的改良培养基R5(含有4.31g/L MS盐、1ml/L维生素Gamborg溶液、1.9g/L KNO3、0,75mg/L MgCl、3％麦芽糖，0.2％植物凝胶)。在12-16周R5培养基中产生体细胞的胚。然后，6-7mm大小的体细胞胚转移至改良的SH1培养基(10ml/L 100×微量营养物、50ml/L 50×大量营养物、1ml/L维生素B5、5g/L蔗糖、15g/L细菌琼脂、2g/L植物凝胶)培养基并且在黑暗条件下孵化10天。在该时间段内进行干燥和发根过程。然后胚转移至新的SH-2培养基(10ml/L 100×微量营养物、50ml/L 50×大量营养物、1ml/L维生素B5、20g/L蔗糖、1g/L植物凝胶，和5g/L琼脂)并且在16h光周期下(10μmol m-2s-1)生长10天，用于根和叶的发育。在初始根和叶的发育之后，胚幼苗转移至SH-3培养基(10ml/L 100×微量营养物、50ml/L 50×大量营养物、1ml/L维生素B5、20g/L蔗糖、1g/L植物凝胶和2.25g/L琼脂)并且在强光(70μmol m-2s-1)下生长进行根和叶的充分发育。10天之后，充分发育的胚幼苗转移至具有SH-3培养基的塑料容器使得4-5片叶和其他根发育。
实施例4
使用PCR鉴定转化的植物
来自测试的每个棉花基因型，使用对冷冻组织的微小修改和优化的Dellaporta等的方法(1983.Plant Mol.Biol.Rep.1:19-21)，从冷冻的叶组织分离基因组DNA。在0.9％琼脂糖电泳中分析制备的基因组DNA并且基于Hind III消化的λ-噬菌体DNA估算DNA浓度。RNAi载体特异性35S-F/PDK-R或PDK-F/OST-R引物对(表1)用于验证阳性转基因植物。
在50μl体积中进行扩增反应，包含4.5μl含有MgCl2的10×PCR缓冲液、1μl BSA、0.5μl 25mM的dATP、dGTP、dTTP和dCTP混合物、2.5μl 50ng/ml的每种反向引物和正向引物和1μl 50ng/ml的模板DNA。在第一循环的退火温度下将Taq DNA聚合酶(0.5U)(Sigma，美国)添加至反应。进行扩增：首先在94℃下变性3min；随后94℃，1min，55℃，1min(退火)和72℃，2min(延伸)，45循环。然后在72℃下最终延伸5min。为了鉴定PCR产物，在0.5×TBE缓冲液中进行2％-琼脂糖(Sigma)凝胶电泳。用溴化乙锭染色凝胶。
实施例5
RNAi植株评估
T0和T1代：通过体细胞的胚发生获得的PCR-阳性，转基因T0RNAi Coker312植物以及非转基因对照萌芽植株转移至装有土的盆中并且在温室环境下生长以生产自授粉的T1种子。通过在开花之前用棉花线包裹花瓣实现自授粉。此外，在温室环境下来自每个PCR阳性T0植株的15-20个T1种子在装有土的小纸杯中萌发；然后，从小片的子叶叶组织分离基因组DNA，使用RNAi载体特异性引物进行PCR扩增。选择PCR阳性T1植物用于进一步生长并且当第一个真叶出现时，将它们转移至更大的盆中以进行表型观察以及产生自授粉T2种子。在T1代中，与相同温室环境生长的非转基因Coker 312植株相比，RNAi植株的开花时间和棉铃成熟以及纤维短长度特征被评价。由第一次开花日期确定开花时间和已开的花的数量。在评估时间基于每个T1植株吐絮的数量测定棉铃成熟。手动测量纤维长度并与正常Coker 312纤维进行比较。
T2代：基于初步的开花和纤维特征，选择来自不同转化事件的个体T1植株用于随后的T2代植株评估。对于此，种植40-45个来自每个选择的PCR阳性T1植物的T2种子并使其在太阳光条件下在装有土的小纸杯中萌发。当出现真叶时，于2009年将它们移栽至乌兹别克斯坦塔什干的遗传和植物实验生物学学院的田间点。源自不同转化事件的每个T1植株(单粒传)的40至45株T2植株作为家族与25株非转基因对照Coker 312植株生长在标准田间小区设计的两行(60cm行间距)10米长地块。记录每个田间生长的T2RNAi家族和对照植株的下胚轴长度的平均指数、开的花和打开的棉铃的数量。第一个开的花被标记日期指示以确定开花时间不同。使用高容量测定仪(HVI)在乌兹别克的塔什干的纤维测试中心“SIFAT”测量这些田间生长的个体T2代RNAi和对照植株的纤维品质性状，包括上半部平均(UHM)、纤维强度(STR)、马克隆值(MIC)和纤维均匀性。所有植物在开花前用棉花线包裹花瓣以进行自授粉从而生产纯合T3代种子，。
T3代：基于2009年的田间评估，我们选择了来自与对照植株相比具有改善的棉花纤维品质，强健的芽和根发育和早开花表型的两个不同T2RNAi植株家族(T2-1_7和T2-31_10)的植株。2010年，来自这两个RNAi家族的自授粉T3代种子在相同田间条件下以10行10米长地块(90cm行间距，0.010公顷)中生长，连同并排生长0.010公顷对照植株。我们通过称重来自60000株植株/0.010公顷的T3RNAi棉花家族和对照家族测量产量。手工测量衣分率，100粒种子的重量(种子指数)和衣分指数并且从每个选择的T3RNAi植株家族和对照植株的24株个体植株中取平均值，从每个植株的六个充分成熟的棉铃取籽棉。我们在乌兹别克的塔什干的纤维测试中心“SIFAT”单个分析这些T3代RNAi家族植株的纤维品质性状。我们也测量了这些选择的RNAi家族植物，即在温室的专用实验室塑料盆中生长的PCR阳性幼苗的根长度。在种子萌发25天之后测量根长度，将其与来自相同生长环境的相同天数的Coker312对照植株比较。对于此，切开塑料盆并且小心冲洗围绕根的土壤内容物。另外，来自田间的T3植株在开花和棉铃成熟阶段被挖出，其根经冲洗，其根长度与在相同田间中生长的对照植株的根长度进行比较。用非参数配对样品测试(Wilcoxon配对符号秩测试)使用版本0.2.1Plainstat(从因特网获得：<URL:.plainstat.com)检验RNAi家族和对照植株之间性状差异的统计显著性。
T0-T3代中的棉花转化和表型观察
我们成功获得承载棉花PHYA1 RNAi构建体(图1)的转基因棉花愈伤组织的群体，它们对选择标记卡那霉素具有抗性。这些转基因愈伤组织生长至体细胞胚阶段，获得转基因萌芽植株。相比体细胞再生的非转化对照，在用pHellsgate-8::PHYA1 RNAi载体(图1和2)转化的所有候选物-转基因棉花胚植株中，我们观察到非常快速和强健的侧根和主根发育，包括叶柄和果枝伸长以及早开花表型的改变的植株株型。
当我们测量来自T0萌芽植株的纤维时，转基因RNAi植株的纤维比对照植株的纤维长至少5mm(图1)。确认RNAi构建体插入T0和T1以及T2基因组DNA的PCR分析(数据未显示)证明RNAi构建体的转化和其在后代中的稳定遗传。T1和T2代RNAi植株的田间生长植物的详细的表型评估也显示旺盛的营养生长和明显改变的植株株型(图2)，早5-10天开花和棉铃早成熟表型(图2)以及纤维UHM长度增加2mm至8mm，图3。作为标记表型，具有更长的下胚轴和伸长的叶柄的植株与相比对照在RNAi植株的茎干和叶中也有更多的花青素色素沉积。该色素沉积在棉铃成熟期明显表达(图4)。
T2:3-代中主要纤维特征的分析
为了分析田间生长T2植物的纤维特征，我们收获来自每个个体植物的棉铃。我们在不同RNAi家族中选择了89株比非转化植物早开花和成熟5-10天的植物，测量了主要纤维性状，并与来自在相同生长条件下与RNAi植株在相同田间并排生长的8株个体非转化Coker312植物的纤维进行比较。纤维样品的HVI分析显示含有pHellsgate-8::PHYA1 RNAi构建体的植物具有增加的纤维长度(上半部平均-UHM)，范围为1.25至1.36英寸(图5)。一般而言，其他纤维特征马克隆值(MIC)和纤维均匀性(UI)也显著改善(p<0.0001；图5)。例如，我们观察到高质量的个体RNAi基因型的纤维长度为1.32英寸、马克隆值为4.6、纤维强度为35.5g/特和纤维均匀性88％。在相同田间中生长的非转化对照Coker-312植物的平均UHM为1.23英寸、MIC 5.2、STR 31g/特和UI为87％。
基于T2表型评估，我们选择两个植物家族，即T2-1_7和T2-31_10，与对照植株相比，具有显著改善的纤维品质诸如UHM(p<0.001)、MIC(p<0.001)、UI(p<0.02)、ELO(p<0.0001)、开花(p<0.01)、下胚轴长度(p<0.0001)和棉铃成熟(p<0.0001)特征(图6)。在两个RNAi家族中，平均纤维长度显著(p<0.0001)增加；但是，与T2-31_10家族植物相比，T2-1_7RNAi家族植物具有显著改善的MIC(p＝0.00006)和UI(p＝0.001)。相反，与T2-1_7RNAi家族相比，T2-31_10植物具有更长的下胚轴(p＝0.0001)、更多开的花(到2009年7月15日；p＝0.005)和棉铃(到2009年9月15日；p<0.0001)。另外，与T2-31_10家族和对照Coker 312二者相比，我们在T2-1_7RNAi家族中观察到更长的主根和侧根(图7)。于2010年这两个选择的RNAi家族的田间评价显示在T1:2代中观察到的主要的RNAi作用在T3中稳定表达，并且我们观察到纤维性状的一致的改善，诸如强度、UHM、UI和ELO(p<0.05)(表2，图7A)、根发育(图7C，D)和棉铃成熟(在线补充的图S6)以及旺盛的营养生长(图8)。但是，在2010年的环境中，观察到的T3-31_10纤维的MIC与对照纤维相比在改善上的差异在统计学上不显著，但是T3-1_7RNAi家族的纤维与对照纤维显著不同。同时，在2010年环境中，我们观察到与对照相比T3RNAi植株平均STR的统计学上显著的(p≤0.02)改善。
选择的T3家族中其他纤维特征的测量显示衣分率的减少多达1.6％、种子指数(100粒种子的重量)的减少为3.8％，衣分指数的减少多达9.8％，减少尽管小但是统计学上显著(p<0.05-0.001)(表2)。然而，T3RNAi家族的籽棉重量比对照非转基因Coker 312植物相多高达6kg(18％)。结果的总结在表2中显示。
表2.于2010年在实验田间条件下生长的选择的T3代RNAi植株家族和对照植株的平均纤维品质性状
UHM-上半部平均(英寸)；MIC-马克隆值；STR-纤维强度(g/特)；UI-纤维均匀性(％)；ELO-伸长率(或纤维弹性，％)；SD-标准偏差.*，**，***，****-与对照相比在威氏配对符号秩次检验中统计学上显著性分别为p≤0.5，p≤0.01，p≤0.005和p≤0.0001。
衣分指数＝(棉绒％×100粒种子的重量)/种子重量％。威氏配对符号秩次检验中两个RNAi家族(T3_1-7和T3_31-10)之间的测量性状的统计显著性显示为ap≤0.05。
实施例6
整合的RNAi载体序列的拷贝数鉴定
实时定量PCR用于鉴定T3代中整合的转基因载体序列的拷贝数。对于此，我们按照Weng等描述的方法和拷贝数计算(2004.Plant Mol.Biol.Rep.22:289-300)并且使用新霉素磷酸转移酶II(nptII)和为转基因棉花系中的拷贝数鉴定开发的陆地棉At-基因组特异性泛素(GhUBC1)基因-特异性引物对和Taq Man实时PCR探针(表1)(Yi等2008.Anal.Biochem.375(1):150-152)。
为了制作标准曲线，我们根据制造商的规程和说明(Invitrogen，美国)将GhUBC1片段克隆到质粒载体
TOPO-TA；该质粒载体包含nptII基因作为选择标记。因此，获得参考质粒载体，其包含基于质粒载体的绝对拷贝用于构建标准曲线的nptII和GhUBC1基因。pCR4-TOPO-nptII-GhUCB1载体长～4.1kb；所以，20ng用于扩增的初始浓度具有4526321921个拷贝。我们进行六个10-倍连续稀释并且使用qPCR引物对和探针(表1)扩增靶基因。
在美国应用生物系统公司7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司，福斯特市，美国)上进行实时定量PCR。PCR反应在12.5μl体积中按照制造商推荐的标准程序进行：95℃，10min；随后95℃，15s和60℃，1min，40个循环。每个12.5μl反应混合物包含6.25μl预混液(2×)、0.25μl(200nM)的每个引物(10μM)、1μl(40nM)的探针(0.5μM)、4μl的模板DNA样品(0.2pg至20ng)和0.75μl无菌去离子水。2×PCR预混液包含No AmpEraseUNG、AmpliTaqGold DNA聚合酶、具有dUTP的脱氧核糖核苷三磷酸和具有氯化镁的Taq Man反应缓冲液(美国应用生物系统公司，福斯特市，美国)。
绘制平均Ct值对绝对拷贝数的对数以获得标准曲线。进行六次重复反应以对每个靶基因创建标准曲线。基于标准曲线的斜率用下式计算扩增的效率：E＝10(-1/斜率)-1(Ginzinger，2008；Yi等，前文)。如Weng等描述(前文)用X0/R0＝10((Ct，X-IX)/SX))-((Ct，R-IR)/SR)的推导进行拷贝数计算，其中X是nptII，R是UBC1，I是标准曲线的截距，S是靶基因(X)和参考基因(R)的标准曲线的斜率(Weng等，前文)。X0/R0值直接用于(即不加倍)拷贝数估算，因为我们的样品是T3代植物，不是如Weng等情况的T0代(前文)。由GhUBC1(内源对照)和nptII(靶基因)变异系数估算，计算拷贝数估算的变异系数。
T3代选择的RNAi植株的载体特异PCR扩增显示选择的RNAi植株具有pHellsgate-8::PHYA1 RNAi质粒的基因组插入(图7B)。此外，在实时定量PCR实验中，对于拷贝数鉴定的相关系数、斜率和PCR效率高度可接受(Ginzinger，2008)。循环阈值(Ct)的变异系数在每个稀释系列的六次重复扩增中变化范围仅仅为1.1-4.6％(表3)。结果显示来自T3-1_7家族的PCR-阳性RNAi植株在它们的基因组中具有三个拷贝的pHellsgate-8::PHYA1 RNAi载体，而来自T3-31_10家族的RNAi植株在它们的基因组中包含2拷贝的pHellsgate-8::PHYA1 RNAi载体。作为附加的对照，我们包括Bt-棉花的DNA样品，其具有插入在其基因组中的单拷贝的cry I转基因(表4)。
表3.使用pCR4TOPO nptII-GhUBC1质粒载体(4.1kb)的卡那霉素(nptII)和泛素(UBC1)基因的标准曲线
SD-标准偏差；SE-标准误差＝SD/SQRT(n)，其中n是样品大小。*对每个稀释qRT-PCR反应重复6次；显示的平均值；**使用下式计算PCR的效率：E＝10(-1/斜率)-1并且以百分数显示。
表4.第三代(T3)RNAi棉花系中估算的nptII数
SD-标准偏差；SE-标准误差(SD/SQRT(n))；CV-变异系数(SD/平均值)；*每个样品qRT-PCR反应重复6次并且平均值显示在该表中；**X0/R0＝10((Ct，X-IX)/SX))-((Ct，R-IR)/SR)，其中X是nptII，R是UBC1，I是标准曲线的截距，S是靶基因(X)和参考基因(R)的标准曲线的斜率(Weng等，前文)；***使用s＝(cv)(平均值nptII/平均值UBC1)，其中cv＝SQRT((CVnptII)2+(CVUBC1)2)由UBC1(内源对照)和nptII(靶基因)变异系数估算值计算在拷贝数估算中的变异系数。
实施例7
RNA分离和实时定量PCR
使用Suzuki等(2001.J.Exp.Bot.52:1575-1579)和Wu等(2002.PlantMol.Biol.Rep.20:213-218)描述的方案的组合加上微小的修改从T3代RNAi棉花植株和非RNAi对照植株的叶组织中分离总RNA。对于详细的RNA分离方案、cDNA合成和实时定量PCR扩增细节，参考在线的补充方法5。为了鉴定RNAi在PHYA1基因以及其他棉花光敏色素基因(PHYA2s，PHYBs，PHYCs和PHYEs)表达中的影响，我们使用实时定量PCR(qRT-PCR)方法，其使用基于SYBR-green的扩增子检测。我们从非RNAi Coker 312和与用于拷贝数鉴定和表型评估相同的RNAi植株合成cDNA。对照和RNAi植株生长在相同的温室环境和相同的光照条件下。为了对在qRT-PCR分析中使用的每个基因制作标准曲线，建立了来自对照Coker 312的2-倍稀释系列(1×、2×至多至128×)的1:15稀释的cDNA。绘制至少2个的平均Ct值对起始量的对数以获得标准曲线。基于标准曲线的斜率用下式计算扩增效率：E＝10(-1/斜率)-1(Ginzinger，2008)。来自每个分析基因获得的标准曲线的斜率和截距指数被用于计算对数输入量(对数输入量＝(平均Ct靶基因–截距靶基因)/斜率靶基因)；然后，使用10log输入量计算输入量。光敏色素基因获得的输入量除以内源对照基因GhPP2A1的输入量(Artico等2010.BMC PlantBio.21:10-49)。然后，通过RNAi植株中靶基因表达的标准化数量除以对照植株中相同基因表达的标准化数量计算用作校准器的靶基因的相对量。由GhPP2A1和每个光敏色素的变异系数估算值计算变异系数。
简要地，100mg叶组织立即在液氮中冷冻并且使用杵和研钵粉末化，随后添加2mLWu等的热抽提缓冲液(前文)，加热至80℃并且添加新鲜的10mM DTT。然后，60μL的25mg/mL蛋白酶K添加至组织匀浆中，进一步研磨以混合。充分混合组织匀浆，转移至2mL塑料管，在室温下保持15min并且在+4℃下以最高速度离心(Eppendorf 5415R，Germany)20min。上清液转移至新鲜的2mL管并且随后是常规的水-饱和的苯酚:氯仿-异戊醇RNA沉淀程序(Chomczynski和Sacchi.1987.Analyt.Bioch.162:156-159；Suzuki等，前文)。从此角度，所有步骤精确按照Suzuki等的描述并且优化(前文)。通过75％(v/v)乙醇冲洗所得RNA小球、风干并且溶解在无菌DEPC-处理水中。
为检查RNA的完整性，5μl总RNA溶液在存在溴化乙锭情况下加载到包含2.2M甲醛的1％琼脂糖凝胶上(Maniatis等，1982)。通过rRNA条带的存在和完整性判断RNA的完整性。此外，根据制造商的规程用无RNA酶的rDNA酶I(Ambion，美国)处理总RNA样品并且通过额外的纯化步骤使用酸性苯酚：氯仿(5:1；Ambion，美国)和乙醇沉淀再纯化。使用分光光度计(GENESYS 10UV，赛默飞世尔科技公司，美国)对总RNA样品的浓度进行定量。使用Avian RTcDN试剂盒(西格马公司，美国)根据制造商的规程用随机的九聚体引物由～2μg总RNA合成第一条cDNA。合成的第一条cDNA用无菌水1:15稀释并且用于RT和qRT-PCR分析。首先，用内含子特异性引物对进行RT-PCR反应(A1341F/R；表1；Cronn等2002.Am.J.Bot.89:707-725)，检查DNA污染并且用棉花的蛋白质磷酸酶2A基因的催化亚单位的引物进行RT-PCR反应(GhPP2A1；Artico等，2010)以检查合成的cDNA的质量。使根据制造商的规程使用RT-PCR试剂盒(Sigma，美国)进行RT-PCR反应。如果样品未能扩增内含子引物对而不是内源性参考基因(数据未显示)，样品仅仅进行qPCR。这确保在rDNA酶处理之后完全去除基因组DNA。
在美国应用生物系统公司7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司，福斯特市，美国)上进行实时定量PCR。采用下列循环条件在25μl体积中进行PCR反应：95℃，10min随后95℃，15s以及65℃，45s，40个循环。每个25μl反应混合物包含12.5μl SYBR GREEN预混液(2×)、0.35μl(140nM)的每个引物(10μM)、6μl的模板1:15倍稀释的cDNA模板和5.8μl无菌去离子水。2×SYBR GREEN PCR预混液包含No AmpErase UNG、AmpliTaq Gold DNA聚合酶、具有dUTP的脱氧核糖核苷三磷酸和具有氯化镁的SYBR Green反应缓冲液(美国应用生物系统公司，福斯特市，美国)。，针对用于评估引物-二聚体、基因组DNA污染和错退火问题的每个引物对构建实时PCR后解离曲线。将有问题的反应孔从分析中删除。使用7500系统SDSv1.4软件(美国应用生物系统公司，福斯特市，美国)进行qRT-PCR扩增的分析。
为了对两个RNAi植株家族(如图7中所显示)中相关基因的表达进行定量，首先，我们对每个来自校准器样品(Coker 312)的2-倍连续稀释的1:15稀释的cDNA的基因制作标准曲线。结果表明每个靶基因的校正系数和斜率以及每个测试基因的引物对的PCR-效率(高于95％)在可接受的范围(Ginzenger，2008)内以进行相对定量(表5)。在所测试的六个基因引物对中重复的扩增中，循环阈值(Ct)的变异系数的范围仅仅是0.2-2.6％，标准偏差值范围仅仅是0.2-0.7，表明qRT-PCR系统稳定并且可靠地起作用(表6)。
表5.光敏色素基因特异性引物的标准曲线(STC)；qRT-PCR
*每个引物的qRT-PCR反应重复两次，平均值用于制作标准曲线；**使用下式计算PCR的效率：E＝10(-1/斜率)-1并且以百分数表示。
表6.T3代RNAi和正常棉花基因型的光敏色素基因和内源对照基因(GhPP2A)的定量PCR扩增细节
SD-标准偏差；SE-标准误差(SD/SQRT(n))；CV-变异系数(SD/平均值)
pHellsgate-8::PHYA1 RNAi载体的转化和整合影响数种棉花光敏色素基因的表达(表1；表7)。T3-1_7中70％的PHYA1基因表达以及T3-31_10家族中24％的PHYA1基因表达被抑制。PHYA1 RNAi构建体未抑制所测试的其他光敏色素基因的表达，除了T3-31_10中PHYB轻微(10％)下调。然而，在两种RNAi植株样品中，我们检测到PHYA2、PHYB(仅仅T3-1_7样品中)、PHYC和PHYE基因2至20倍的过表达。令人感兴趣地是，所测试的其他光敏色素基因的高水平的过表达在T3-1_7样品中更明显，其中与其他RNAi样品T3-31_10相比，检测到PHYA1基因表达的更深度地抑制(表7)。
表7.T3RNAi棉花系和对照样品的相对量估算
*使用s＝(cv)(平均值靶/平均值内源)，从内源对照和每个靶基因的平均对数输入量的变异系数估算计算相对量的变异系数，其中cv＝SQRT((CV_靶)2+(CV_内源)2)。
实施例8
经常规的遗传杂交光敏色素特异性RNAi作用的遗传转移
当我们将T0-代RNAi Coker 312植物与乌兹别克斯坦棉花的四种商业变异体(Namangan-77，AN-Boyovut-2，C-6524和Tashkent-6)杂交并且评估来自这些杂交的F1和F2代杂种时，我们发现与在相同田间条件下并排生长的对照植株(原始变异体)相比，其具有明显改变的植株株型，包括伸长的叶柄和果枝、更大平均数的花和棉铃以及早平均5-10天的植物开花和成熟。我们也观察到RNAi杂种中更多的花青素色素沉积(图8)。使用HVI系统测量的纤维特征证实在所有上面提到的变异体的F2-代杂种中纤维品质明显改善。例如，在乌兹别克斯坦的野生生长的变异体的一种变异体的F2-代杂种AN-Boyovut-2中，纤维品质性状(图9)的改善与RNAi Coker-312植物的T2和T3代中的观察类似。在AN-Boyovut-2×RNAiCoker 312的F2-代杂种中，我们观察到高质量RNAi基因型，其UHM为1.37英寸、MIC为3.8、STR为31.5g/特和UI为90％。相同-田间生长的对照AN-Boyovut-2植物的平均UHM为1.17英寸、MIC为4.9、STR为30g/特和UI为86％。在其他变异体杂交的F2和F3代中观察到类似趋势的纤维性状改善以及开花和根发育改善(数据未显示)。尽管杂种中衣分率、衣分指数和种子指数更小，我们观察到在不同变异体杂交的F3RNAi杂交家族中与相同田间生长的初始亲本相比6-13kg/0.010公顷更多的籽棉产量，表明增加18-40％籽棉产量的潜能。因此，该构建体被整合进入基因组并且性周期传递并且能选择表现出与原始T3RNAi转化植物非常类似的性状测量值的植物。
在本说明书中提到的所有出版物和专利通过引用并入本文，就像具体地、单独地提及的每篇出版物或专利通过参考并入的程度。
已经为了阐释和描述本发明的目的呈现了前述说明书和某些代表性实施方式以及本发明的细节。其目的不是穷尽的将本发明限于所公开的精确形式。显而易见，在不背离本发明范围的情况下，本领域技术人员可作出修饰和改变。
Claims (13)
1.分离的或重组多核苷酸分子，其是编码陆地棉的PHYA1多肽的一部分铰链区的DNA序列，其中所述DNA序列是SEQ ID NO:1或与其完全互补的序列。
2.编码PHYA1多核苷酸基因序列的发夹核酸构建体，所述PHYA1多核苷酸基因序列是陆地棉的PHYA1基因的一部分铰链区的213个连续的有义核苷酸碱基对和其反义互补物，以致当第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列转录成核糖核酸时杂交以形成发夹样双链核糖核苷酸分子，其中213个连续的有义核苷酸碱基对部分的铰链区是所述序列SEQ ID NO:1。
3.包括PHYA1RNAi构建体的重组双元载体，其中所述构建体编码PHYA1基因序列，所述PHYA1基因序列是来自PHYA1基因铰链区的213个连续碱基对的核苷酸序列，其中花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子存在于紧靠PHYA1发夹上游的核苷酸序列中，每个构建体由农杆菌介导的接种递送，产生体外重组和PHYA1基因的抑制以及改变的其他光敏色素的表达水平，其中213个连续碱基对的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。
4.降低植物中光敏色素A1水平的方法，所述方法包括在所述植物中表达编码PHYA1基因序列的异源核酸构建体，所述PHYA1基因序列为双子叶植物的PHYA1基因的一部分铰链区的213个连续的有义核苷酸碱基对和其反义互补物，其中所述表达诱导所述植物中的RNA干扰(RNAi)从而产生表现出下述特征中的一种或多种的植物：相对于在正常太阳光下栽培的野生型双子叶植物，伸长的叶柄、伸长的果枝、伸长的棉铃花梗和伸长的根系、旺盛的营养生长、早开花、棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉积、增加的纤维长度、提高的纤维强度、提高的纤维马克隆值、提高的纤维均匀性和增加的纤维产量，其中213个连续的有义核苷酸碱基对的序列为SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物选自菊类植物(Asteroids)和蔷薇类植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述植物选自由如下所组成的组中的植物：拟南芥、西红柿、马铃薯、柑桔、萝卜、胡萝卜、花椰菜、大麦、棉花、葡萄、玉米、苜蓿、水稻、大豆和小麦。
7.用于降低棉花植株中光敏色素A1水平的方法，所述方法包括在所述植株中表达编码PHYA1基因序列的异源核酸的构建体，所述PHYA1基因序列为棉属PHYA1基因的一部分铰链区的213个连续的有义核苷酸碱基对和其反义互补物，其中所述表达诱导所述植株中的RNA干扰(RNAi)从而产生生产出表现一种或多种改善的纤维品质特征的长纤维的植物，其中所述特征是强度、马克隆值、伸长率和均匀性，其中213个连续的有义核苷酸碱基对的序列为SEQ ID NO:1。
8.用于降低棉花植株中光敏色素A1水平的方法，所述方法包括在所述植株中表达编码PHYA1基因序列的异源核酸构建体，所述PHYA1基因序列为棉属PHYA1基因的一部分铰链区的213个连续的有义核苷酸碱基对和其反义互补物，其中所述表达诱导所述植株中的RNA干扰(RNAi)从而产生表现出一种或多种下述特征的植物或所述植物的子代：相对于在正常太阳光下栽培的野生型棉花植株，伸长的叶柄、伸长的果枝、伸长的棉铃花梗和伸长的根系、旺盛的营养生长、早开花和棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉积、增加的籽棉产量以及一种或多种改善的纤维品质特征，其中所述特征是强度、马克隆值、伸长率和均匀性，其中213个连续的有义核苷酸碱基对的序列为SEQ ID NO:1。
9.用于修饰或抑制棉属细胞中PHYA1基因表达的方法，所述方法包括：用权利要求3所述的载体转化植物，所述载体包括编码dsRNA且可操作地连接至启动子和转录终止序列的核酸序列；选择已经将所述核酸序列整合到它们的基因组中的转化植株；筛选表达所述核酸序列编码的dsRNA的转化植株，以及选择表达所述dsRNA和/或siRNA的植株。
10.用于生产转基因棉花植株的方法，其中所述棉花的PHYA1基因被抑制，所述方法包括：(a)用权利要求3所述的PHYA1RNAi构建体稳定转化宿主棉花植株细胞，(b)从所述稳定转化的宿主棉花植株细胞体细胞再生转基因植株；以及(c)使所述转基因植株在所述植株表现出改变的光敏形态发生特征的条件下生长，所述改变的光敏形态发生特征包括改变的植株株型，与野生型未转化的棉花植株相比所述植株表现出下述特征中的一种或多种：伸长的叶柄、伸长的果枝、伸长的棉铃花梗、伸长的根系、旺盛的营养生长、早开花和棉铃早成熟、茎叶中增强衰老的花青素色素沉积、增加的籽棉产量和一种或多种改善的纤维品质特征，其中所述特征是强度、马克隆值、伸长率和均匀性。
11.改变植物特征的方法，其通过改变权利要求3所述的PHYA1RNAi构建体的拷贝数以便增强抑制。
12.改变植物特征的方法，其通过改变权利要求3所述的PHYA1RNAi构建体的拷贝数以便增强PHYB/C/E基因表达。
13.一种在常规育种中利用由权利要求7所述的方法产生的转基因植物以生产具有相同特征的更多转化植株或在其他各种相同的或相关植物种或杂交植物中引入所述基因构建体用于减少PHYA1的表型表达的方法。
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