CN114480421B

CN114480421B - 水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA及其应用

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Publication number: CN114480421B
Application number: CN202210103876.3A
Authority: CN
Inventors: 张亚丽; 张玮; 娄曼曼; 漏佳婧
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114480421A

Abstract

本发明公开了一种水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA，所述水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA在野生型水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA的第179位插入碱基T或C或碱基A缺失。本发明还公开了突变型基因，表达盒、重组载体或细胞在提高水稻对氮肥的利用率或改善水稻株型或增加水稻产量方面的应用。本发明公开的OsphyA突变体材料（OsphyA‑4、OsphyA‑6、 OsphyA‑17）与野生相比单株生物量增加111.7%，N含量增加85.6%，产量提高42.2%。

Description

水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA及其应用

技术领域

本发明涉及水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA及其应用，属于植物基因工程技术领域，具体地讲涉及水稻中编码光敏色素蛋白及其调控的基因应用。

背景技术

氮素既是蛋白质、核酸以及叶绿素等关键有机分子的基本组成元素，也是植物生长发育的主要限制因素之一，氮素供应不足将导致植物体内新细胞形成受阻，生长发育迟缓，产量下降。植物在其发育过程中需要足够的氮素营养，然而我国大部分土壤的有机质含量比较低，氮素供应不足，因此，施用氮肥成为增加作物产量、改善农产品品质的重要农艺措施。然而，值得注意的是，所施的氮肥中只有50％或者更少的氮用于植物的生长发育和产量构成，其它50％或者更多通过挥发、地表径流以及反硝化等途径在环境中损失(Camargoet al.，2005)。这样不仅导致资源浪费，更是造成了环境污染，如：水体富营养化、臭氧层破坏以及温室效应等(Guo et al.，2010)。因此，筛选出氮高效水稻品种和对氮供应不敏感的材料对于提高氮素利用效率、减少氮肥浪费造成的污染具有重要意义。

水稻是人们所依赖的主要的粮食作物之一，它也是研究单子叶植物分枝分子机制的模型系统。水稻分蘖是影响水稻产量的重要农艺性状之一，它的形成受氮、磷、钾等营养元素的影响，其中氮作为重要的环境因素影响水稻的生长和发育。研究发现，水稻分蘖和成穗率与氮素的供应存在紧密的联系(林贤青等，2005)。Zhang等指出氮素从碳氮代谢和内源激素合成两方面影响水稻的生长发育(张亚丽等，2004)。Xu等发现氮素与一些植物激素如生长素、细胞分裂素及独脚金内酯之间相互作用，最终会对水稻分蘖的变化产生影响(Xuet al.，2005)。氮素主要通过介导激素信号来调控水稻的分蘖进程，和生长素一起通过控制OsIPTs的表达量来影响CTK的合成，进而调控水稻分蘖的发育(潘寿，2016)。综上，在养分和植物激素共同调控分蘖中起重要的作用。氮素相关基因硝酸根转运基因OsNPF7.2正调控了水稻对外界硝酸根的吸收和水稻体内硝酸根浓度，进一步通过调控细胞分裂素与独脚金内酯等激素途径，影响了分蘖芽中细胞分裂的速度，最终增加水稻分蘖数，提高水稻产量(Wang et al.，2018)。此外，有研究表明GS1；2能促进分蘖芽的向外伸长。代谢分析揭示了GS1；2在茎基部的蔗糖含量显著减少，是由于OscFBP2基因表达下调，导致其分蘖数减少。因此，通过cFBPase2(胞质果糖-1，6-二磷酸酶)合成蔗糖来提供足够的蔗糖可能是水稻茎基部分蘖生长所必需的，表明分蘖的形成与代谢物的利用效率相关联(Miwa Ohashi et a1.，2018)。

随着人口的不断增长和耕地减少，粮食短缺已成为全球最严峻的问题之一。水稻是重要的粮食作物之一，全球有一半以上的人口都把它作为主食，因此提高水稻产量及品质为保障粮食安全具有重要意义。分蘖的形成在某种程度上能使水稻增产。分蘖的形成不仅受内部影响，也受外部因子的调控。前文已提及在合理施氮范围内，能促进分蘖的发生。同时分蘖的发生受氮相关基因调控，如GS1；2通过改变代谢合成相关基因表达影响代谢产物的合成，进而影响其分蘖(Miwa Ohashi et a1.，2018)。另外，分蘖还受光照的影响，光不仅为植物生长发育提供能量与物质基础，还可作为信号进行光形态建成。在这一系列的光信号转导过程中，光受体起着重要作用。

光敏色素是目前研究较为深入的光受体，主要接收波长范围为600-750nm的红光/远红光参与植物光形态建成，这种转运机制在陆地植物和藻类中都是保守的，它与隐花色素、向光素以及紫外光受体(UV-B)等，共同监测外界环境中不同波长的光，利用光信号转导至下游通路并整合内源激素等对植物生理和发育过程进行光特异性调节(Wang et al.，2018；张颖等，2018)。

光敏色素是一个多基因家族，水稻中有3个光敏色素基因，分别为OsPHYA、OsPHYB和OsPHYC(Kay et al.，1989；Dehesh et al.，1991；Basu et al.，2000)。OsPHYA参与种子萌发、节间生长、抑制长日条件下的开花及育性等生物学过程。OsPHYB调控气孔的数目，抑制短日条件下的开花(顾建伟等，2011)。过去的研究发现，光敏色素不同成员之间既存在一定的功能冗余，又有其自身独特的功能，这正是由于它们具有不同的表达水平、不同的蛋白结构、不同的光学特性、不同的核定位机制等所决定的。

近些年来，关于光敏色素的报道较多，研究表明光敏色素在植物全生育期的生长中起关键作用，包括种子萌发、幼苗去黄化、节间伸长、短日和长日条件下的日植物成花及昼夜节律生物钟等。此外，光敏色素在光信号转导途径中调控下游基因，还对代谢反应有影响。然而并未报道过光敏色素对分蘖的影响及光敏色素、分蘖及氮素三者的联系，尽管前两者与代谢反应有间接或直接的作用，光敏色素又受低氮诱导，但具体的分子机制尚待探究。本研究以水稻光敏色素家族基因为研究对象，针对分蘖发生的问题，揭示分蘖发生的分子机制，以阐明OsPHYs在水稻生长发育中的作用，进一步为研究光敏色素基因提供更充足的证据，并为改良水稻相关农艺性状和改善其品质提供理论依据，具有一定的科学意义。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是突变型基因，所述的表达盒、重组载体或细胞在提高水稻对氮肥的利用率或改善水稻株型或增加水稻产量方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种获得高氮肥利用率同时具有高产量植物的方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种鉴定植物的方法。

综上，本发明首次公开了光敏色素蛋白基因OsPHYA负调控低氮条件下水稻分蘖发生，该基因突变后显著提高低氮条件下水稻对氮肥的利用率、改善水稻株型、增加水稻的产量。

技术方案：本发明提供了一种水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA，所述水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA在野生型水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA的第179位插入碱基T或C或碱基A缺失。

其中，其野生型水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的突变型基因OsPHYA。

其中，所述重组载体为pCXUN-Cas9载体。

本发明内容还包括所述的突变型基因，所述的表达盒、重组载体或细胞在提高水稻对氮肥的利用率或改善水稻株型或增加水稻产量方面的应用。

本发明内容还包括一种获得高氮肥利用率同时具有高产量植物的方法，所述方法包括使植物包含所述的突变型基因。

其中，所述的获得高氮肥利用率同时具有高产量植物的方法，具体包括如下步骤：

1)OsPHYA基因的cDNA全长的获得；

2)突变体材料pCXUN-Cas9-OsphyA的构建；

3)转基因植株的获得。

其中，步骤2)中突变体材料pCXUN-Cas9-OsphyA的构建步骤如下：在OsPHYA基因的外显子区域设计spacer序列，OsphyA以U3启动子序列为模板转录sgRNA，将包含有sgRNA的水稻U3启动子连接到已被Kprd单酶切的线性化的pCXUN-Cas9载体中即得。

本发明内容还包括鉴定植物的方法，其中植物是包含所述的突变型基因的植物或所述的方法获得的植物，其特征在于，所述方法包括测定所述植物是否包含所述的突变型基因。

其中，所述鉴定方法中采用的引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明的通过转基因手段获得的OsPHYA突变体材料使得OsphyA(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型相比分蘖数增加147.1％，本发明的OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生相比单株生物量增加111.7％，N含量增加85.4％，产量提高42.2％。

附图说明

图1为OsPHYA在水稻苗期和分蘖期不同部位(根、根茎结合、倒一叶及其叶鞘)表达特征；

图2为OsphyA三个突变体(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)突变位点鉴定(WT，wild type，OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17分别是三个独立的突变体株系)；

图3为OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)在低氮条件下的表型；

图4为OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)在正常供氮条件下的表型；

图5为低氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比分蘖数增加；

图6为正常供氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比分蘖数没有明显差异；

图7为低氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比生物量增加；

图8为正常供氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比生物量没有明显差异；

图9为低氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比氮含量增加；

图10为正常供氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比氮含量没有明显差异；

图11为低氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比单株产量增加；

图12为正常供氮条件下，OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)与野生型(日本晴)相比单株产量没有明显差异。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1、试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；Car(Carbenicillin，羧苄青霉素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(AcetOsringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein EnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；L-pro (L-脯氨酸)；L-Glu(L-谷氨酰胺)；MES(2-(N-Morpholino)EthaneSulfonic Acid)；N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA(AA大量元素成份)。

2、溶液与培养基配方

1)N6培养基母液每升含量(20倍)：

2)B5微量母液每升含量(100倍)：

3)有机母液：

4)铁盐(100倍)：

5)AA大量元素母液(每升含量)：

6)诱导愈伤组织与继代培养基(每升含量)：

7)水稻愈伤组织与农杆菌共培养培养基(每升含量)：

8)抗性愈伤组织选择培养基(每升含量)：

9)分化培养基配方(每升含量)：

10)生根培养基配方(每升含量)：

11)感菌液配方(每升含量)：

12)农杆菌生长的YEP液体培养基配方(每升含量)：

实施例1 OsPHYA基因(genbank登录号为AB109891)在水稻中表达特征

1、总RNA的提取

参照RpPureNApre植物总RNA提取试剂盒(天根)提取RNA。

水稻日本晴种子经质量比为70％乙醇、30％NaClO消毒，催芽，培养到二叶一心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2国际水稻所水稻营养液中，四叶一心时换为国际水稻所水稻全营养液，培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮中冷冻保存。称取0.1g的材料，液氮研磨，加1mL裂解液RZ，样品融化后转入1.5mL的RNase-free离心管中，室温静置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s后静置3min；4℃，12000rpm离心10min，离心后，样品会分成3层：从下到上依次为有机相(黄色)，中间层和水相(无色)。RNA在水相中，吸取上清液转移至新的无RNase的离心管中；缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3，4℃，12000rpm离心30s；吸附柱中加入500μL RD，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；加入700μL RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30s，重复一次；空离2min，弃废液。之后将吸附柱放在超净台中，打开盖子通风10min；将吸附柱转入一个新离心管，加50μLRNase-free ddH₂O，静置2min，4℃，12000rpm离心2min，用质量比为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。

2、总cDNA合成

以水稻日本晴根及叶片的总RNA为模板按PrimeScript ^TMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa)说明书分别合成cDNA。

在Microtube中配制下列反应混合液；

65℃保温5min后，冰上迅速冷却；在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μL；

缓慢混匀，按下列条件进行反转录反应：42℃，60min；95℃，5min(酶失活)后，冰上冷却。

3、定量PCR

反转录合成总cDNA第一链后，以其为模板进行PCR扩增。

反应过程：水稻各组织cDNA扩增反应在96孔PCR板中进行。

反应体系为20μL：SYBRmix(2x)10μL，ROX 0.4μL，正向引物和反向引物各0.4μL，cDNA模板2μL，无菌水6.8μL，总体积20μL。配制混合物充分混匀后分配PCR板中。反应条件如下：95℃预变性30s、95℃变性5s、60℃退火30s、40次循环。

计算方法：采用双ΔΔCt值计算获得结果。基因的序列号和引物设计如下表：

*：参考文献，Xiaorong Fan，Lijun Jia，Yilin Li，Susan J.Smith，Anthony JMiller and Qirong Shen，2007 Comparing nitrate storage and remobilization intwo rice cultivars that differ in their nitrogen use efficiency，Journal ofExperimental Botany 58(7)：1729-40

通过对该基因在水稻不同部位(叶片、叶鞘、根茎结合、根)进行表达分析发现OsPHYA在根茎结合处表达量最高，其次是叶片和茎(图1)。

实施例2：OsPHYA基因的突变体材料的获得

1)OsPHYA基因的cDNA全长的获得

用以上获得的水稻日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsPHYA阅读框，引物序列为：

OsPHYA-F：5′-ATGTCTTCTTCAAGACCTACT-3′(SEQ ID NO.1)

OsPHYA-R：5′-TTATTTTGCTGGAGCAGAAGCAAG-3′(SEQ ID NO.2)

扩增体系：正反引物各1μL，DNA1μL，酶10μL，ddH₂O 7μL，共20μL。

PCR反应程序：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃复性，延伸3min30s，35个循环后，72℃ 7min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为3387bp片段，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与Peasy-blunt载体连接，酶连体系总体积5μL，包含1μL载体，4μL的PCR纯化产物，加完样后混合均匀，离心甩至管底，25℃放置30min，然后转化；42v热击转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，加500μL不含抗生素的LB液体培养基摇菌1h，然后低速离心，富集菌体，将其涂在含有卡纳100μgmL^-1的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsPHYA的开放阅读框ORF全长3387bp；将测序正确的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存备用；

2)突变体材料pCXUN-Cas9-OsphyA的构建

在OsPHYA的外显子区域设计spacer序列。靶点序列长为20bp：AGGATGGGGGCACTTACCA，并以NGG(N为任意碱基)结尾。同时通过NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站比对序列，排除其非特异性。OsphyA以U3启动子序列为模板转录sgRNA，将包含有sgRNA的水稻U3启动子连接到已被KpnI单酶切的线性化的pCXUN-Cas9载体中，引物序列为：

pCXUN-Cas9-OsphyA-F：5′-CAGGTAATCAAGGCAGAAG-3′(SEQ ID NO.3)

pCXUN-Cas9-OsphyA-R：5′-ATCATCAACACTTGGCACT-3′(SEQ ID NO.4)

最后通过电击法将pCXUN-Cas9-OsphyA质粒转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μgmL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取得到pCXUN-Cas9-OsphyA质粒，经KpnI和SpeI双酶切验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用；

3)转基因突变植株的获得

将以上获得的转有pCXUN-Cas9-OsphyA质粒的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养60小时，经过选择培养、分化、生根、炼苗得到T₀代转基因突变植株；对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T₁代和T₂代材料。

4)pCXUN-Cas9-OsphyA突变体材料的分子鉴定

突变体材料的鉴定需要两轮PCR。第一轮PCR是利用Cas9引物(SEQ ID NO.5和SEQID NO.6)，以T₀代收获的T₁代种子发苗，提取叶片上的DNA为模板，用普通酶扩增。鉴定是否有Cas9载体的转入，若凝胶电泳显示有条带的则进行二轮PCR。第二轮分别在OsPHYASpacer序列两端设计引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)，扩增出相对应的基因片段，将PCR产物送测序，比对测序结果找到具体的突变位置及类型。

Cas9-F：5′-ACAAGGGCAGGGATTTCG-3′(SEQ ID NO.5)

Cas9-R：5′-ACTGGTGGATGAGGGTGGC-3′(SEQ ID NO.6)

pCXUN-Cas9-OsphyA-F：5′-CAGGTAATCAAGGCAGAAG-3′(SEQ ID NO.7)

pCXUN-Cas9-OsphyA-R：5′-ATCATCAACACTTGGCACT-3′(SEQ ID NO.8)

扩增体系：上下游引物各1μL，DNAlμL，酶10μL，ddH₂O 7μL，共20μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性15Ss，55℃退火30s，72℃复性延伸30s，35个循环后，72℃7min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

鉴定结果：共鉴定出三个突变体株系，分别是OsphyA-4(179位增加一个碱基T)、OsphyA-6(179位碱基A缺失)、OsphyA-17(179位增加一个碱基C)。

实施例3：农杆菌介导的水稻转化

诱导愈伤组织：去皮的日本晴水稻种子(一盘14粒)入三角瓶，用75％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉75％乙醇，用30％次氯酸钠浸泡30min，然后用灭菌水清洗5-6次直至清亮。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把种子置于诱导培养基上，在30℃光照培养箱培养20-30d。

继代培养：选择小米粒大小的黄色有韧性的脱落下来的愈伤组织，用灭菌的镊子转移到继代培养基生长7-14d。

农杆菌的准备：挑取转有pCXUN-Cas9-OsphyA质粒的农杆菌EHA105原液20μL，接种于5ml含50mgL^-1链霉素和50mgL^-1卡那霉素的YEP(Sambrook，etal.分子克隆实验指南.2001)液体培养基中，28℃振荡过夜。取活化菌液500μL，接种于5ml含相同抗生素新鲜的YEP培养基中，继续培养至菌液在600nm波长处的吸光值(OD600)0.8-1.0。

侵染愈伤组织和共培养：将水稻愈伤组织从继代培养基中挑出放入离心管中，愈伤组织的数量没过50ml离心管锥形部位即可(选择淡黄圆润有韧性的愈伤组织)。取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心lmin，去上清。用含200μmolL^-1乙酰丁香酮(As)的30ml感菌液将收集的菌体制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min。倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无菌的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min。将愈伤组织置于共培养培养基上(上面垫上一层9cm无菌滤纸)，25℃暗培养60小时。

洗菌和抗生素筛选培养：将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无菌水清5次，每次不停的振荡5min。再用含500mgL^-1羧苄青霉素(car)的无菌水浸泡40-60min。最后置于无菌滤纸上沥干2h。第一轮筛选：将晾干的愈伤组织转入含250mgL^-1羧苄青霉素(car)和50mgL^-1潮霉素(Hyg)的选择培养基上进行第一次选择，30℃，光照培养14d；第二轮筛选：将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含250mgL^-1羧苄青霉素(car)和80mgL^-1潮霉素(Hyg)的选择培养基上，30℃，光照培养10d然后转移到组培室中培养4d。

抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入装有分化培养基的分化灌中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(30d左右，组培室培养条件为24-30℃，14h光/8h暗)，待苗长至5cm左右，放入生根培养基中壮苗。

转基因苗的锻炼和移栽：将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量无菌水(防止培养基长菌)，炼苗3d至7d左右，然后洗去琼脂，移栽到温室进行水培或土培生长、检测分别得到了突变体材料OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17。

实施例4突变体株系的扩繁及生理测定

1、扩繁：南京农业大学牌楼温网室进行分别对突变体材料OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17的扩繁，得到植株性状稳定遗传的材料。

2、生理测定：

1)分蘖数统计：

田间条件下设置小区实验，日本晴野生型水稻和突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)(种子用MS培养基发苗，一叶一心的苗于温室水培一个月左右后移栽)各种植六行，每行六株。分别种植在正常氮区(240kg N/公顷)和低氮区(0kg N/公顷)并进行田间管理(N以尿素形式施入)。定期观察水稻的生长情况，于成熟期统计野生型和突变体株系分蘖数，每个株系统计5棵苗。

2)生物量统计：

田间条件下设置小区实验，日本晴野生型水稻和突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)(种子用MS培养基发苗，一叶一心的苗于温室水培一个月左右后移栽)各种植六行，每行六株。分别种植在正常氮区(240kg N/公顷)和低氮区(0kg N/公顷)并进行田间管理(N以尿素形式施入)。定期观察水稻的生长情况，于成熟期统计野生型和突变体株系生物量，每个株系统计5棵苗。

3)水稻组织全氮含量测定：

(3.1.1)植物组织消解

将采集的水稻植株于105℃烘箱杀青30min，固定氮素所在位置不再转移，后调至70℃将植物组织彻底烘干水分待用；将样品剪碎或者用球磨仪粉碎，粉碎后的样品每个称取约0.05g于洗净的消煮管中，称取完毕后向管中加入1mL ddH₂O，再向管中加入5mL纯硫酸，混匀静置8h；将上述预处理好的消解液放入消煮炉，280℃消解，此时每支消煮管管口均放置一个干净的弯颈漏斗以供冷凝回流，待管内硫酸蒸汽充满管体后，消解10～15min，然后将消煮管拿下消煮炉，冷却片刻后向管中加入2～3mL 30％过氧化氢溶液，然后将消煮管再放入消煮炉，若气泡不再产生而管内溶液依旧不澄清，则拿下消煮管冷却后加入过氧化氢继续消解，直到溶液澄清为止，溶液澄清后再加入几滴过氧化氢溶液复煮，当管内再无气泡生成，则消解结束，拿下消煮管，室温冷却；向消煮管中加入ddH₂O，定容至100mL，混匀后静置8h，倒出上清液10mL以供测定时使用。

(3.1.2)测定用试剂配方：

(1)缓冲液

试剂名称	1L所需称取量
		磷酸氢二钠	35.8g
氢氧化钠	32.0g
		酒石酸钾钠	50.0g
蒸馏水	to 1000mL
		Brij-35 30％溶液	2mL

注：磷酸氢二钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠溶解完全定容至1000mL，混匀后加入Brij-35 30％溶液2mL，每周更新。

(2)水杨酸钠

试剂名称	1 L所需称取量
		水杨酸钠	40.0g
硝普纳	1.0g
		蒸馏水	to 1000mL

注：水杨酸钠溶于水后加入硝普纳，定容至1000mL，混匀，每周更新。

(3)次氯酸钠

试剂名称	1L所需称取量
		次氯酸钠(活性氯为5.25％)	30mL
蒸馏水	to 1000mL

注：次氯酸钠溶液现配现用，避光保存。

(4)4％硫酸

注：小心加入硫酸于水中，冷却后定容，可长期存放。

(5)氮标准溶液母液(N含量1000mg/L)

试剂名称	1L所需称取量
		硫酸铵	4.717g
蒸馏水	to 1000mL

注：上机用标线溶液需用4％硫酸配制，N标线浓度为0，5，10，15，20，25，30mg/L。

测定具体方法以仪器说明书为准。

(3.1.3)计算

植物组织总氮(N)含量(mg/g DW)＝C*V/m

其中，C：仪器测定出消化液中N含量；

V：消化液总体积(0.1L)；

m：称取组织干样质量；

3、实验结果：

3.1、低氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的分蘖数统计如下：

WT	8	7	7	10	7
						OsphyA-4	22	20	21	23	19
OsphyA-6	18	18	18	17	19
						OsphyA-17	19	19	19	18	19

3.2、正常氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的分蘖数统计如下：

WT	15	11	12	12	16
						OsphyA-4	16	18	15	17	16
OsphyA-6	16	15	16	16	15
						OsphyA-17	15	14	15	13	14

3.3、低氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的生物量统计(g)如下：

WT	7.59	8.33	7.60	9.81	8.33
						OsphyA-4	16.61	15.94	18.01	15.10	13.06
OsphyA-6	16.96	20.54	14.91	19.13	19.63
						OsphyA-17	17.26	19.66	18.93	19.87	18.93

3.4、正常氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的生物量统计(g)如下：

WT	22.17	22.49	22.17	22.74	21.28
						OsphyA-4	21.12	21.11	23.50	20.23	19.56
OsphyA-6	22.86	20.19	21.98	21.98	22.88
						OsphyA-17	21.69	21.40	22.78	21.40	19.73

3.5、低氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)每穗总氮量的统计(mg)如下：

WT	71.15	80.41	83.69	93.30	82.14
						OsphyA-4	153.23	153.37	159.17	156.60	147.04
OsphyA-6	147.87	164.71	132.33	165.67	141.93
						OsphyA-17	137.57	159.99	133.77	158.89	172.13

3.6、正常氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的每穗总氮量统计(mg)如下：

WT	168.74	176.37	172.72	183.09	177.93
						OsphyA-4	168.70	169.69	162.55	169.19	159.72
OsphyA-6	166.93	144.05	164.25	174.28	144.74
						OsphyA-17	171.79	178.83	183.30	188.63	175.71

3.7、低氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的单株产量统计(g)如下：

3.8、正常氮条件下，野生型(日本晴)与OsphyA突变体材料(OsphyA-4、OsphyA-6、OsphyA-17)的单株产量统计(g)如下：

WT	32.45	32.58	32.82	32.75	31.9
						OsphyA-4	31.52	31.59	32.48	32.91	31.51
OsphyA-6	31.96	33.21	33.55	32.5	32.68
						OsphyA-17	33.08	31.98	32.56	31.28	32.7

4、结果分析：

从图1可以看出，OsPHYA在根茎结合部有强烈的表达。

从图3可以看出，水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA的生物学功能，发现低氮条件下突变体比野生型分蘖能力更强。从图3、4、5、6可以看出，在低氮条件下，OsphyA突变后与野生型相比增加了水稻的分蘖数，而正常供氮条件下OsphyA突变体的分蘖数与野生型相比差异不大。

从图7-图12可以看出，在低氮条件下，OsphyA突变后与野生型相比增加了水稻的分蘖数，单株的生物量和总的氮含量，从而使水稻产量得到提高，而正常供氮条件下OsphyA突变体与野生型相比差异不大。通过转基因手段获得的OsPHYA突变体材料与野生型相比分蘖数平均增加147.1％(图5)。OsphyA突变体材料与野生型相比单株生物量平均增加111.7％(图7)，N含量平均增加85.6％(图9)，产量平均提高42.2％(图11)。分蘖是影响水稻最终产量的重要指标，有可能是由于OsphyA突变体中OsPHYA在地上地下部分配发生变化使水稻株型得到改善，从而使产量得到提高。

综上所述，本发明人提供的OsPHYA基因是首次在水稻中验证其生物学功能，发现它影响水稻分蘖发生。低氮条件下，在水稻中突变掉该基因可以增加水稻分蘖数量、生物量、氮素利用效率和最终水稻产量。

本发明中应用的OsPHYA基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，该基因除了可应用于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等，更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcttctt caagacctac t 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttattttgct ggagcagaag caag 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtaatca aggcagaag 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcatcaaca cttggcact 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaagggcag ggatttcg 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actggtggat gagggtggc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggtaatca aggcagaag 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcatcaaca cttggcact 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caacacccct gctatgtacg 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catcaccaga gtccaacaca a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtcaccgcc agctgaataa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccggtaggtt gcaagagact 20

<210> 13

<211> 3387

<212> DNA

<213> PHYA-CDs全长(Artificial Sequence)

<400> 13

atgtcttctt caagacctac tcaatgttcc agttcatcca gcaggacccg ccaaagctcc 60

cgggcaagga tattagcaca aacaactctt gatgctgaac tcaatgctga atatgaagaa 120

tatggcgact cctttgatta ctccaaattg gttgaagcac agagaactac tggacctgag 180

cagcaagctc gttctgagaa ggtcatagct tacttgcatc acattcagag agcaaagcta 240

atccaaccat ttggttgctt gttggccctt gatgagaaga ccttcaatgt tatagcgctc 300

agcgagaatg caccagagat gcttacaact gtcagccatg cagtgccaag tgttgatgat 360

cccccaaagc tacgcattgg caccaatgta tggtctcttt tcactgaccc aggtgccaca 420

gcactgcaga aggcactggg atttgctgat gtttccttgc tgaaccctat cctagttcaa 480

tgcaagacct caggcaagcc tttctatgcc attgttcatc gggcaactgg ttgtttggtg 540

gtagactttg agcctgtgaa acctacagaa tttccagcaa ctgccgctgg ggctttgcaa 600

tcttacaaac ttgctgccaa ggcaatctct aagatccagt cactgccagg tggaagcatg 660

gaggtgctat gcaatacggt ggtcaaggaa ctctttgacc tcacaggata tgatagagtt 720

atggcttata agttccatga agatgaccat ggtgaagtct ttgctgagat cacaaagcct 780

ggtcttgaac cttatcttgg cctgcattat ccagctactg atatccctca ggcagccagg 840

tttcttttca tgaagaacaa agtccggatg atttgtgatt gccgtgcaag atctatcaag 900

attatcgaag atgagtcgct ccacttggat attagcttat gtggttcaac actgagggca 960

ccacacagtt gtcatcttca gtatatggag aacatgaact cgattgcatc ccttgtcatg 1020

gctgttgtgg ttaatgagaa tgaggatgat gatgaagttg gggctgatca acctgcacaa 1080

cagcagaaga ggaagaaact atggggactc cttgtttgcc accatgagag ccccagatat 1140

gttcctttcc cattgcggta tgcctgtgag ttcttagcac aagtgtttgc tgtccatgtt 1200

aacaaggagt ttgaattaga gaggcaagta cgcgagaaaa gcatattgag gatgcaaaca 1260

atgctctctg acatgcttct cagggaatcc tctcctctga gtatagtatc agggactccc 1320

aacatcatgg accttgtgaa atgtgatggt gctgctcttt tgtatggggg aaaagtgtgg 1380

cggctacaga atgctccaac tgagtctcag atacgtgata ttgccttctg gctgtcagat 1440

gtccacaggg attccactgg cctgagtact gatagcctac atgatgctgg atatccagga 1500

gctgctgctc ttggtgatat gatttgtgga atggcagtag ctaaaataaa ttccaaggat 1560

atcctgttct ggttcaggtc acatacagct gctgaaatca gatggggagg tgcaaaacat 1620

gatccatcag acaaggatga cagcagaaga atgcacccta ggctgtcctt caaggcattc 1680

cttgaggttg tcaagatgaa gagcttgcct tggaatgact atgagatgga tgctattcac 1740

tcattacaac ttatacttag agggacactg aatgatgaca tcaagccaac aagggccgct 1800

agtttagata atcaggttgg tgatctcaag cttgatgggc ttgctgaatt gcaggcagtt 1860

acaagtgaaa tggttcgtct catggaaaca gcaactgtcc caatcttggc tgtagatagc 1920

aatggattgg tcaatggatg gaatcagaag gttgctgagt tgacagggtt gagagtagat 1980

gaggctattg gaagacacat acttaccgtt gtagaggaat cttctgtacc agttgtccag 2040

aggatgctgt atttagcttt gcaaggcaaa gaagagaagg aagtgaaatt tgaggtgaaa 2100

actcatggct ccaagagaga tgatggccct gttatcttgg ttgtgaatgc ctgtgccagc 2160

cgggaccttc acgaccatgt tgttggtgtg tgctttgttg cacaagatat gactgttcat 2220

aagttggtca tggacaaatt tactcgggtt gagggagact acaaagcaat tattcacaat 2280

ccaagcccgc ttattcctcc catatttggt gctgacgaat ttggatggtg ctctgagtgg 2340

aatgctgcca tgacgaaatt gaccgggtgg catagagatg aggtgatcaa taagatgctt 2400

cttggtgagg tgtttgatag caccaacgcc tcctgtcttg tgaagaataa agatgcattt 2460

gtaagtctct gcattcttat caacagtgca ttagctggtg atgaaacaga aaaggctcca 2520

ttcagcttct tcgaccggaa cgggaagtat atcgagtgcc ttctttctgt taacagaaaa 2580

gtaaatgcag atggtgtcat cactggagta ttttgtttca ttcaagttcc tagtcatgag 2640

ctgcaacatg cactacatgt gcagcaagcc tcacagcaga atgcactaac aaagttgaaa 2700

gcttactcct acatgagaca tgcaatcaac aaccctctct caggtatgct ttactctagg 2760

aaagcactga agaacacagg tctgaatgaa gagcagatga aggaggtcaa tgttgcagat 2820

agttgtcacc gccagctgaa taaaatactt tctgacttgg atcaagatag cgtcatgaac 2880

aagtctagtt gcttggattt ggagatggtt gagtttgtat tgcaagatgt gtttgtggct 2940

gctgtaagtc aagtactcat aacttgccag ggaaaaggga ttagagtctc ttgcaaccta 3000

ccggagagat atatgaagca aacagtctac ggggatggtg ttcgactaca gcagattctc 3060

tctgacttcc tattcgtctc agtgaagttc tctcctgttg ggggttctgt tgagatctct 3120

tgtagcctga ccaagaacag cattggggaa aaccttcatc tcatagacct agaacttagg 3180

atcaagcacc agggcaaagg agtcccagca gatctgctgt cacaaatgta cgaggatgac 3240

aataaggagc agtcggatga aggcatgagt cttgcggttt ctagaaacct gctgaggctc 3300

atgaatggcg atgtccgaca tatgagggaa gctggcatgt caaccttcat cctcagcgtc 3360

gaacttgctt ctgctccagc aaaataa 3387

Claims

1.敲除水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA的试剂在低氮条件下提高水稻对氮肥的利用率或增加分蘖数或增加水稻产量方面的应用，所述水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA序列如SEQID NO. 13所示。

2.一种获得高氮肥利用率同时具有高产量水稻的方法，其特征在于，所述方法包括在低氮条件下敲除水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA，所述水稻光敏色素蛋白基因OsPHYA序列如SEQ ID NO. 13所示。

3.根据权利要求2所述的获得高氮肥利用率同时具有高产量水稻的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

1）OsPHYA基因的cDNA全长的获得；

2）突变体材料pCXUN-Cas9-OsPHYA的构建；

3）转基因植株的获得。

4.根据权利要求3所述的获得高氮肥利用率同时具有高产量水稻的方法，其特征在于，步骤2）中突变体材料pCXUN-Cas9-OsPHYA的构建步骤如下：在OsPHYA基因的外显子区域设计spacer序列，OsPHYA以U3启动子序列为模板转录sgRNA，将包含有sgRNA的水稻U3启动子连接到已被KpnⅠ单酶切的线性化的pCXUN-Cas9 载体中即得。