CN101386865A

CN101386865A - 基因OsAAT2在控制水稻谷粒品质中的用途

Info

Publication number: CN101386865A
Application number: CNA2008101970298A
Authority: CN
Inventors: 练兴明; 张启发; 周莹
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2009-03-18

Abstract

本发明公开了一种基因OsAAT2在控制水稻谷粒品质中的用途，利用OsAAT2的基因，进行转基因超量表达，将该基因转入水稻品种中，得到编码胞质中天冬氨酸转氨酶的基因的DNA序列，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列。得到OsAAT2基因的全长基因组序列。该基因包括12个外显子和11个内含子。通过PCR方法，扩增出OsAAT2基因的全长编码区，连接到超量表达载体pCAMBIA1301s上。再进行遗传转化，在水稻品种中，超量表达，在转基因T₂代植株中发现，阳性植株种子中的氨基酸水平和蛋白质含量都显著高于阴性植株。发现转基因阳性植株的种子中的氨基酸总含量为115.36mg/g，比其对应的阴性植株的含量提高了12.0％；转基因阳性植株的种子中的蛋白质含量为74.56mg/g，比其对应的阴性植株的含量提高了21.1％。

Description

基因OsAAT2在控制水稻谷粒品质中的用途

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种控制水稻谷粒品质的基因OsAAT2基因的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国主要粮食作物之一，稻米蛋白是人们膳食中重要的蛋白质来源。随着人民生活水平的不断提高，稻米的营养品质日益受到人们的关注。水稻谷粒中的氨基酸水平和蛋白质含量是决定水稻品质的重要性状之一。通过转基因的方法，在水稻品种中花11(来自与中国农业科学院作物科学研究所的商业品种)中超量表达编码胞质中天冬氨酸转氨酶OsAAT2基因，发现水稻谷粒中，氨基酸水平和蛋白质含量都显著提高。因此，在水稻中超量表达OsAAT2对于提高水稻的营养品质具有重要的意义。

种子里的氨基酸含量直接决定了此品种的品质优劣。水稻是主要的粮食作物，也是人类补充蛋白质的重要来源。在世界人口持续增长的情况下，提高水稻种子中的氨基酸含量，对于缓解氨基酸供给方面的压力有着十分重要的作用(Wang等，ActaAgronomica Sinica，2005，31:603-607)。现阶段，转基因技术开始运用于遗传育种中，并且获得了一些可喜的成果。Shaul和Galili报导，在转基因烟草中发现了苏氨酸的积累(Shaul和Galili，Plant Physiol，1992，100:1157-1163)。Falco等人在转基因大豆中提高了赖氨酸的含量(Falco等，Bio/Technology，1995，13:577-582)。天冬氨酸转氨酶是氮代谢中的关键酶，对氮代谢起作关键性作用，超量表达编码这个酶的基因，很可能会提高种子里氨基酸的水平和蛋白质的含量(Murooka等，J Biosci Bioeng，2002，94:225-230)。2002年Murooka等人在拟南芥中超量表达了来源于大豆的AAT基因，使得拟南芥的种子中游离氨基酸的含量显著上升(Murooka等，J Biosci Bioeng，2002，94:225-230)。

天冬氨酸转氨酶是氮代谢途径中一个重要的催化酶(Givan，The biochemistryof plants，1980，329-357)，在植物不同部位和生长时期，天冬氨酸转氨酶都发挥着重要的功能。在很多模式植物中，都发现了编码天冬氨酸转氨酶同工酶的基因家族。并且这些同工酶在植物细胞中很多部位(例如胞质，线粒体，叶绿体，质体和乙醛酸体)中都有表达。在拟南芥中AAT基因家族有5个成员(Coruzzi and Last，Biochemistry and Molecular Biology of Plants，2000，358-410；Coruzzi，The Arabidopsis book，2003，1-17；Wilkie等，Plant Mol Biol 1995，27:1227-1233)，而在水稻中则有3个成员分别编码位于叶绿体，胞质和线粒体中的天冬氨酸转氨酶的同工酶(Song等，DNA Res，1996，3:303-310)。有报导表明，在小麦中定位在叶绿体和胞质中的天冬氨酸转氨酶对于该酶的活性起决定性作用(Marcin和Andrzej，J Appl Genet，2004，45:411-417)。

本发明在水稻品种中花11中，超量表达了编码胞质中天冬氨酸转氨酶的OsAAT2基因，提高了水稻米粉中氨基酸含量和蛋白质含量。为水稻的品质育种提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供了一种控制水稻谷粒品质的基因OsAAT2的应用。

基因OsAAT1在控制水稻谷粒品质中的用途，在水稻中超量表达编码胞质中天冬氨酸转氨酶的OsAAT2基因后，发现转基因阳性植株的种子中的氨基酸总含量为115.36mg/g，比其对应的阴性植株的含量(103.00mg/g)提高了12.0％；转基因阳性植株的种子中的蛋白质含量为74.56mg/g，比其对应的阴性植株的含量(61.57mg/g)提高了21.1％。

本发明是这样实现的：

本发明利用OsAAT2的基因组片段作为应用基因，进行转基因超量表达验证，将该基因转入水稻品种中花11，转基因植株表现出在谷粒中氨基酸和蛋白质含量极显著提高的现象。

天冬氨酸转氨酶能催化天冬氨酸生成天冬酰胺，对植物氮代谢有重要意义。申请人在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上输入“Aspartate Aminotransferase”和“rice”，得到序列号为D14673的一段编码胞质中天冬氨酸转氨酶的基因的DNA序列，在KOME网站上，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列。再到NCBI网站上，比对水稻全基因组序列，得到OsAAT2基因的全长基因组序列。OsAAT2全长基因组序列为4814bp，全长cDNA为1888bp，编码460个氨基酸。该基因包括12个外显子和11个内含子。本发明是通过PCR方法，扩增出OsAAT2基因的全长编码区，连接到超量表达载体pCAMBIA1301s上。再进行遗传转化，在水稻品种中花11中，超量表达这个基因，得到超量表达植株。在转基因T₂代植株中发现，阳性植株种子中的氨基酸水平和蛋白质含量都显著高于阴性植株。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种控制水稻谷粒品质的基因OsAAT2的应用。申请人在水稻品种中花11中，超量表达编码胞质中天冬氨酸转氨酶的OsAAT2基因后，发现转基因阳性植株的种子中的氨基酸总含量为115.36mg/g，比其对应的阴性植株的含量(103.00mg/g)提高了12.0％；转基因阳性植株的种子中的蛋白质含量为74.56mg/g，比其对应的阴性植株的含量(61.57mg/g)提高了21.1％。

(2)本发明首次在水稻中超量表达一个影响水稻谷粒品质的基因OsAAT2。为水稻培育优质品种提供了新的思路，也为其它作物利用同源基因法提高品质提供了理论支持。

(3)本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物的营养代谢研究提供支持。

附图说明

图1为一种控制水稻谷粒品质的基因OsAAT2的应用技术路线示意图。

图2载体pCAMBIA1301s结构示意图。图2a是载体pCAMBIA1301结构示意图；图2b是在多克隆位点中，插入片段的结构示意图；图2c是改造后的载体pCAMBIA1301s的结构示意图。

图3超表达转化载体的结构示意图。可见OsAAT2基因被35S启动子超表达。

具体实施方式

天冬氨酸转氨酶能催化天冬氨酸生成天冬酰胺，对植物氮代谢有重要意义。根据图1的技术路线，申请人在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上输入“AspartateAminotransferase”和“rice”，得到序列号为D14673的一段编码胞质中天冬氨酸转氨酶的基因的DNA序列，在KOME网站上，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列。再到NCBI网站上，比对水稻全基因组序列，得到OsAAT2基因的全长基因组序列。OsAAT2全长基因组序列为4814bp，全长cDNA为1888bp，编码460个氨基酸。该基因包括12个外显子和11个内含子。本发明是通过PCR方法，以水稻品种中花11的总DNA为模板，扩增得到包括了全长OsAAT2基因编码区4588bp的序列，把该片段连接到超表达载体质粒pCAMBIA1301s(本实验改造的载体，能用于基因的超表达，后面详细说明了改造过程)上，用农杆菌(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供)介导的方法，在水稻品种中花11中超量表达OsAAT2基因。观察转基因植株后代(T₂代)，发现转基因植株表现出期望的性状变化，即种子里氨基酸水平和蛋白质含量显著上升。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离OsAAT2基因，遗传转化，以及氨基酸水平和蛋白质含量的测定方法和该基因在水稻中的表达模式。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：OsAAT2基因确定和序列的获得

在NCBI网站上输入“aspartate aminotransferase”和“rice”，搜索序列。根据NCBI网站上公布的序列，得到一段编码胞质中天冬氨酸转氨酶的基因OsAAT2的DNA序列。在日本KOME网站上，根据同源匹配，找到此基因的全长cDNA序列。再到NCBI网站上，比对水稻全基因组序列，从而得到OsAAT2基因的全长基因组序列。

实施例2：超量表达转化载体的构建

根据基因OsAAT2的已知全长序列设计引物，以水稻品种中花11的总DNA为模板，扩增得到包括OsAAT2基因全长编码区的4588bp片段。我们扩增OsAAT2基因时，在引物上分别添加了SacI和SalI的酶切接头，因此扩增得到的片段可以用限制性核酸内切酶SacI和SalI进行酶切，然后连接到超表达载体pCAMBIA1301s上(本实验改造的载体，能用于基因的超表达，载体图参见图2)，然后再用表3所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上。

超表达载体pCAMBIA1301s是本实验在载体pCAMBIA1301(来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒)的基础上改造得到的。首先把载体pCAMBIA1301，用多克隆位点最外端的两个限制性核酸内切酶HindIII和EcoRI进行酶切，去掉多克隆位点，再连接上一段包含CaMV35S启动子、多克隆位点和polyA终止子的序列，从而得到了可以运用于基因超量表达的新载体pCAMBIA1301s。此载体包含GUS的报告基因和潮霉素的筛选基因。

表1 用于本发明的自行设计的引物

实施例3：超量表达OsAAT2的转基因实验

包含编码胞质中天冬氨酸转氨酶的OsAAT2基因的片段连接到载体pCAMBIA1301s上后，采用转基因的方法，得到转基因的水稻小植株，本发明的转基因具体步骤如下：

将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供)导水稻遗传转化体系导入到水稻品种中花11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6:271-282)基础上进行优化。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃) 28.3克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66克

将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

碘化钾(KI) 0.08克

硼酸(H₃BO₃) 0.16克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15克

将上述试剂在20-25摄氏度下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid) 0.1克

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1克

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1克

甘氨酸(Glycine) 0.2克

肌醇(Inositol) 10克

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5克

硝酸钾 19.0克

磷酸二氢钾 1.7克

硫酸镁 3.7克

氯化钙 4.4克

将上述试剂在20-25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 2.23克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.86克

硼酸(H₃BO₃) 0.62克

碘化钾(KI) 0.083克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2_H2O) 0.025克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.0025克

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于20-25℃温度下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，20-25℃温度保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。12)AS贮存液的配制：

秤取AS0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，20-25℃温度保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同) 100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同) 10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的) 2.5毫升

脯氨酸(Proline) 0.3克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

2，4-D贮存液 2.0毫升

脯氨酸 0.5克

CH 0.6克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.15克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5毫升

N6mix母液(100X) 1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.75毫升

CH 0.2克

蔗糖 5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5毫升

N6mix母液(100X) 0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5毫升

维生素贮存液(100X) 1毫升

2，4-D贮存液 0.2毫升

CH 0.08克

蔗糖 2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

2，4-D贮存液 0.625毫升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25毫升

N6mix母液(100X) 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5毫升

维生素贮存液(100X) 2.5毫升

6-BA贮存液 0.5毫升

KT贮存液 0.5毫升

NAA贮存液 50微升

IAA贮存液 50微升

CH 0.15克

蔗糖 7.5克

琼脂粉 1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100毫升

N6mix母液(100X) 10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10毫升

维生素贮存液(100X) 10毫升

6-BA贮存液 2毫升

KT贮存液 2毫升

NAA贮存液 0.2毫升

IAA贮存液 0.2毫升

CH 1克

蔗糖 30克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50毫升

MSmix母液(100X) 5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5毫升

维生素贮存液(100X) 5毫升

蔗糖 20克

Phytagel 3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供)

3.1 愈伤诱导

1)将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2 愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3 预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4 农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5 农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6 愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7 分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8 生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9 移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

转化粳稻品种中花11，得到转基因单株T₀代植株。用southern检测拷贝数，用northern检测基因在植物体内的表达量。得到单拷贝、超表达的植株，并且进行繁殖，得到T₁和T₂代转基因植株。

实施例4：超表达OsAAT1的转基因植株的功能鉴定

测定T₁代转基因植株种子里氨基酸水平和蛋白质含量，发现T₁代转基因植株和野生型植株相比，表现出期望的表型变化，即种子里氨基酸水平和蛋白质含量显著高于对照。同时测定了T₂代转基因植株种子里氨基酸水平和蛋白质含量，发现T₂代转基因阳性植株和其对应的阴性植株相比，也表现出期望的表型变化。这同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来改良水稻品质。

1、氨基酸含量的测定方法

样品预处理方法采用的是盐酸水解法，其步骤如下：

1.米粉必须粉碎60-80目筛，以保证取样均匀和水解效果。

2.称样量控制50-100毫克，将样品送入水解管底部，称量并记录。天平要求为1/10000天平。

3.用可调定量加液器向已装有样品的水解管中加入6-8毫升的6mol/L的盐酸，注意先加入0.5毫升左右浸湿。

4.抽真空减压，使丁烷喷灯能灼烧封口。

5. 110℃烘箱中水解22小时。

6.水解管中液体摇匀，滤纸(11cm*11cm)过滤于50毫升容量瓶中并用双蒸水定容至50毫升。

此步骤一定要注意润洗水解管三次以上，并每次滤纸上的水已过滤至容量瓶后再加水过滤，保证水解管及滤纸上不残留氨基酸。

7.摇匀后取1毫升于塑料离心管中，冻干机真空浓缩4-6小时至近干燥状态。

此步骤也可用其它仪器代替，只需要达到真空干燥就行。

8.加入1毫升0.02mol/L的盐酸于离心管中震荡均匀。

9.14000rpm/min离心15分钟，吸上清液0.8毫升于自动进样瓶，氨基酸测定仪(L-8800HITACHI)上机测定，机测结果为ml。

计算公式：1mg米粉氨基酸含量＝ml/20*1000*50ng＝2.5mlμg

2、蛋白质含量的测定方法

取100mg左右已过100目筛的精米粉入指形管中，置105℃烘箱中烘一小时后置干燥器中冷却30分钟，再将指形管中的样品送入消化管中，利用差减法得出样品质量，加入0.1克左右固体催化剂(将硫酸钾、硫酸铜、硒粉按质量比100:10:1混合磨匀过80目筛)、1mL蒸馏水及2mL浓硫酸放置一夜炭化，第2天置红外消化炉(Digi PREP HT SCP)380℃消化80min，直到消化液清亮，将消化液NH4浓度稀释至1mg/L-10mg/L的浓度范围，取5mL于流动分析仪(Integral Futura vers ionIIALLIANCE.)进样管，上机测试，将测定的NH4浓度折算成N含量，再乘以系数5.95折算成该样品蛋白质含量(Sotelo等，Cereal Chem，1990，67(2):209-212)。

表2 本发明克隆的OsAAT2基因转基因T2单株的表现

注释^**表示T₂代阳性和阴性植株性状间差异t测验的概率值，在1％水平显著差异。

Claims

1、一种基因OsAAT2在控制水稻谷粒品质中的用途。