CN101508995A - 一种基因OsPHR2的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因OsPHR2的用途，用于在植物中模拟磷饥饿信号。基因OsPHR2能用于提高植物对磷酸盐的吸收速率。本发明以OsPHR2的cDNA片段作为目标基因、以35SpCAMBIA1301s作为载体，进行转基因超量表达，将该基因转入水稻中。本发明的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物的磷元素代谢研究提供支持。

Description

一种基因OsPHR2的用途
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种磷代谢调控因子OsPHR2的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是我国主要粮食作物之一。磷是植物生长所必需大量营养元素之一，磷元素对水稻优质高产具有重要意义。磷是植物生长发育的大量必需元素，在许多信号转导途径中也起到了关键作用，研究表明磷胁迫信号在植物中有特异的调控途径(Rubio et al.，2001；Hou et al.，2005)。
由于磷素(PO43-，HPO42-，H2PO4-)在酸性与碱性土壤中的强烈固定作用，使得土壤中可以被植物吸收利用的有效磷浓度要大大低于其它大量元素，在大多数生态系统中，土壤有效磷<10υM，这一浓度要比植物组织器官中的有效磷浓度(5-20mM)低几个数量级(Raghothama，1999)。植物在长期的进化过程中形成了各种适应磷胁迫的机制，包括根系发生与根构型适应，生理代谢适应以及与菌类共生等等，以此来提高对可溶性磷的吸收和利用效率以及对固定态磷的吸收能力。但在作物中(包括水稻)，这种磷胁迫适应机制的分子途径还了解不多。
拟南芥中AtPHR1基因和衣藻PSR1基因已被证明是磷饥饿信号的核心调控因子，它们在进化上同源，都属于MYB-CC基因家族。目前水稻中参与磷信号调控的基因还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基因OsPHR2的用途，该基因OsPHR2能在模拟磷饥饿信号中发挥作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因OsPHR2的用途：用于在植物中模拟磷饥饿信号。
作为本发明的基因OsPHR2的用途的改进：用于提高对磷酸盐的吸收速率。
作为本发明的基因OsPHR2的用途的进一步改进：植物为水稻。
作为本发明的基因OsPHR2的用途的进一步改进，其通过如下方法实现：以OsPHR2的cDNA片段作为目标基因、以35SpCAMBIA1301s作为载体，进行转基因超量表达，将该基因转入水稻中。
本发明的发明人为了深入了解水稻中磷饥饿信号的调控途径，研究水稻PHR1同源基因的功能，首先根据序列相似性比对分析，从水稻中克隆了拟南芥AtPHR1的同源基因OsPHR2。
发明人通过转基因的方法，在水稻品种日本晴中超量表达编码磷代谢调控因子的OsPHR2基因，发现在正常营养液培养条件下，转基因植株对磷酸盐的最大吸收速率相对于野生型植株提高了1.57倍，转基因植株地上部中的有效磷水平和全磷水平都显著高于野生型植株：转基因植株中地上部的有效磷浓度为4.26mg Pi/gFW，是野生型植株的4.0倍；转基因植株中地上部的全磷浓度为13.92mg P/g DW，是野生型植株的1.9倍。
由于超量表达OsPHR2基因的转基因水稻对磷酸盐的最大吸收速率相对于野生型植株显著提高，且有效磷和全磷浓度都显著提高；因此，在水稻中超量表达OsPHR2具有模拟磷饥饿信号的作用。本发明能为水稻的品质育种提供新的思路。
本发明是这样实现的：本发明利用OsPHR2的cDNA片段作为目标基因，进行转基因超量表达，将该基因转入水稻品种日本晴，转基因植株表现出对磷酸盐的最大吸收速率，以及有效磷水平和全磷水平极显著提高的现象。
磷代谢调控因子负责植物体内磷信号调控，对植物磷元素代谢有重要意义。发明人用拟南芥AtPHR1(At4g28610)蛋白序列做blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析，在水稻基因组中发现了AtPHR1的同源基因AK100065，命名为OsPHR2。根据GeneBank公布的全长cDNA序列设计引物，以水稻日本晴叶的cDNA为模板，扩增得到OsPHR2的全长cDNA。经测序确定其实际的cDNA序列，并与网上公布的cDNA序列和基因组序列用DNAstar的MegAlign软件比对分析，以确定其内含子和外显子的结构。
OsPHR2全长基因组序列为5603bp，全长cDNA为1281bp，编码426个氨基酸。该基因包括9个外显子，8个内含子。本发明是通过PCR方法，从日本晴cDNA里扩增出OsPHR2基因的全长cDNA，连接到超量表达载体35SpCAMBIA1301上。再进行遗传转化，在水稻品种日本晴中，超量表达这个基因，得到超量表达植株。在转基因T2代植株中发现，转基因植株中的有效磷和全磷水平都显著高于野生型植株。
本发明的优点在于：
(1)本发明证明了一种磷代谢调控基因OsPHR2的具体作用。申请人在水稻品种日本晴中，超量表达编码磷代谢调控因子的OsPHR2基因后，发现正常营养液培养条件下，转基因植株对磷酸盐最大吸收速率相对于野生型提高1.57倍，地上部中的有效磷水平和全磷水平都显著高于野生型植株：转基因植株中地上部的有效磷浓度为4.26mg Pi/g FW，是野生型植株的4.0倍；转基因植株中地上部的全磷浓度为13.92mg P/g DW，是野生型植株的1.9倍。
(2)本发明首次在水稻中超量表达一个水稻磷代谢调控基因OsPHR2，为水稻遗传育种或选育磷高效的基因型提供了新的思路。
(3)本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物的磷元素代谢研究提供支持。
附图说明
图1为一种编码磷代谢调控因子的基因OsPHR2的应用技术路线示意图。
图2为载体35SpCAMBIA1301结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步具体描述：
磷代谢调控因子负责协调植物体内磷代谢网络，对植物磷元素代谢有重要意义。申请人用拟南芥AtPHR1(At4g28610)蛋白序列做blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析，在水稻基因组中发现了AtPHR1的同源基因AK100065，命名为OsPHR2。根据GeneBank公布的全长cDNA序列设计引物，以水稻日本晴叶的cDNA为模板，扩增得到OsPHR2的全长cDNA。经测序确定其实际的cDNA序列，并与网上公布的cDNA序列和基因组序列用DNAstar的MegAlign软件比对分析，以确定其内含子和外显子的结构。OsPHR2全长基因组序列为5603bp，全长cDNA为1281bp，编码426个氨基酸。该基因包括9个外显子，8个内含子。
本发明是通过PCR方法，以水稻品种日本晴的cDNA为模板，扩增得到包括了全长OsPHR2基因编码区1281bp的序列，把该片段连接到超表达载体质粒35SpCAMBIA1301(本实验改造的载体，能用于基因的超表达，后面详细说明了改造过程)。用农杆菌(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供，参见：New Agrobacterium helper plasmids for gene transferto plants，1993，Transgenic Res 2：208-218)介导的方法，在水稻品种日本晴中超量表达OsPHR2基因。观察转基因植株后代(T2代)，发现转基因植株表现出对磷酸盐最大吸收速率以及植株内有效磷和全磷水平显著上升。
以下实施例进一步定义本发明，并描述了分离OsPHR2基因，遗传转化，以及磷酸盐最大吸收速率测定方法，有效磷与全磷含量的测定方法。根据以下的描述和这些实施事例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1、OsPHR2基因确定和序列的获得
申请人用拟南芥AtPHR1(At4g28610)蛋白序列做blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析，在水稻基因组中发现了AtPHR1的同源基因AK100065，命名为OsPHR2。根据GeneBank公布的全长cDNA序列设计引物，以水稻日本晴叶的cDNA为模板，扩增得到OsPHR2的全长cDNA。经测序确定其实际的cDNA序列，并与网上公布的cDNA序列和基因组序列用DNAstar的MegAlign软件比对分析，以确定其内含子和外显子的结构。
实施例2、超量表达转化载体的构建
根据基因OsPHR2的全长序列设计引物(见表1)，以水稻品种日本晴的cDNA为模板，扩增得到包括OsPHR2基因全长编码区的1281bp片段。申请人扩增OsPHR2基因后，与pUCm-T连接，测序确定序列正确后继续以下操作。OsPHR2-T用KpnI、SalI双酶切，连入用相应酶切的35SpCAMBIA1301s中(本实验改造的载体，能用于基因的超表达，载体图参见图2)，酶切检测正确后备用。
超表达载体35SpCAMBIA1301是本实验在载体pCAMBIA1301(来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒)的基础上改造得到的。首先把CaMV 35S启动子亚克隆到EcoRI和SacI之间，再将poly(A)插入到HindIII和PstI之间。此载体最终命名为35SpCAMBIA1301，包含GUS的报告基因和潮霉素的筛选基因。
表1、用于本发明的自行设计的引物
 
名称 具体内容
左端引物(5’-3’) ATGGAGAGAATAAGCACCAATCAGC(SEQ ID NO：1)
右端引物(5’-3’) AGACCCTCATCACATCCTCATTATC(SEQ ID NO：2)
扩增所得片段大小(bp) 1281
用途 OsPHR2基因的全长编码区的扩增
实施例3、超量表达OsPHR2的转基因实验
包含编码磷代谢调控因子的OsPHR2基因的片段连接到载体35SpCAMBIA1301上后，采用农杆菌介导的转基因的方法，得到转基因的水稻植株，本发明的转基因具体步骤如下：
将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供，参见：New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants，1993，Transgenic Res2：208-218)介导水稻遗传转化体系导入到水稻品种日本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(参见：Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)基础上进行优化。
本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：
(1)试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)
(2)溶液配方
1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：
硝酸钾(KNO3)                28.3克
磷酸二氢钾(KH2PO4)          4.0克
硫酸铵((NH4)2SO4)           4.63克
硫酸镁(MgSO4·7H2O)         1.85克
氯化钙(CaCl2·2H2O)         1.66克
将上述试剂逐一溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。
2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制
碘化钾(KI)                    0.08克
硼酸(H3BO3)                    0.16克
硫酸锰(MnSO4·4H2O)            0.44克
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)            0.15克
将上述试剂在20-25摄氏度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)
将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78克FeSO4·7H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)
烟酸(Nicotinic acid)          0.1克
维生素B1(Thiamine HCl)        0.1克
维生素B6(Pyridoxine HCl)      0.1克
甘氨酸(Glycine)               0.2克
肌醇(Inositol)                10克
加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)
硝酸铵(NH4NO3)                16.5克
硝酸钾                        19.0克
磷酸二氢钾                    1.7克
硫酸镁                        3.7克
氯化钙                        4.4克
将上述试剂在20-25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)
硫酸锰(MnSO4·4H2O)           2.23克
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)           0.86克
硼酸(H3BO3)                   0.62克
碘化钾(KI)                    0.083克
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)          0.025克
硫酸铜(CuSO4·5H2O)         0.0025克
氯化钴(CoCl2·6H2O)         0.0025克
将上述试剂在20-25℃温度下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。
7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取2，4-D100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于20-25℃温度下保存。
8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，20-25℃温度保存。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取NAA100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：
秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：
秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，20-25℃温度保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)      100毫升
N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)     10毫升
Fe2+EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)10毫升
维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)   10毫升
2，4-D贮存液(取上述制备好的)                   2.5毫升
脯氨酸(Proline)                               0.3克
CH                                         0.6克
蔗糖                                       30克
Phytagel                                   3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
2)继代培养基
N6max母液(10X)                              100毫升
N6mix母液(100X)                             10毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                        10毫升
维生素贮存液(100X)                          10毫升
2，4-D贮存液                                2.0毫升
脯氨酸                                      0.5克
CH                                          0.6克
蔗糖                                        30克
Phytagel                                    3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
3)预培养基
N6max母液(10X)                              12.5毫升
N6mix母液(100X)                             1.25毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                        2.5毫升
维生素贮存液(100X)                          2.5毫升
2，4-D贮存液                                0.75毫升
CH                                          0.15克
蔗糖                                        5克
琼脂粉                                      1.75克
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X)                12.5毫升
N6mix母液(100X)               1.25毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)          2.5毫升
维生素贮存液(100X)            2.5毫升
2，4-D贮存液                  0.75毫升
CH                            0.2克
蔗糖                          5克
琼脂粉                        1.75克
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X)                 5毫升
N6mix母液(100X)                0.5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)           0.5毫升
维生素贮存液(100X)             1毫升
2，4-D贮存液                   0.2毫升
CH                             0.08克
蔗糖                           2克
加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。
使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(10X)                  25毫升
N6mix母液(100X)                 2.5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)            2.5毫升
维生素贮存液(100X)              2.5毫升
2，4-D贮存液                       0.625毫升
CH                                 0.15克
蔗糖                               7.5克
琼脂粉                             1.75克
加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X)                      25毫升
N6mix母液(100X)                     2.5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                2.5毫升
维生素贮存液(100X)                  2.5毫升
6-BA贮存液                          0.5毫升
KT贮存液                            0.5毫升
NAA贮存液                           50微升
IAA贮存液                           50微升
CH                                  0.15克
蔗糖                                7.5克
琼脂粉                              1.75克
加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。
使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。
8)分化培养基
N6max母液(10X)                       100毫升
N6mix母液(100X)                      10毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                 10毫升
维生素贮存液(100X)                   10毫升
6-BA贮存液                           2毫升
KT贮存液                           2毫升
NAA贮存液                          0.2毫升
IAA贮存液                          0.2毫升
CH                                 1克
蔗糖                               30克
Phytagel                           3克
加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(10X)                      50毫升
MSmix母液(100X)                     5毫升
Fe2+EDTA贮存液(100X)                5毫升
维生素贮存液(100X)                  5毫升
蔗糖                                20克
Phytagel                            3克
加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤(EHA105由澳大利亚CAMBIA实验室提供)
3.1 愈伤诱导
1)将成熟的日本晴水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；
2)用灭菌水洗种子4-5次；
3)将种子放在诱导培养基上；
4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
3.2 愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.3 预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.4 农杆菌培养
1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；
2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
3.5 农杆菌侵染
1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；
2)调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；
3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
3.6 愈伤洗涤和选择培养
1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
2)浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；
3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。
3.7 分化
1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；
2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
3.8 生根
1)剪掉分化时产生的根；
然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
3.9 移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
转化粳稻品种日本晴，得到转基因单株T0代植株。用southern检测拷贝数，用northern检测基因在植物体内的表达量。在利用GUS染色的方法找到纯合植株，最终得到单拷贝、超表达的纯合植株，并且进行繁殖，得到T1和T2代转基因植株。
实施例4、超表达OsPHR2的转基因植株的功能鉴定
测定了T2代转基因植株对磷酸盐的最大吸收速率，植株里有效磷浓度和全磷浓度，发现T2代转基因植株和其对应的野生型植株相比，转基因植株对磷酸盐的最大吸收速率，有效磷浓度和全磷浓度显著高于野生型对照。这同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来大大提高对磷酸盐的累积。
1.磷吸收试验测定方法
准备一些容积一升左右的小钵(不透光)配套的盖子.每钵四棵苗子.大约在出苗后生长40-50天左右大小的苗子(根据自己的实验材料，要达到一定的根量.通过调节根生物量，开始时的磷浓度，溶液体积这些因素使得植株能在4-5个小时将小钵溶液中的磷基本耗尽)
苗子开始可以先在大的面包盒中培养，一个星期换一次营养液.实验开始的前一周转到小钵中，每天换一次营养液.实验的前一天换成无磷的营养培养一天.
实验前测试一下一个钵子经过一天，其中的营养液大约减少多少，比如说减少了70毫升，光周期是14小时，那么就可以估计出大约一小时植株蒸腾消耗5毫升，这样在实验时，每个时间点取样前，都根据所间隔的时间长短补足到原先的溶液体积.
实验时准备好一批小钵，每个小钵用量筒量取等体积的营养液，然后同时把需要测试的植株移到这些小钵中(相同的钵子，所以只需把盖子连同苗子一起移一下就行)，然后每隔一个时间段取0.5-1.0毫升营养液留着去测试其中的磷浓度.每次取营养液后补充水(比如半个小时取样，取了0.5毫升，就应该补水2.5+0.5毫升)
营养液中磷浓度的测试方法用钼锑抗法(详见后面有效磷测定).
表2、本发明克隆的OsPHR2转基因材料磷吸收试验
 
样品 时间(hour) 不同时间点以后溶液中剩余磷的浓度(mg/L)(v＝0.9L) 磷吸收总量(mg) 根干重(g) 每克根干重吸收磷的量(mgPi/g)
溶液起始磷浓度(mg/L) 0 2.766
 
野生型对照 7 2.193 0.636 0.191 3.333±0.0007
OsPHR2超表达转基因植株 7 1.264 1.668 0.117 14.264±0.0003**
野生型对照 23 0.692 2.304 0.191 12.065±0.0006
OsPHR2超表达转基因植株 23 0.051 3.016 0.117 25.783±0.0000**
注释**表示T2代转基因和野生型植株性状间差异t测验的概率值，在1％水平极显著差异。
表3、本发明克隆的OsPHR2转基因材料吸收动力学测定
 
吸收动力学指标 OsPHR2超表达转基因植株 野生型对照
Imax(nmol/g/min) 24.4±0.6** 15.5±0.4
Km(uM) 2.5±0.50** 2.1±0.3
Cmin(uM) 0.7±0.1 0.6±0.0
注释**表示T2代转基因和野生型植株性状间差异t测验的概率值，在1％水平极显著差异。
2、有效磷浓度的测定方法
样品处理方法步骤如下：
1.将新鲜植株先用自来水洗涤，在用蒸馏水冲洗，然后用吸水纸擦干。
2.取0.5克鲜样用液氮研磨成粉末，在4℃放置(冰上或者冰箱)至样品冻融，加入1ml10％(w/v)的高氯酸(PCA)研磨均匀。
3.匀浆液用5％(w/v)的高氯酸(PCA)稀释10倍，于冰上放置30分钟。
4.于4℃，10000g离心10分钟，上清液用于有效磷含量的测定(钼锑抗法，详见全磷测定方法)。
5.取2ml工作溶液与1ml样品上清液混合，于40℃温育20分钟。
6.反应液在冰上冷却后，于820nm可见光波长下测定吸收值。如样品浓度过高，应适当稀释，使其OD值落在标线的线性范围内。
磷标准曲线的制作：
1.磷标准溶液配制(60ppm P)：溶解0.230g磷酸二氢铵(NH4H2PO4)于100ml蒸馏水中，即得600ppmP的磷标准溶液，再将600ppmP的磷标准溶液用提取剂稀释10倍，得60ppmP的磷标准溶液。
2.标准曲线绘制：将60ppmP的标准磷溶液用提取剂稀释，分别制成0.6、1.2、2.4、3.6、4.8和6ppmP的标准系列溶液。提取剂用10％(w/v)的高氯酸和5％(w/v)的高氯酸按体积比1∶9混合配制。用提取剂与工作溶液的反应液作空白。
3.所得标准曲线如下表所示(2.5ml石英比色皿，光程1cm，BACKMAN DU460分光光度计)：
表4、植物有效磷测定标准曲线
 
配制标液体积 所需母液体积 PPM 终浓度PPM(稀释3倍) OD820
1ml 10    l 0.6 0.2 0.1625
1ml 20    l 1.2 0.4 0.3256
1ml 40    l 2.4 0.8 0.6808
1ml 60    l 3.6 1.2 1.0128
1ml 80    l 4.8 1.6 1.3637
1ml 100   l 6.0 2.0 1.7171
Y＝0.8634X-0.0151 R2＝0.9999(Y＝OD820，X＝PPM Pi)
植物有效磷(Pi)含量(mg Pi/g FW)＝OD值*(V/m)*(V2/V1)*C
OD值—换算后待测液中磷的质量浓度(PPM：mg/L)
V—样品制备溶液的ml数，即样品所加提取剂的体积(此为0.01L)
m—样品鲜重(g)(根据实际称得的质量计算)
V1—吸取反应所用体积(1ml)
V2—反应液总体积数(3ml)
C—样品的稀释倍数(如果样品浓度过高，需稀释至1ml后再反应)
3、全磷浓度的测定方法
1.H2SO4-H2O2消煮：称取植物样品0.3～0.5g(准至0.0002g)放入100ml消煮管中，加入1ml蒸馏水湿润，加入4ml浓，分两次各加入2ml，每次加入后摇匀，待反应结束后，置于消煮炉上加热消煮，待H2SO4发白烟，溶液成褐色时，停止加热，(一般180℃，30min，270℃，30min，360℃，30min)，冷却至瓶壁不烫手，加入H2O22ml，继续加热消煮约5～10min，冷却，再加入H2O2 2ml消煮，如此反复至溶液呈无色或清亮后(一般加H2O2总量约8~10ml)，再继续加热5～10min，以除尽剩余的H2O2。冷却，定容。样品做空白试验。
2.吸取0.50～1.00ml消煮液于10离心管中，加少量水稀释，加1滴二硝基酚指示剂，滴加6mol/L NaOH溶液中和至刚呈黄色，再加入0.5mol/L稀硫酸溶液调节至黄色刚刚褪去，然后加入钼锑抗显色剂1.00ml，加水定容，加盖摇匀。室温下放置30mim，700nm比色。(大量样品可用酶标仪测定)做空白，以空白溶液为参比调节仪器零点。
3.标准曲线：准确吸取5mg/L P标准工作溶液0、0.5、1、2、3、4、5、6、8ml，分别放入50ml容量瓶中，加水至30ml，同上步骤显色并定容，即得0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8mg/L P标准系列溶液，与待测液同时测定，读取吸光度。绘制标准曲线和直线回归方程。
全P％＝c(P)×V1/m×(V3/V2)×10-4
式中c(P)——从回归方程求得的显色液中磷浓度，mg/L
V3——显色液体积，ml
V2——吸取测定的消煮液体积，ml
V1——消煮液定容体积，ml
m——称样量，g
表5、本发明克隆的OsPHR2基因转基因T2单株的表现
 
PHR2-O转基因植株地上部 野生型地上部 上升的倍数 转基因植株地下部 野生型地下部
 
有效磷浓度(mg Pi/g FW) 4.26±0.30** 1.08±0.14 4 0.87±0.0.05 0.70±0.07
全磷浓度(mgPi/gDW) 13.92±0.521** 7.32±0.40 1.9 10.18±0.75 8.35±0.28
注释**表示T2代转基因和野生型植株性状间差异t测验的概率值，在1％水平极显著差异。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
Figure A200810162662D00202

Claims (4)

1、基因OsPHR2的用途，其特征是：用于在植物中模拟磷饥饿信号。
2、根据权利要求1所述的基因OsPHR2的用途，其特征是：用于提高植物对磷酸盐的吸收速率。
3、根据权利要求1或2所述的基因OsPHR2的用途，其特征是：所述植物为水稻。
4、根据权利要求3所述的基因OsPHR2的用途，其特征是通过如下方法实现：以OsPHR2的cDNA片段作为目标基因、以35SpCAMBIA1301s作为载体，进行转基因超量表达，将该基因转入水稻中。
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