CN101544987A - miR164基因控制水稻根系发育和育性的功能及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻基因工程技术领域。分离、克隆和通过功能验证得到一种控制植物根系发育和育性的水稻miR164小RNA在水稻遗传改良中的应用，所述的基因是下列核苷酸序列之一：序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或SEQ NO：2中所示的RNA序列。将含miR164前体的核苷酸序列与外源启动子连接后转入水稻，转基因水稻的根系发达，不育；通过外施激素可使育性恢复。

Description

miR164基因控制水稻根系发育和育性的功能及应用
技术领域
本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够影响植物根系发育和育性的microRNA(miRNA)及其前体在水稻遗传改良中的应用。所述的miRNA调控植物的根系发育和生长以及花器官的育性。将该miRNA的前体与泛素蛋白的启动子(Ubiquitin promoter)结合后直接转入水稻，转基因水稻植株根系发育显著增强，植株变得不育性；而外施激素可以使转基因植株的育性得到部分恢复。利用这一技术可以培育根系发达的不育系或保持系从而方便地用于杂交水稻的培育。
背景技术
miRNA是真核生物中存在的、由自身基因组编码的、长为20—22nt(nucleotide)的smallRNA分子。miRNA主要通过与靶基因的RNA分子互补配对来识别靶基因，然后通过miRNA-RISC(RNA induced silencecomplex)来抑制靶基因的表达(Jones-Rhoades M W，Bartel D P，Bartel B.MicroRNAs and their regulatoryroles in plants.Annual Review of Plant Biology，2006，57：19-53)。miRNA基因的转录本(pre-miRNA)与普通mRNA的结构一致，具有5’-CAP和3’poly(A)等结构。因此pre-miRNA也能通过常规的cDNA文库来克隆到。一般miRNA的转录本不含蛋白编码区，会有几个很小的ORF存在于pre-miRNA分子上，但目前没有发现任何可翻译出蛋白的pre-miRNA分子。形成miRNA所需的pre-miRNA就位于miRNA基因的转录本上，长度在60nt到200nt，少数在200nt以上。Pre-miRNA能形成稳定的foldback的二级结构，被miRNA成熟所需的酶识别。miRNA在植物的生长发育中起着非常重要的调节作用，涉及到植物生长、发育、生物胁迫与非生物胁迫的各个方面。很多miRNA的靶基因是转录因子家族。同一个miRNA往往抑制多个靶基因的功能，同时调节植物生长发育中相互联系的不同过程。例如超表达miR156能使拟南芥的叶片数目增加上百倍，植株干重增加4倍，开花时间延迟(Wu G，Poethig R S.Temporal regulation of shoot development in Arabidopsisthaliana by miR156 and its target SPL3.Development，2006，133：3539-3547)；在玉米中，miR172除了调节开花时间以外还调节花的器官的雌雄分化(Chuck G，Meeley R，Irish E，Sakai H，Hake S.The maizetasselseed4 microRNA controls sex determination and meristem cell fate by targetingTasselseed6/indeterminate spikeletl.NatGenet，2007，39：1517-1521)；miR159在ABA应答、种子萌发、花的发育和叶片的形状等过程中有重要的调节作用，miR159超表达后，在萌发期植株对脱落酸(ABA)的敏感性下降，开花时间延迟，花药育性降低(Reyes J L，Chua N H.ABA induction of miR159 controlstranscript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination.Plant J，2007，49：592-606)。
水稻作为最重要的粮食作物，改变植株的形态、育性、开花时间对水稻的产量具有重要意义。miRNA是植物生长发育的一个关键调节因素，miRNA特别是部分高度保守的miRNA往往能够改变植物的许多关键性状。植物根系的发育状况对于植物吸收营养和水分至关重要，发达的根系可以提高植物的营养和水分吸收，提高植物的抗逆性。对植物育性的控制，在利用杂种优势的杂交作物品种的培育过程中具有非常重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含miRNA的DNA片段(在本发明中所述“DNA片段”与“核苷酸序列”同义，下同)，利用这个miRNA分子来控制水稻根的数目和育性。对这个RNA分子进行分析表明它与植物的miRNA164相同，因此被命名为miR164基因。
本发明涉及分离和应用一种包含miR164的DNA片段，该片段赋予植物在根的数目增加和改变育性的能力。其中，所述的miR164基因是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或
2)序列表SEQ NO：2中所示的RNA序列。
3)具有与1)或2)相同功能的miR164保守序列，其形成的成熟microRNA的序列与1)或2)形成的成熟microRNA序列的相似性在90％以上。
由于miRNA发挥功能是靠的长度为20—22nt的成熟小RNA分子与靶基因的RNA分子互补配对来抑制靶基因的功能的，而且成熟的miR164序列在植物里高度保守。因此，采用从其他植物里分离到的miR164或人工合成的功能保守的miR164序列可以用来实现与本发明所描述的实施效果相同或基本相同的结果。
可以采用已经克隆的miR164作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的miR164基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含miR164基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得根数目增加和育性改变的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。
携带有本发明miR164基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
可使用包括本发明的miR164基因的表达载体转化的宿主是包括水稻在内多种植物，培育根系发达，育性可通过外施激素恢复的不育品种。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的能在植物体内表达后形成成熟microRNA的miR164基因对应的DNA序列。其中1-21位和868-887位为扩增miR164基因的引物序列，从第43-63位的大写英文字母为序列表SEQ ID NO：2对应的DNA序列。
序列表SEQ ID NO：2显示的是miR164基因表达形成的成熟microRNA序列，与序列表SEQ ID NO：1中43-63位的DNA序列对应。
图1：本发明的超量表达载体的构建示意图。将pre-miR164基因经酶切连接插入Ubiquitin启动子后。
图2：用northernblot检测成熟miR164在水稻以下不同组织中的表达水平。13个组织器官依次是：1，分蘖期的根；2，拔节期的茎；3，4叶期的叶鞘；5，穗(小于0.5cm)；6，穗(0.5-1cm)；7，穗(3-5cm)；8，穗(大于10cm)；9，雄蕊；10，雌蕊；11，发芽1天的苗；12，发芽3星期的苗；13；3星期的黄花苗。
图3用northern blot检测成熟miR164在多种激素处理后的表达量变化。KT(细胞分裂素，图3a)，NAA(萘乙酸，生长素类似物，图3b)，GA(赤霉素，图3c)，BR(油菜素内酯，图3d)。
图4：超量表达miR164的转基因植株根系比野生型发达。左图显示整个根系，右图显示的是单个根上侧根情况。
图5(包含图5A—图50)：超量表达miR164的转基因植株不育。A-E是颖花形态观察(每个图片中左边为超量表达miR164的转基因植株，右边为野生型对照)；F-K为雄蕊和花粉囊形态观察(F-H为超量表达miR164的转基因植株，I-K为野生型对照)；L-O为花粉形态和育性观察(L-M为超量表达miR164的转基因植株，N-O为野生型对照)。
图6：施加外源激素可以使超量表达miR164的转基因植株不育的表型得到恢复。左图为小穗育性统计；右图是代表性植株在施加或不施加激素后成熟后的整体形态。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆miR164及其前体pre-miR164的DNA片段，以及验证它们功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1：分离克隆miR164的前体pre—miR164
采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从水稻品种“日本晴”(公开报道的一个品种)中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃ 5min，42℃ 120min，70℃ 10min。用带有酶切位点接头的引物GPF(5’-GGTACCAATGGTACCTGGCGACACAGAGAGAGA-3’，序列特异引物外加接头KpnI位点)和GPR(5’-GGATCCAATGGATCCCGAACTGAGCTGGAGAGACA-3’，序列特异引物外外加接头BamHI)扩增出pre—miR164的cDNA(899bp)。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因cDNA。将该克隆命名为pGEM-pre—miR164。
实施例2：pre-miR164超量表达载体的构建和遗传转化
为了能更好的分析miR164的功能，申请人将其前体pre—miR164在水稻中超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。
超量表达载体构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-pre—miR164质粒(实施例1中得到)用BamHI和KpnI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U酶切完毕，用氯仿：异戊醇(体积比为24:1)抽提，纯化酶切产物。用包含pre—miR164的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。遗传转化的载体pCAMBIA1301U是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(来自澳大利亚CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture]实验室)基础上，在酶切位点EcoRI和SacI处引入广泛使用的组成型表达的Ubiquitin启动子(参见：Toki S，Takamatsu S，Nojiri C，Ooba S，Anzai H，Iwata M，Christensen A H，Quail P H，Uchimiya H.Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants.Plant Physiol，1992，100：1503-1507)而得到的(见图1)。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6：271-282，1994)基础上改良进行。转化载体共获得了40株独立的转基因水稻植株。
具体步骤：(1)愈伤诱导：将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。(2)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。(6)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。(7)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。(8)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
试剂配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方：
1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：
硝酸钾(KNO3)              28.3g
磷酸二氢钾(KH2PO4)        4.0g
硫酸铵((NH4)2SO4)         4.63g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)       1.85g
氯化钙(CaCl2·2H2O)       1.66g
逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)               0.08g
硼酸(H3BO3)              0.16g
硫酸锰(MnSO4·4H2O)      0.44g
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)      0.15g
室温下溶解并定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid)        0.1g
维生素B1(Thiamine HCl)      0.1g
维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.1g
甘氨酸(Glycine)             0.2g
肌醇(Inositol)              10g
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制
硝酸铵(NH4NO3)          16.5g
硝酸钾                  19.0g
磷酸二氢钾              1.7g
硫酸镁                  3.7g
氯化钙                  4.4g
室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾                  0.083g
硼酸                    0.62g
硫酸锰                  0.86g
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)    0.025g
硫酸铜(CuSO4·5H2O)      0.0025g
室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。
8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。
9)AS贮存液的配制：秤取AS0.392g，DMSO10ml。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
N6max母液(10X)           100ml
N6mix母液(100X)          10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)     10ml
维生素贮存液(100X)       10ml
2，4-D贮存液             2.5ml
脯氨酸(Proline)          0.3g
CH                       0.6g
蔗糖(Sucrose)            30g
Phytagel                 3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
N6max母液(10X)         100ml
N6mix母液(100X)        10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)   10ml
维生素贮存液(100X)     10ml
2，4-D贮存液           2.0ml
脯氨酸                 0.5g
CH                     0.6g
蔗糖                   30g
Phytagel               3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
N6max母液(10X)       12.5ml
N6mix母液(100X)      1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml
维生素贮存液(100X)   2.5ml
2，4-D贮存液         0.75ml
CH                   0.15g
蔗糖                 5g
琼脂粉(Agarose)      1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X)          12.5ml
N6mix母液(100X)         1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)    2.5ml
维生素贮存液(100X)      2.5ml
2，4-D贮存液            0.75ml
CH                      0.2g
蔗糖                    5g
琼脂粉                  1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X)           5ml
N6mix母液(100X)          0.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)     0.5ml
维生素贮存液(100X)       1ml
2，4-D贮存液             0.2ml
CH                       0.08g
蔗糖                     2g
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(10X)         25ml
N6mix母液(100X)        2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)   2.5ml
维生素贮存液(100X)     2.5ml
2，4-D贮存液           0.625ml
CH                     0.15g
蔗糖                   7.5g
琼脂粉                 1.75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X)         25ml
N6mix母液(100X)        2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)   2.5ml
维生素贮存液(100X)     2.5ml
6-BA贮存液             0.5ml
KT贮存液               0.5ml
NAA贮存液              50μl
IAA贮存液              50μl
CH                     0.15g
蔗糖                   7.5g
琼脂粉                 1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
N6max母液(10X)         100ml
N6mix母液(100X)        10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X)   10ml
维生素贮存液(100X)     10ml
6-BA贮存液             2ml
KT贮存液               2ml
NAA贮存液           0.2ml
IAA贮存液           0.2ml
CH                  1g
蔗糖                30g
Phytagel            3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(10X)       50ml
MSmix母液(100X)      5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 5ml
维生素贮存液(100X)   5ml
蔗糖                 30g
Phytagel             3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
实施例3：检测水稻内源miR164的表达水平
以水稻品种“明恢63”(Oryza sativa L.ssp.Indica，中国公开推广的水稻品种)为材料，提取以下13个不同生长时期的不同组织器官的RNA用northern blot检测成熟miR164的表达水平。选取的13个组织分别是：1，分蘖期的根；2，拔节期的茎；3，4叶期的叶鞘；5，穗(小于0.5cm)；6，穗(0.5-1cm)；7，穗(3-5cm)；8，穗(大于10cm)；9，雄蕊；10，雌蕊；11，发芽1天的苗；12，发芽3星期的苗；13，3星期的黄花苗。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)。按Xie等的实验操作方法进行RNA转膜(Xie K，Wu C，Xiong L.Genomic organization，differentialexpression，and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors andmicroRNA156in rice.Plant Physiol，2006，142：280-293.)，并以miR164为探针做Northern杂交。结果表明：miR164在所选取的组织中均有一定量的表达，但幼穗中表达量相对较低(见图2)。
我们选用籼稻品种“明恢63”做为表达谱分析的材料。激素处理的材料是在种子催芽后，正常生长条件下培养18-20天，至四叶期时进行各种处理，将激素均匀的喷洒水稻植株表面。激动素和赤霉素处理是分别在处理前、处理后1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、3小时取样；奈乙酸处理的在处理前、处理后30分钟、3小时、9小时、24小时取样；油菜素内酯处理是在处理前、处理后15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、9小时、21小时取样。黄化苗见光处理是将种子催芽后在持续黑暗的条件下生长14天，然后移到正常光照条件下取样，分别在光照前和光照后3小时、6小时、9小时取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，购自Invitrogen公司)后，按Xie等的实验操作方法进行RNA转膜(Xie K，Wu C，Xiong L.Genomic organization，differential expression，and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-liketranscription factors and microRNA156 in rice.Plant Physiol，2006，142：280-293.)，并以miR164为探针做Northern杂交。结果表明，miR164在部分激素处理后有小幅度的上升或下降。miR164在激动素(KT)处理后表达逐渐下降，而在赤霉素(GA)的处理后miR164的表达上升，在10分钟时达到最高，随后又下降至处理前的表达水平。在暗生长的水稻幼苗中，miR164有较高的表达，但见光后就恢复到正常水平。奈乙酸(NAA)处理24小时后，miR164有升高。在油菜素内酯(BR)的处理后，miR164没有明显变化(图3)。
实施例4：miR164超量表达转基因植株根系发达
本实施例将miR164超表达转基因植株和野生型植株在1/2MS培养基上生长，以观察其表型。具体步骤如下：将超量表达转基因家系水稻种子去壳消毒(75％酒精处理3min，0.15％氯化汞处理30min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS基本培养基上发芽，将野生型水稻对照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS基本培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到1/2MS基本培养基上，在光照培养室(模仿自然生长条件，光照14个小时，黑暗10个小时)生长10天后观察表型。每个家系株数不少于30棵植株，实验设置3次重复。结果显示，超量表达miR164的转基因植株的根系明显比野生型发达，其不定根和侧根数目都增多，根毛也显著增长(图4)。
实施例5：miR164超量表达转基因植株不育，外施激素可以使其育性恢复
通过表型观察发现，miR164超量表达转基因植株的颖壳出现皱缩(图5a)，颖壳的异常导致颖壳无法张开，所以尽管花丝已伸长但并不能伸出颖壳(图5b)。在开花后的miR164超量表达转基因植株的胚囊解剖的结果表明胚乳并没有发育，在开花后伸长的子房中并没有胚乳的形成，而且大部分的miR164超量表达转基因植株的子房生长停止甚至死亡(图5c—图5e)。miR164超量表达转基因植株的花药的发育异常，通过SEM可以观察到在开花前MI7的花药只有不对称的两个花粉囊，而正常的花药是“蝴蝶”形四个花粉囊。miR164超量表达转基因植株的花粉并不是正常的球形，而是萎缩的(图5f—图5k)。碘染分析表明miR164超量表达转基因植株的花粉是完全不育的(图51—图5o)。利用miR164超量表达转基因水稻植株不育的功能，可以用来方便地培育水稻不育系用于杂交水稻育种。
通过对2个miR164超量表达转基因的T0代植株在分蘖期到灌浆期持续的外施吲哚乙酸(IAA)、奈乙酸(NAA)、激动素(KT)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)四种激素，并与正常生长的miR164超量表达转基因植株进行了比较。外施激素可以使miR164超量表达转基因植株的穗正常结实。这表明，外施激素可以互补miR164超量表达转基因植株发育上的缺陷，在二次枝梗已形成的条件下使颖花和种子正常发育(图6)。利用外施激素可以使miR164超量表达转基因水稻植株的不育得到恢复的特点，可以很方便地将miR164超量表达转基因水稻植株既用于不育系(不施激素)也用于保持系(外施激素获得种子从而使不育系得到繁殖，但其下一代植株不外施激素时仍然不育)的培育，从而实现“一系两用”，用于杂交稻的培育。
序列表
<110>华中农业大学
<120>miR164基因控制植物根系发育和育性的功能及应用
<130>
<141>2009-05-13
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>887
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(887)
<223>
(220>
<221>primer_bind
<222>(868)..(887)
<223>
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<223>
<400>1
Figure A200910062045D00131
Figure A200910062045D00141
<210>2
<211>21
<212>RNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(21)
<223>
<400>2
Figure A200910062045D00142

Claims (3)

1、一种能够控制水稻根系发育和育性功能的的miR164基因在水稻遗传改良中的应用，其特征在于，所述的miR164基因是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或
2)序列表SEQ NO：2中所示的RNA序列；或
3)具有与1)或2)相同的控制水稻根系发育和育性功能的miR164基因保守序列。
2、权利要求1中所述miR164基因在促进水稻根系生长中的应用。
3、权利要求1中所述miR164基因在培育水稻不育系与保持系及其杂交水稻中的应用。
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