CN111518810A - 玉米zma-miR164e及其靶基因在调控籽粒大小中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米zma‑miR164e在调控籽粒大小中的应用。首次明确了玉米zma‑miR164e及其靶基因与植物籽粒发育的关系，验证了该microRNA及其靶基因在玉米籽粒大小调控中的重要性，为zma‑miR164e及其靶基因在提高玉米及其他植物产量的应用上提供了理论依据和利用价值。玉米zma‑miR164e在植物籽粒发育领域，特别是玉米高产领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

Description

玉米zma-miR164e及其靶基因在调控籽粒大小中的应用

技术领域

本发明涉及玉米zma-miR164e及其靶基因在调控籽粒大小中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

玉米是世界第一大粮食作物，是人类营养、动物饲料和生物能源的资源。统计数据显示,2016/2017产季中国玉米收获面积超过美国,但是玉米产量却仅占该产季美国玉米产量的63.49％。玉米的产量关系到国家粮食安全和地方的经济建设，提高玉米产量刻不容缓。种子是玉米的关键器官，籽粒大小是决定籽粒重量的主要因素，籽粒大小主要包括籽粒长度(KL)、籽粒宽度(KW)和籽粒厚度(KT)等。与粮食产量本身相比，籽粒大小性状表现出更高的遗传力和更好的环境稳定性，故挖掘调节玉米籽粒大小相关基因、研究其调节机制、培育高产的玉米新品种，是提高玉米产量的最有效途径。

玉米籽粒发育受转录和转录后大量基因调控，目前，植物microRNAs(miRNAs)在籽粒发育过程中的重要性引起了人们的广泛关注。植物miRNAs为内源性约22-nt RNA，其通过碱基互补配对结合靶基因，对靶mRNAs进行剪切降解或抑制其翻译，进而调控植物发育，具有改善作物产量等复杂性状的潜力。近些年的研究表明，miR164家族在植物发育调控中具有重要作用，除了广泛参与植物的胁迫应答，还参与调控植物分生组织、花器官、侧根发育等一系列生理活动，在玉米中已受到关注。在研究玉米籽粒发育过程中miRNAs的动态表达模式时，发现miR164家族在玉米胚胎发生和种子发育过程中表达模式差异显著，说明miR164调控玉米籽粒发育过程，因此，zma-miR164家族及其靶基因都是潜在的重要籽粒发育调节因子。

但是目前，哪些基因为zma-miR164e的靶基因还未有报道，zma-miR164e及其靶基因与籽粒发育是否相关还有待进一步验证。

虽然目前利用同源克隆技术鉴定了一些控制玉米籽粒重量和大小的功能基因，然而，由于缺乏这些基因优异单倍型鉴定，这些基于突变或同源基因克隆的产量相关基因，在通过分子标记辅助育种提高玉米产量方面的应用受到很大限制。因此，结合GWAS和QTL作图，说明玉米产量的遗传结构和揭示优良等位基因，将有助于分子标记辅助育种(MAS)和基因组选择(GS)育种。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供玉米zma-miR164e及其靶基因在调控籽粒大小中的应用。首次明确了玉米zma-miR164e及其靶基因与植物籽粒发育的关系，验证了该microRNA在玉米籽粒大小调控中的重要性，为zma-miR164e及其靶基因在提高玉米及其他植物产量的应用上提供了理论依据和利用价值。

玉米zma-miR164e或玉米zma-miR164e的靶基因在调控植物籽粒大小方面的应用。

玉米zma-miR164e或玉米zma-miR164e的靶基因在调控玉米穗子表型方面的应用，所述穗子表型为穗粗和穗长。

进一步的，上述应用中所述玉米zma-miR164e的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，上述应用中所述的玉米zma-miR164e靶基因包括在拟南芥中的靶基因和玉米中的靶基因，所述拟南芥中的靶基因为CUC1、CUC2、NAC6，所述玉米中的靶基因为ZmNAC108。

进一步的，上述CUC1的序列如SEQ ID NO.2所示，上述CUC2的序列如SEQ ID NO.3所示，上述NAC6的序列如SEQ ID NO.4所示，上述ZmNAC108的序列如SEQ ID NO.16所示。

一种增大植物籽粒的方法，所述方法包括：上调植物中玉米zma-miR164e的靶基因表达，所述玉米zma-miR164e的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，上述方法中所述的玉米zma-miR164e的靶基因为CUC1、CUC2、NAC6、ZmNAC108；所述CUC1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述CUC2的序列如SEQ ID NO.3所示，所述NAC6的序列如SEQ ID NO.4所示，所述ZmNAC108的序列如SEQ ID NO.16所示。

进一步的，上述方法中所述上调植物中玉米zma-miR164e的靶基因表达：将玉米zma-miR164e的靶基因转入植物中。

一种培育高产植物的方法，包括如下步骤：将玉米zma-miR164e的靶基因转入玉米或拟南芥中。

有益效果：

(1)首次明确了zma-miR164e或zma-miR164e的靶基因与植物籽粒发育的关系，验证了该miRNA或zma-miR164e的靶基因在玉米高产应用的重要性。

(2)为该miRNA在玉米及其他植物上提高产量的应用提供了理论依据。玉米zma-miR164e在植物籽粒发育领域，特别是玉米高产领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1拟南芥转基因株系OE(即T-1/2/3)与哥伦比亚野生型(WT)的果荚和分枝表型。

图2拟南芥转基因株系(OE)与哥伦比亚野生型(WT)花、果荚内籽粒的表型。

图3拟南芥转基因株系(OE)与哥伦比亚野生型(WT)的果荚表型。

图4拟南芥转基因株系与哥伦比亚野生型比较CUC1、CUC2、NAC6三个基因的相对表达量。

图5拟南芥CUC1 mRNA被zma-miR164e靶向切割后CUC1蛋白的积累情况。

图6拟南芥CUC2 mRNA被zma-miR164e靶向切割后CUC1蛋白的积累情况。

图7拟南芥NAC6 mRNA被zma-miR164e靶向切割后CUC1蛋白的积累情况。

图8玉米NAC108 mRNA被zma-miR164e靶向切割后NAC108蛋白的积累情况。

图9玉米转基因株系(108-3)与野生型(C01)穗粗表型。

图10玉米转基因株系(108-3)与野生型(C01)穗长表型。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1.群体材料种植及表型数据测定分析

1-1玉米材料的种植

在两个重复的完全随机区组设计中种植，每个材料种植一行，每行14株，两行间距0.75m，种植密度为每公顷6.2万株。对于GWAS群体而言，设置三个环境重复，西双版纳(景洪、E100°460’、N22°0’)、四川(洪雅、E103°22’、N29°55’)和四川(雅安、E103°0’、N29°59’)。对于IBM群体，设置了六个环境重复，包括2016年和2017年的四川(崇州，E103°400’，N30°400’)，2016年和2017年的四川(温江，E103°500’，N30°420’)，2016年在西双版纳(景洪，E100°460’，N22°0’)和2016年的新疆(昌吉，E87°180’，N44°10’)。

1-2表型数据的测定：

KL和KW在每个材料中通过从每个穗子中心随机选择10个籽粒进行测定，而KT则使用5个籽粒进行测量，每个材料选取5个穗子。KW和KL用尺子测量，精度为0.05mm，KT用电子数字卡尺测量，精度为0.01mm。关联群体中，KL、KW和KT分别为6.50-13.60cm、4.81-9.93cm和15.91-33.29mm，平均为9.65cm、7.27cm和23.21mm。IBM群体中，KL、KW和KT的分布范围分别为7.12cm-13.07cm、4.82cm-10.45cm和3.43cm-4.99cm，平均分布范围分别为10.50cm、7.15cm和4.42cm。

1-3表型数据分析：

用IBMSPSS Statistics21.0版软件对表型数据进行描述性统计分析，并进行性状之间的相关性分析。再计算广义遗传率，同时使用R包lme4计算最佳线性无偏预测(BLUP)值。

1-3-1GWAS分析

对310份自交系进行全基因组关联分析，利用先前研究的公开基因型数据，310份材料基因型都包含56,110个SNP位点，SNP过滤标准：去除缺失率>5％、杂合率>20％和较小等位基因频率(MAF)<0.05的SNPs，且仅保留双等位基因位点的SNPs，共有39,354个高质量SNPs保留用于进一步分析。由此产生的39,354个SNPs随后被用于LD计算和GWAS分析。本研究采用三种关联分析方法对籽粒大小性状进行GWAS分析，以平衡假阳性和假阴性：(1)运用GAPIT中的压缩混合线性模型(CMLM)结合亲缘关系矩阵(kingship matrix)和群体结构(Qmatrix)；(2)运用Tassel5.0中的混合线性模型(MLM)分析,结合亲缘关系矩阵(kingshipmatrix)和群体结构(Q matrix)；(3)运用FarmCPU进行分析，以种群结构(PCA)为协变量，通过三种关联分析方法共鉴定出21个与这三种性状显著关联的SNPs。然后，使用这21个独特的SNPs来鉴定候选基因，其中4个SNPs位于基因间区域，17个位于基因内区域，共获得17个候选基因。

1-3-2QTL定位分析

在之前的研究中，为IBM群体构建了一个包含6,618个bin markers的遗传连锁图谱，相邻标记之间的平均距离为0.48cM。在本研究中，检测控制籽粒大小的QTL时，七个环境中检测控制KL和KW，四个环境中检测控制KT的QTL，使用Windows QTL Cartographersoftware version2.5软件里的复合区间作图(CIM)方法，进行QTL定位分析，阈值为LOD＝2.5，三个性状共检测到50个QTL。

1-3-3关联群体和连锁群体共定位区段miRNAs挖掘

一般，多个群体共定位到的遗传位点比较准确且稳定。为获得以上关联群体和连锁群体共定位区段，发明者检索了GWAS显著关联到的控制玉米籽粒大小性状的SNPs(P≥1.0◇10-3)落在IBM群体定位到的50个QTL中的情况，以确定两个群体中共定位的遗传位点。结果共检索到56个SNPs落入18个QTL区段。根据GWAS群体衰减距离(LD)，扫描56个共定位SNPs的上游和下游220-Kb区域内的miRNAs，共获得7个miRNAs，其中之一便是zma-miR164e。

实施例2.拟南芥zma-miR164e的遗传转化

2-1实验操作

从B73的基因组DNA中克隆出一个426-bp的zma-miR164e前体片段，所用引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。然后使用In-Fusion连接酶将DNA片段连接到植物表达载体PRI-101-AN上，多克隆位点位于CaMV35S启动子与NOS终止子之间。将得到的35S：pre-miR164e质粒转化至农杆菌菌株GV3101中，然后用农杆菌侵染拟南芥花序进行遗传转化。将收集到的种子用10％H₂O₂表面消毒，并在含有50mg/mL卡那霉素的MS培养基上培养，筛选获得三个阳性转化植株T-1、T-2、T-3(即拟南芥转基因株系OE)。然后，将阳性转化植株移植至营养土中，在22℃温室，长日条件下生长(16-h光/8-h暗)。同时，设置相同种植条件的野生型植株(WT)。

用半定量RT-PCR法测定了zma-miR164e的表达水平，所用上游引物序列如SEQ IDNO.7所示，下游引物序列为试剂盒提供。

2-3结果分析

图1为拟南芥转基因株系OE(T-1/2/3)与哥伦比亚野生型(WT)的果荚和分枝表型。图1中的左一为哥伦比亚野生型的果荚和分枝情况，后三个为转基因株系的果荚和分枝情况。图2为拟南芥转基因株系(OE)与哥伦比亚野生型(WT)花、果荚内籽粒的表型。图2中的a、b、c分别为野生型的花，雌雄蕊，种子；图2中的d、e、f分别为拟南芥转基因株系的花，雌雄蕊，种子。图3为拟南芥转基因株系(OE)与哥伦比亚野生型(WT)的果荚表型。

实验表明，该基因在三个转基因株系中过量表达，而野生型(WT)植株中无表达。阳性转基因植株与WT相比，果荚瘦小，不能产生种子，且平均增加14个分枝，花无花瓣。表明zma-miR164e的过表达影响拟南芥种子的形成。

实施例3.miRNA的定量及其靶基因验证

3-1 miRNA的定量

用CTAB法提取转基因拟南芥株系基因组DNA，从T-DNA序列中设计引物以鉴定阳性植株，引物序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。利用HiPure Plant RNA Mini Kit(Magen，广州，中国)试剂盒分别从阳性转基因植物、WT植物的花序与果荚混合物中提取出总RNA。用Mir-X miRNA first-strand synthesis kit(Clontech,Mountain View,CA)反转录试剂盒对miRNAs进行逆转录，使zma-miR164e通过逆转录后携带标签序列能被定量。用zma-miR164e的整个序列作为5’引物，试剂盒提供的标记序列的一部分作为3’引物，用半定量RT-PCR方法对转基因拟南芥中zma-miR164e的表达量进行定量分析。

3-2靶基因的验证

由于zma-miR164e的序列与拟南芥miR164家族的任何成员都不同，我们首先使用植物miRNAs靶基因预测网站psRNATarget预测zma-miR164e在拟南芥中的候选靶基因。结果表明，CUC1、CUC2和NAC6的错配分数最低，确定为候选靶基因。使用PrimeScriptTMRTreagent kit with a gDNAEraser(Takara,大连，中国)试剂盒将总RNA逆转录为cDNA用于靶基因荧光定量分析，测定阳性植株中CUC1、CUC2和NAC6的表达水平，所用引物序列如SEQID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示，用β-tubulin作为内参基因。

将zma-miR164e(OD600nm分别为0、0.3、0.6、0.9)与eGFP:CUC1(OD600nm为0.6)混合分别注射入本氏烟草叶肉细胞中，48h左右共聚焦观察荧光强度。结果显示，随着zma-miR164e浓度升高，eGFP:CUC1荧光蛋白积累量减少。同时，构建CUC1 mRNA上zma-miR164e识别位点同义突变的eGFP:CUC1m载体作为对照，如上所述与不同浓度的zma-miR164e混合共同注射烟草。

相同的方法可验证zma-miR164e靶向剪切CUC2和NAC6。

3-3分析结果

(1)测定阳性植株中CUC1、CUC2和NAC6的表达水平的结果表明在zma-miR164e过表达的拟南芥转基因植株中，CUC1、CUC2和NAC6的表达量均显著下降。

(2)图4为拟南芥转基因株系与哥伦比亚野生型比较CUC1、CUC2、NAC6三个基因的相对表达量。图5为拟南芥CUC1 mRNA被zma-miR164e靶向切割降低了CUC1蛋白的积累。上图为不同浓度zma-miR164e与相同浓度eGFP：CUC1混合注射烟草叶肉细胞后细胞核内荧光蛋白积累情况及荧光强度分析；下图为不同浓度zma-miR164e与eGFP：CUC1m(CUC1的zma-miR164e识别位点同义突变)混合注射烟草叶肉细胞后细胞核荧光蛋白积累情况及荧光强度分析。图6是拟南芥CUC2 mRNA被zma-miR164e靶向切割降低了CUC2蛋白的积累。上图为不同浓度zma-miR164e与相同浓度eGFP：CUC2混合注射烟草叶肉细胞后细胞核内荧光蛋白积累情况及荧光强度分析；下图为不同浓度zma-miR164e与eGFP：CUC2m(CUC2的zma-miR164e识别位点同义突变)混合注射烟草叶肉细胞后细胞核荧光蛋白积累情况及荧光强度分析。图7是拟南芥NAC6 mRNA被zma-miR164e靶向切割降低了NAC6蛋白的积累。图7中的上图为不同浓度zma-miR164e与相同浓度eGFP：NAC6混合注射烟草叶肉细胞后细胞核内荧光蛋白积累情况及荧光强度分析；图7中的下图为不同浓度zma-miR164e与eGFP：NAC6m(NAC6的zma-miR164e识别位点同义突变)混合注射烟草叶肉细胞后细胞核荧光蛋白积累情况及荧光强度分析。

结果显示，在剪切位点同义突变后，eGFP：CUC1m、eGFP：CUC2m和eGFP：NAC6m荧光蛋白积累量不随zma-miR164e浓度的升高而降低。以上结果表明，zma-miR164e靶向剪切CUC1、CUC2和NAC6。

实施例4玉米靶基因的验证及靶基因遗传转化

4-1靶基因验证

使用植物miRNAs靶基因预测网站psRNATarget预测zma-miR164e在玉米中的候选靶基因，结果显示ZmNAC108可能为其靶基因，其序列如SEQ ID NO.16所示。使用PrimeScriptTMRT reagent kit with a gDNAEraser(Takara,大连，中国)试剂盒将玉米B73的总RNA逆转录为cDNA，克隆出一个1017-bp的ZmNAC108片段，所用引物序列如SEQ IDNO.17，SEQ ID NO.18所示。构建35S:108:eGFP载体，将zma-miR164e(OD600nm分别为0、0.4、0.8、1.2)与108：eGFP(OD600nm为0.6)混合分别注射入本氏烟草叶肉细胞中，48h左右共聚焦观察荧光强度。结果显示，随着zma-miR164e浓度升高，108：eGFP荧光蛋白积累量减少。同时，构建NAC108 mRNA上zma-miR164e识别位点同义突变的108m：eGFP载体作为对照，如上所述与不同浓度的zma-miR164e混合共同注射烟草。

4-2靶基因遗传转化

利用前所克隆的1017-bp的ZmNAC108片段，使用In-Fusion连接酶将DNA片段连接到植物表达载体pCAMBIA3300上，多克隆位点为Sca I和Xba I，位于Globulin启动子与NOS终止子之间。将得到的Globulin:ZmNAC108质粒转化至农杆菌菌株EHA105中，然后用农杆菌侵染玉米自交系C01幼胚进行遗传转化。经过共培养、恢复培养、筛选培养、分化培养几个阶段，获得玉米幼苗，并用Bar试纸条对幼苗进行阳性检测，最终获得5个转化事件。

4-3结果分析

(1)图8为玉米ZmNAC108 mRNA被zma-miR164e靶向切割降低了ZmNAC108蛋白的积累。上图为不同浓度zma-miR164e与相同浓度108：eGFP混合注射烟草叶肉细胞后细胞核内荧光蛋白积累情况及荧光强度分析；下图为不同浓度zma-miR164e与108m：eGFP

(ZmNAC108的zma-miR164e识别位点同义突变)混合注射烟草叶肉细胞后细胞核荧光蛋白积累情况及荧光强度分析。

结果显示，在剪切位点同义突变后，108m：eGFP荧光蛋白积累量不随zma-miR164e浓度的升高而降低，说明zma-miR164e靶向剪切ZmNAC108。

(2)图9和图10为ZmNAC108转化事件108-3和野生型C01的穗子表型。图上为C01，图下为108-3。初步表型探究结果显示，ZmNAC108的过表达导致108-3穗子明显大于野生型C01，表明转化入zma-miR164e的靶基因，对于玉米产量有提升作用。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 玉米zma-miR164e及其靶基因在调控籽粒大小中的应用

<130> 2020

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> RNA

<213> 序列

<400> 1

guggagaagc aggacacgug agcgaccauc caguuccacu cccgcuggcu cgcugcugga 60

gcucccggcg gcuuggugag uuuggguggu cguucaugug uccgcccucu ccaccg 116

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 序列

<400> 2

atggatgttg atgtgtttaa cggttggggg aggccaagat ttgaagatga atcccttatg 60

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aaggttcttg actctaattt ctcttgtgcc gccatttctc aagttgatct caacaagtct 180

gagccttggg agcttcctga gaaagcgaaa atgggggaga aggagtggta cttcttcaca 240

ctaagagacc gtaaataccc aacgggactg agaacgaaca gagcaacaga agctggttac 300

tggaaagcca ctggtaaaga cagagagatc aaaagctcaa agacaaaatc acttctcggg 360

atgaagaaaa ctcttgtctt ttacaaaggc agagctccta aaggagagaa gagttgttgg 420

gtcatgcatg agtatcgcct tgacggcaaa ttctcttacc attacatttc ctcctccgct 480

aaggatgaat gggttctctg taaagtttgt ctgaaaagcg gcgtagttag tagagagacg 540

aacttgatct cttcttcttc ttcttctgcc gtcaccggag agttctcctc tgccggttct 600

gcaattgctc cgatcatcaa tacctttgcg acggagcacg tgtcctgttt ctccaataac 660

tctgctgctc ataccgatgc gagctttcat acattccttc ccgctccacc gccgtcactg 720

cccccacgtc agccacgtca cgtcggtgat ggcgtggcgt ttggtcagtt tctggatttg 780

ggatcatcgg gacagattga tttcgatgca gcagcagcag cgttctttcc gaatctacct 840

tctctgcctc ccacggttct tcctcctcct ccgtcatttg caatgtacgg tggaggctcc 900

cccgccgtga gtgtgtggcc gtttactctc tga 933

<210> 3

<211> 1128

<212> DNA

<213> 序列

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ttcaggtttc atcccacgga cgaagagctc atcactcatt accttctccg caaagtcctc 120

gacggttgct tctcaagccg tgccatcgca gaagttgatc tcaacaagtg tgagccttgg 180

caacttcccg ggagagctaa gatgggagag aaagaatggt acttctttag cctccgtgac 240

cggaagtatc cgacgggact gagaactaac agagcaactg aggctggtta ctggaaagct 300

accggaaaag acagagagat ctttagttca aagacttgtg cacttgttgg gatgaagaag 360

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tgggtgatct ctagggtttt ccagaaaacc actttagcta gcaccggagc cgtctccgaa 540

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<212> DNA

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aaggttttca acactttctt ctctgctact gccattggtg aagttgatct caacaagatt 180

gagccttggg acttaccatg gaaggctaag atgggagaaa aagaatggta tttcttctgt 240

gtgagagacc ggaaataccc gaccggttta aggacaaacc gggcgacaga agccggttat 300

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catgaatatc gtttagaagg caaatattgt attgaaaatc ttccccaaac agctaagaac 480

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tctcaacgag actccttcac cggttcgtcg tctcacgtga cctgcttctc cgaccaagaa 660

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gatcctctgt ttttacaaga caattattcg ctaatgaagc tgttgcttga cggtcaagaa 780

actcaattct ccggcaaacc tttcgacggt cgtgattcgt ccggtacaga agaattggat 840

tgcgtttgga atttctga 858

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<400> 6

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<210> 8

<211> 22

<212> DNA

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<400> 8

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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caacttcccg ggagagctaa gatg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tacttccggt cacggaggct aaag 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttaccatgg aaggctaaga tggg 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggtatttccg gtctctcaca cag 23

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggggactcta gatacatcac aatcaca 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caaatgtttg aacgatcggg gaaat 25

<210> 16

<211> 1017

<212> DNA

<213> 序列

<400> 16

atgtcgatga gcttcttgag catggtggag gcggagctgc cgccggggtt ccggttccac 60

ccgagggacg acgagctcat ctgcgactac ctcgcgccca agctcggcgc caagcccggc 120

ttctccggct gccgcccgcc catggtcgac gtcgacctca acaaggtcga gccatgggac 180

ctccccgtgg cggcgtcggt ggggccgcgg gagtggtact tcttcagcct caaggaccgc 240

aagtacgcga cggggcagcg gacgaaccgg gccacggtgt ccgggtactg gaaggcgacg 300

gggaaggacc gacccgtggt ggcggcgcgg cgaggcgcgc tggtggggat gcgcaagacg 360

ctcgtgttct accaggggag ggcgcccaag ggcaggaaga cggagtgggt gatgcacgag 420

tacaggatgg agccagctgc tcctcttctt gatcaccaac cctcctcatc caactccaag 480

gatgaagatt gggtgctgtg cagagtcatc tgcaagaaga aactggcagc aggaggccgc 540

gcaggagggg gcagctcgag gagcctggtc gccagcaacg gcggccgcga gaccgcgcca 600

gccaccccgc cgccgccgcc gctgccacct cgcatggaca cggacgccac cctagcacag 660

ctccaggccg ccatgcacgc caccgccggc gcgctcgagc aggtgccctg cttctccagc 720

ttcaacaaca acactgccag ctctagagct gctgccgcag cagcagcagc gcagccatgc 780

tacctgccca gcatggccac aggcggcagc cacggcacga cgagctacta cctagaccac 840

gcgatgctgc cgcctgagct gggtggctgc ttcgatcctc tccacggcga caagaagctg 900

ctcaaggcgg tgctgggcca gctcggcggc gacgcggtgg cgccgggcct gagcctgcag 960

cacgagatgg ccgcgggcgc tgtcgtcgct tcatccgctt ggatgaatca cttctag 1017

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 序列

<400> 17

ggacagggta cccggggatc catgtcgatg agcttcttga gca 43

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 序列

<400> 18

agtgtcgact ctagaggatc cgaagtgatt catccaagcg gat 43

Claims (9)

1.玉米zma-miR164e或玉米zma-miR164e的靶基因在调控植物籽粒大小方面的应用。

2.玉米zma-miR164e或玉米zma-miR164e的靶基因在调控玉米穗子表型方面的应用，其特征在于，所述穗子表型为穗粗和穗长。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述玉米zma-miR164e的序列如SEQ IDNO.1所示。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的玉米zma-miR164e靶基因包括在拟南芥中的靶基因和玉米中的靶基因，所述拟南芥中的靶基因为CUC1、CUC2、NAC6，所述玉米中的靶基因为ZmNAC108。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CUC1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述CUC2的序列如SEQ ID NO.3所示，所述NAC6的序列如SEQ ID NO.4所示，所述ZmNAC108的序列如SEQ ID NO.16所示。

6.一种增大植物籽粒的方法，其特征在于，所述方法包括：上调植物中玉米zma-miR164e或zma-miR164e的靶基因表达，所述玉米zma-miR164e的序列如SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的玉米zma-miR164e的靶基因为CUC1、CUC2、NAC6、ZmNAC108；所述CUC1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述CUC2的序列如SEQ IDNO.3所示，所述NAC6的序列如SEQ ID NO.4所示，所述ZmNAC108的序列如SEQ ID NO.16所示。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述上调植物中玉米zma-miR164e的靶基因表达：将玉米zma-miR164e的靶基因转入植物中。

9.一种培育高产植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：将玉米zma-miR164e的靶基因转入玉米或拟南芥中。

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