CN103189512A - 用于寄生体控制的植物miRNA的过表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于产生一种对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞的方法，这些方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞。本发明进一步提供了在大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，以及提供了包括用于转化植物、植物部分或植物细胞的核酸构建体的组合物以及经转化的植物、植物部分与植物细胞。

Description

用于寄生体控制的植物miRNA的过表达

优先权声明

本申请在35U.S.C.§119(e)下要求于2010年10月29日提交的美国临时申请号61/408,088的权益，其全部内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及通过植物miRNA过表达而进行的植物寄生体以及病原体的控制，尤其是用于控制线虫寄生体的方法。

背景

植物寄生体（有害生物与病原体）每年引起全球数十亿美元的作物损失。线虫（尤其是大豆胞囊线虫）是第一位的大豆有害生物。

线虫是专性定栖的体内寄生体，其以超过2000种植物的根、叶以及茎，果实，以及观赏植物为食，引起全球大约1千亿美元的作物损失。线虫存在于美国各地，但是在南部以及西部的温暖潮湿地区以及在沙壤土中是一个主要的问题。1954年在北卡罗来纳州首次发现了大豆胞囊线虫（SCN，Heterodera glycines）。它是大豆植物最严重的有害生物。一旦SCN存在于大田里，使用已知的方法不能将其可行地根除。尽管大豆是受SCN袭击的主要经济作物，但是SCN还在总共大约五十中宿主上寄生，包括大田作物、蔬菜、观赏植物以及杂草。

线虫损害的征兆包括叶发育不良以及黄化，以及在炎热时节植物的萎蔫。然而，线虫（包括SCN）可以引起严重的产量损失，但没有明显的地上症状。植物感染SCN可以1)导致矮化的或发育不良的根，2)减少这些根上的固氮根瘤的数目，并且3)使得这些根更易受其他土壤生植物有害生物的袭击。

SCN的生命周期由卵阶段、四幼年阶段以及成虫阶段组成。在卵中第一次蜕皮之后，SCN第二阶段幼体（J2）孵化，移动穿过土壤，穿透根并向维管柱移动。J2是线虫可以感染大豆根的唯一生命阶段。移动的幼体在皮层、内皮层、或中柱鞘中选择宿主细胞并且诱发宿主细胞融合为一种永久取食部位（称作合胞体）的构造的一部分。在此时，线虫变为定居并且分化为第三（J3）以及第四（J4）幼年阶段并且然后成熟为成年雌性或雄性。因此活跃摄食的线虫从植物窃取必须营养，从而导致产量损失。随着线虫取食，它们膨大并且最终雌性线虫变得如此之大以至于它们破坏穿过根组织并且暴露在根的表面。

雄性线虫（它们不随着成年而膨大）经历变态在J4阶段恢复蠕虫状形态并且向回移行出根以使成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍旧附着于根系统并且继续摄食。受精之后，雌性产卵，多数卵仍留在体内。死亡之后，雌性躯体发展为一种包裹这些卵的硬化胞囊胞囊最终驱除出去并且被发现游离在土壤中。胞囊的外壁变得十分坚硬，如此为包含在其中的200-400个卵提供了保护。SCN卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件发生。尽管这些卵中有许多可以在第一年之内孵化，但是有许多将在这些胞囊中存活数年。

常规的用于管理SCN的惯例包括：在SCN感染的土地中维持适当的地力以及土壤pH水平；控制其他植物疾病以及昆虫与杂草有害生物；使用卫生惯例，比如仅在耕种未感染田地之后进行SCN感染的田地的耕地、栽植以及栽培；在受感染田地中耕种之后彻底清洁设备；不使用来自受感染土地上生长的植物的种子用于种植未感染田地，除非该种子已经经过适当清洁；轮转受感染的田地并且用非宿主作物（比如玉米、燕麦以及苜蓿）轮换宿主作物；使用杀有害生物剂或熏蒸剂（例如杀线虫剂）；以及种植抗性大豆品种。虽然这些惯例中有许多是有效的，但是除了实施耗费时间并且昂贵之外，这些方法中有一些不再可行，比如施用杀线虫剂，这是由于它们的毒性以及负面环境影响。如此，目前没有有效率并且有效的方法来控制植物中的线虫感染。因此，对于用于预防、控制以及减少植物中的线虫寄生的组合物以及方法存在需要。

因此，本发明通过提供包括微小RNA（miRNA）的、用于控制植物寄生体（尤其是线虫有害生物）的组合物与方法而克服了现有技术的缺陷。

发明概述

本发明的一个方面是用于产生一种对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分或植物细胞的方法，该方法包括将一种异源微小RNA164（miR164）核苷酸序列引入该植物、植物部分或植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分或植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照植物、植物部分或植物细胞对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分或细胞。

本发明的另一个方面提供了用于产生一种对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞的方法，该方法包括：将一种异源微小RNA164（miR164）核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

本发明的一个另外的方面提供了一种用于在大豆植物或其部分中增加对大豆胞囊线虫寄生的抗性的方法，该方法包括：a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物细胞中表达；并且b)从(a)的大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。

本发明的另一个方面提供了一种用于在大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中表达，由此相对于对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞在大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。

在一个另外的方面，本发明提供了一种用于减少大豆植物或其部分中的大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物细胞中表达；并且b)从(a)的大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

本发明的另外的方面提供了包括用于转化植物、植物部分和/或植物细胞的核酸构建体的组合物，并且提供了经转化的植物、植物部分和/或其植物细胞。

本发明的这些以及其他方面将在以下的本发明的描述中更详细地说明。

附图简述

附图1展示了大豆gma-MIR164序列（前体序列）。从该前体加工而来的成熟miRNA gma-miR164序列加了下划线。

附图2A-B展示了表达载体15312prCMP-miR164-tNOS（附图2A）以及B-15312-prAR6-cGUS-tNOS（附图2B）。prCMP是香树属病毒启动子（参见例如美国专利号7,166,770）；prAR6拟南芥属属根启动子（参见例如美国专利号7,615,624）；tNOS是来自根瘤农杆菌的nos基因的终止子；并且cGUS是一个β-葡萄糖苷酸酶报告基因。

附图3是显示了gma-miR164的过表达对大豆胞囊线虫（SCN）胞囊形成的影响的数据图。

附图4是显示了miR396b的过表达对转基因的毛状根上的胞囊发展的影响的图。

发明详细说明

本说明不意在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个特别实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域内的普通技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明意在阐述本发明的一些特别实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有变更、组合或变体。

除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本发明的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此处的本发明的说明中使用的术语是仅用于描述特别实施例的目的并且不意在限制本发明。

在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文结合在此。

如在此使用的，“一种/一个（a/an）”或“该”（the）可以表示一或多于一。例如，一种细胞可以表示单一的细胞或许多细胞。

如在此使用的，“和/或”表示并包括一个或多个相关地列出的项的任何的与所有的可能组合，并且当用可替代地（或）解释时组合的缺少。

此外，在此使用的术语“大约（about）”当指可测量的值（比如化合物、试剂、剂量、时间、温度等等的量）时，意为包括具体值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。

如在此使用的，过渡型短语“基本上由…….组成”表示一种权利要求的范围是要解释为包括该权利要求中所述的指定材料或步骤以及并不实质上影响本发明的一种或多种基本特征或新颖特征的那些。因此，术语“基本上由……组成”当用于本发明的权利要求中时，并不意在解释为与“包括”（comprising）等同。

应当理解：尽管术语“第一（first）”、“第二（second）”等等在此可以用来描述不同要素，但是这些要素不应该受这些术语限制。这些术语仅用以将一个要素与另一个要素进行区分。因此，在此描述的“第一”要素（例如，第一启动子序列）还可以称作“第二”要素（例如，第二启动子序列），这不背离本发明的传授内容。

微小RNA（miRNA）是非蛋白编码RNA，大体在大约19个核苷酸至大约25个核苷酸之间（在植物中通常是大约20-24个核苷酸）。miRNA以靶标转录本的反式指导切割，由此调节不同的调节与发育通路中所涉及的基因的表达（Bartel,Cell（《细胞》），116:281-297（2004）；Zhang等人Dev.Biol（《发育生物学》）289:3-16（2006））。miRNA已经显示参与植物生长与发育的不同方面以及信号转导与蛋白降解。另外，日益增长的证据说明：小内源mRNA（包括miRNA）还可以参与生物胁迫反应，比如寄生体袭击。自从在植物中发现了首个miRNA（Reinhart等人Genes Dev（《基因与发育》）16:1616-1626（2002），Park等人Curr.Biol（《生物学现况》）12:1484-1495（2002）），至今已经鉴定了数百种。此外，许多植物miRNA已经显示出跨十分趋异的分类群的高度保守性。（Floyd等人Nature（《自然》）428:485-486（2004）；Zhang等人Plant J（《植物杂志》）46:243-259（2006））。许多微小RNA的基因（MIR基因）已经得以鉴定并且在数据库（“miRBase”，在线可用，microrna.sanger.ac.uk/sequences）中公开可得。miRNA还描述于美国专利公开2005/0120415以及2005/144669A1中，将其全部内容通过引用结合于此。

编码miRNA的基因产生70bp至300bp长度的初级miRNA（“pri-miRNA”），其可以形成不完全的茎环结构。单个pri-miRNA可以包含从一至若干个miRNA前体。在动物中，pri-miRNA在细胞核中通过RNaseIII酶Drosha及其辅助因子DGCR8/Pasha而被加工成较短的大约65个核苷酸的发夹RNA（称作前体miRNA（pre-miRNA））。然后该pre-miRNA输出至细胞质，在这里它被另一种RNaseIII酶Dicer进行进一步加工，释放出一种大约22nt大小的miRNA/miRNA*双链体。与动物相比，在植物中，pri-miRNA成为成熟miRNA的加工完全发生在细胞核里，利用一种单一的RNaseIII酶DCL1（Dicer样1）。（Zhu.Proc.Natl.Acad.Sci（《美国科学院院刊》）105:9851-9852（2008））。许多关于微小RNA生物发生与功能的综述是可得的，例如参见，Bartel.Cell（《细胞》）116:281-297（2004），Murchison等人Curr.Opin.Cell Biol.（《细胞生物学现行观点》）16:223-229（2004），Dugas等人Curr.Opin.Plant Biol（《植物生物学现行观点》）7:512-520（2004）以及Kim.Nature Rev.Mol.Cell Biol.（《自然-分子细胞生物学综述》）6:376-385（2005）。

本发明涉及这样的发现：特别的异源植物miRNA在植物中的过表达可以导致对寄生体（比如大豆胞囊线虫（SCN））的增加的抗性。

如此，在一些实施例中，本发明提供了一种用于产生对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞的方法，该方法包括将一种异源miRNA核苷酸序列引入该植物、植物部分和/或植物细胞中，其中该异源miRNA核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照植物、植物部分和/或植物细胞对该植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞。在一些实施例中，该植物是一种大豆植物。

在一些实施例中，该异源miRNA核苷酸序列是一种植物miRNA。非限制性的实例包括以下植物miRNA的任何家族成员：miR156、miR159、miR160、miR161、miR162、miR163、miR164、miR165、miR166、miR167、miR168、miR169、miR170、miR171、miR172、miR173、miR319、miR390、miR393、miR395、miR396、miR397、miR398、miR399、miR408、和/或miR447。

本发明的miRNA另外地包括在大豆根中得以鉴定的miRNA。因此，大豆根miRNA的非限制性实例包括gma-MIR1507a（MI0007219）、gma-MIR1507b（MI0010573）、gma-MIR1508a（MI0007220）、gma-MIR1508b（MI0010574）、gma-MIR1509a（MI0007221）、gma-MIR1509b（MI0010730）、gma-MIR1510a（MI0007222）、gma-MIR1510b（MI0010575）、gma-MIR1511（MI0007223）、gma-MIR1512（MI0007224）、gma-MIR1513（MI0007225）、gma-MIR1514a（MI0007226）、gma-MIR1514b（MI0007227）、gma-MIR1515（MI0007228）、gma-MIR1516（MI0007229）、gma-MIR1517（MI0007230）、gma-MIR1518（MI0007231）、gma-MIR1519（MI0007232）、gma-MIR520d（MI0007233）、gma-MIR1520a（MI0007235）、gma-MIR1520b（MI0007243）、gma-MIR1520c（MI0007252）、gma-MIR1520e（MI0016484）、gma-MIR1520f（MI0016485）、gma-MIR1520g（MI0016486）、gma-MIR1520h（MI0016496）、gma-MIR1520i（MI0016498）、gma-MIR1520j（MI0016504）、gma-MIR1520k（MI0016532）、gma-MIR1520l（MI0016533）、gma-MIR1520m（MI0016534）、gma-MIR1520n（MI0016536）、gma-MIR1520o（MI0016537）、gma-MIR1520r（MI0016554）、gma-MIR1520p（MI0016563）、gma-MIR1520q（MI0016573）、gma-MIR1521（MI0007236）、gma-MIR1522（MI0007237）、gma-MIR1523（MI0007240）、gma-MIR1524（MI0007241）、gma-MIR1525（MI0007242）、gma-MIR1526（MI0007244）、gma-MIR1527（MI0007245）、gma-MIR1528（MI0007246）、gma-MIR1529（MI0007248）、MIR1530（MI0007249）、gma-MIR1531（MI0007250）、gma-MIR1532（MI0007251）、gma-MIR1533（MI0007253）、gma-MIR1534（MI0007254）、gma-MIR1535（MI0007257）、gma-MIR1536（MI0007234）、gma-MIR171b（MI0007217）、gma-MIR482a（MI0007218）、gma-MIR482b（MI0016527）、gma-MIR845、gma-MIR894、gma-MIR1055、gma-MIR156dMI0001770）、gma-MIR156e（M0001771）、gma-MIR156c（MI0001772）、gma-MIR156a（MI0001784）、gma-MIR156b（MI0001790）、gma-MIR156f（MI0016559）、gma-MIR156g（MI0016580）、gma-miR159a（MI0001773）、gma-miR159b（MI0007206）、gma-miR159c（MI0007207）、gma-miR159d（MI0016581）、gma-miR160（MI0001774）、gma-miR162（MI0007208）、gma-miR164（MI0007209）、gma-miR166a（MI0001775）、gma-miR166b（MI0001776）、gma-MIR167a（MI0001777）、gma-MIR167b（MI0001778）、gma-MIR167c（MI0007210）、gma-MIR167d（MI0010571）、gma-MIR167e（MI0010725）、gma-MIR167f（MI0010726）、gma-MIR167g（MI0016548）、gma-miR168（MI0001779）、gma-MIR169a（MI0001791）、gma-MIR169b（MI0007211）、gma-MIR169c（MI0007212）、gma-MIR169d（MI0016571）、gma-MIR169e（MI0016576）、gma-miR171a（MI0007213）、gma-miR171b（MI0007217）、gma-miR171c（MI0016575）、gma-MIR172a（MI0001780）、gma-MIR172b（MI0001781）、gma-MIR172c（MI0010727）、gma-MIR172d（MI0010728）、gma-MIR172e（MI0010729）、gma-MIR172f（MI0016574）、gma-miR319a（MI0001782）、gma-miR319b（MI0001783）、gma-miR319c（MI0001789）、gma-miR390a（MI0007214）、gma-miR390b（MI0007215）、gma-miR393（MI0007216）、gma-MIR396a（MI0001785）、gma-MIR396b（MI0001786）、gma-MIR396c（MI0010572）、gma-MIR396d（MI0016503）、gma-MIR396e（MI0016586）、和/或gma-miR397。

本发明的miRNA还包括miRNA164家族的成员。miRNA164家族成员的非限制性的实例包括aly-MIR164a（MI0014527）、aly-MIR164b（MI0014528）、aly-MIR164c（MI0014529）、ath-MIR164aMI0000197）、ath-MIR164b（MI0000198）、ath-MIR164c（MI0001087）、bna-MIR164（MI0006478）、bra-MIR164a（MI0010651）、csi-MIR164（MI0013295）、ctr-MIR164（MI0013306）、far-MIR164a（MI0016611）、far-MIR164b(MI0016617）、ghr-MIR164（MI0013538）、gma-MIR164（MI0007209）、mtr-MIR164a（MI0005573）、mtr-MIR164b（MI0005612）、mtr-MIR164c（MI0005616）、mtr-MIR164d（MI0005617）、osa-MIR164a（MI0000668）、osa-MIR164b（MI0000669）、osa-MIR164c（MI0001103）、osa-MIR164d（MI0001104）、osa-MIR164e（MI0001105）、osa-MIR164f（MI0001159）、ptc-MIR164a（MI0002212）、ptc-MIR164b（MI0002213）、ptc-MIR164c（MI0002214）、ptc-MIR164d（MI0002215）、ptc-MIR164e（MI0002216）、ptc-MIR164f（MI0002217）、rco-MIR164a（MI0013382）、rco-MIR164b（MI0013383）、rco-MIR164c（MI0013384）、rco-MIR164d（MI0013385）、sbi-MIR164a（MI0001512）、sbi-MIR164b（MI0001549）、sbi-MIR164c（MI0001852）、sbi-MIR164d（MI0010865）、sbi-MIR164e（MI0010866）、tae-MIR164（MI0006173）、vvi-MIR164a（MI0006503）、vvi-MIR164b（MI0006504）、vvi-MIR164c（MI0006505）、vvi-MIR164d（MI0006506）、zma-MIR164a（MI0001469）、zma-MIR164b（MI0001471）、zma-MIR164c（MI0001472）、zma-MIR164d（MI0001470）、zma-MIR164a（MI0001469）、zma-MIR164b（MI0001471）、zma-MIR164c（MI0001472）、zma-MIR164d（MI0001470）、zma-MIR164e（MI0013193）、zma-MIR164f（MI0013194）、zma-MIR164g（MI0013195）、和/或zma-MIR164h（MI0013196）。

在其他实施例中，本发明提供了一种用于产生对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞的方法，该方法包括将一种异源miR164核苷酸序列引入该植物、植物部分和/或植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照植物、植物部分和/或植物细胞对该寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞。

如在此使用的，“植物（plant）”意为任何植物并且因此包括，例如被子植物、裸子植物、苔藓植物、厥类和/或拟蕨类。本发明的植物的非限制性实例包括大豆、一般豆类、谷物、谷类作物（包括但不限于大麦、黑麦、燕麦、小麦等等）、芸薹属物种、三叶苜蓿、可可、咖啡、棉花、亚麻、玉米、粟、花生、油菜/卡罗拉（canola）、稻、黑麦、红花、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、甘薯、茶、蔬菜（包括但不限于西兰花、芽甘蓝、甘蓝、胡萝卜、木薯、花椰菜、瓜类作物、滨豆、莴苣、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜以及番茄）、草、果实（包括但不限于苹果、梨、桃、杏与柑橘属、鳄梨、香蕉、椰子、菠萝以及核桃）；以及花（包括但不限于康乃馨、兰花、玫瑰），以及其任意组合。

本发明的另外的实例是易受大豆胞囊线虫感染的任何植物物种或植物品种，包括但不限于石竹（China pinks）、可食用豆类、胡枝子属、野豌豆（普通、多毛或冬季）、羽扇豆、三叶苜蓿（深红、猩红或杂种三叶苜蓿）、草木樨、百脉根、小冠花、豌豆、豇豆（cowpea）、豇豆（black-eyed pea）、大豆（野生的与栽培的）、刺槐、皂荚树、马齿苋属、爱尔兰风铃草、普通繁缕（common chickweed）、鼠耳繁缕（mousear chickweed）、毛蕊花属、sicklepod、Digitalis penstemon、商陆、马齿苋、野荠菜、落基山蜜源植物（RockyMountain beeplant）、斑点天竺葵、云兰属植物（toadflax）、有翼藜草、补骨脂属物种（Psoralea spp.）、锯齿醉蝶花（Cleome serrulata）、野豌豆（美洲、卡罗莱纳或木）、金花菜（小苜蓿（Medicago minima））、繁缕（卷耳（Cerastiumvulgatum））、dalea、加拿大紫云英、大果田菁、琉璃苣、金丝雀花、杯花（cupflower）、黄蒿子、灯笼草、蓝宝石剪秋萝（blue gem viscaria）、珊瑚钟（coralbell）、玛格丽特双康乃馨（Margaret double carnation）、野蔷薇（Rosamultiflora）、粉红女王（pink queen）、天竺葵（斑点老鹳草（Geraniummaculatum））、杯花（cup-flower）、飞燕草、洋地黄、水杨梅、普通夏至草、罂粟、鼠尾草、金鱼草、钓钟柳（Penstemon digitalis）、Desmodium nudifolorum、D.marilandicum、D.viridiflorum、麦仙翁（corn cockle）、紫花罗勒、香豌豆、马鞭草、宝盖草（宝盖草（Lamium amplexicaule））、小野芝麻（小野芝麻（Lamium purpureum））、败酱草（遏蓝菜（Thlaspi arvense））、荠菜（荠菜（Capsella bursa-pastoris））、黄花苜蓿、乞丐杂草（beggars weed）、山毛榉（tickclover）、麦仙翁、猪花生、乳豆以及野豆（Strophostyles helvola）。

如在此使用的，术语“植物部分”包括但不限于，胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药、植物细胞（包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞）、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团（plant clumps）、以及类似物。此外，如在此使用的，“植物细胞”指该植物的一种结构和生理单元，该单元包含一种细胞壁并且还可以指一种原生质体。本发明的植物细胞可以处于一种分离的单细胞形式，或者可以是一种培养细胞，或者可以是作为较高级的组织单位（例如，一种植物组织或一种植物器官）的一部分。

如在此使用的术语“寄生体”包括但不限于线虫植物有害生物、昆虫植物有害生物以及真菌与细菌植物病原体。线虫类有害生物的非限制性实例包括胞囊线虫（异皮线虫属物种（Heterodera spp.）），尤其是大豆胞囊线虫（大豆胞囊线虫（Heterodera glycines））、根结线虫（根结线虫属物种（Meloidogynespp.））、柳叶刀线虫（纽带线虫属物种（Hoplolaimus spp.））、矮化线虫（矮化线虫属物种（Tylenchorhynchus spp.））、螺旋线虫（螺旋线虫属物种（Helicotylenchus spp.））、腐线虫（短体线虫属物种（Pratylenchus spp.））、刺线虫（Belonoluimus spp.）、肾状线虫（肾形线虫（Rotylenchulus reniformis））、穴居线虫（香蕉穿孔线虫（Radopholus similis））以及环线虫（环线虫属物种（Criconema spp.））。

真菌类植物病原体的非限制性实例包括亚洲锈菌（葛锈病菌（Phakosporapachyrhizi））、大豆猝死菌（茄病镰刀菌（Fusarium solani））、白霉（油菜菌核病菌（Sclertinia sclerotiorum））、茎褐腐病菌（大豆茎褐腐病菌（Phialophoragregata））、茎与根腐病菌（Phytophthora sojae）、谷物普通锈菌（高粱柄锈菌（Puccinia sorghi））。其他真菌类病原体包括但不限于Alubgo spp.、疫霉属物种（Phytophthora spp.）、腐霉属物种（Pythium spp.）、丝囊霉属物种（Aphanomyces spp.）、霜霉属物种（Peronospora spp.）。

昆虫类植物有害生物的非限制性实例包括鳞翅目昆虫，包括玉米螟（Ostrinia nubilalis）（欧洲玉米螟）、小菜蛾（Plutella xylostella）（菱形斑纹蛾）、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）（秋夜蛾）、小地老虎（Agrotis ipsilon）（黑色地老虎）、谷实夜蛾（Helicoverpa zea）（玉米穗蛾）、烟芽夜蛾（Heliothisvirescens）（烟夜蛾）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）（甜菜夜蛾）、巨座玉米螟（Diatraea grandiosella）（西南玉米螟）、小蔗螟（Diatraea saccharalis）（甘蔗螟）、Sesamia nonagroides（地中海玉米螟）、茶色铃夜蛾（Helicoverpapunctigera）（原生夜蛾）以及棉铃虫（Helicoverpa armigera）（棉花螟蛉）；以及鞘翅目昆虫，包括玉米根虫（Diabrtoica spp.）、金针虫（梳爪叩头虫属物种（Melanotus spp.））、白色金针虫（Aeolus spp.）、玉米象甲（里维斯尖隐喙象（Sphenophorus callus））以及白色蛴螬（鳃角金龟属（Phyllophagaspp.））。

如此，在一些实施例中，本发明提供了一种用于产生对植物寄生体具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞的方法，该方法包括将一种异源miRNA核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miRNA核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中表达，由此产生一种相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对该寄生体具有增加的抗性的大豆转基因植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

如此，在一些实施例中，本发明提供了一种用于产生对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞的方法，该方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。异源miR164核苷酸序列的一个非限制性实例是SEQ ID.NO:1的核苷酸序列。如此，在本发明的一些实施例中，提供了一种用于产生对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞的方法，该方法包括：将一种编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞，其中该异源核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于未经该编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

如在此使用的，“异源的”指一种核苷酸序列，该序列来源于另一种物种或来自相同物种或生物体，但是对其原初形式或在细胞中表达的初始形式进行了修饰。如此，衍生自与将其引入的细胞所属的生物体或物种不同的生物体或物种的核苷酸序列相对于那个细胞或细胞的子代而言是异源的。另外，异源核苷酸序列包括这样的一种核苷酸序列，它衍生自或插入相同的天然原初细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在自然界中天然发现的那些所不同的调节序列的控制下。

如在此使用的，术语“增加（increase）”、“增加的（increased）”、“增强（enhance）”、“增强的（enhanced）”、“增强的（enhancing）”以及“增强（enhancement）”（以及其语法上的变体）描述了一种植物对一种寄生体抗性的增加（例如，对大豆胞囊线虫具有增加的抗性的大豆植物），这是通过将本发明的异源miRNA核苷酸序列引入该植物来进行的，由此产生一种对该寄生体具有增加的抗性的转基因植物。这一增加可以通过将经本发明的异源miRNA核苷酸序列转化的植物的抗性与未经本发明的异源miRNA核苷酸序列转化的植物（例如，大豆）相比较而观察到（例如，经异源miR164核苷酸序列转化的大豆植物与未经异源miR164核苷酸序列转化的大豆植物相比较）。

在本发明的一些实施例中，异源miRNA核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中过表达，由此产生一种相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照的植物、植物部分和/或植物细胞对寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞。在本发明的一些实施例中，该异源miRNA是miR164。在又其他实施例中，该miRNA是gma-miR164。

如此，在本发明的一些实施例中，该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中过表达，由此产生一种相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的植物、植物部分和/或植物细胞对寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞。

如此，在本发明的另外的实施例中，该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中过表达，由此产生一种相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

如在此使用的，术语“过表达的（overexpressed）”、“过表达（overexpression）”及其语法上的变体指一个比正常生理水平更高的表达水平。如此，经本发明的一种核苷酸序列（例如，一种包含miRNA核苷酸序列（例如，miRNA164）的构建体）转化的一种植物、植物部分和/或植物细胞以比未经本发明的该核苷酸序列转化的一种植物、植物部分和/或植物细胞所表达的水平更高的水平表达该构建体的产物。过表达可以在任何发育和/或时间阶段来比较或确定。

因此，过表达可以在正常情况下缺少一种核酸分子或核苷酸序列的植物、植物部分和/或植物细胞中发生，该核酸分子或核苷酸序列在功能上与本发明的核酸分子或核苷酸序列（例如，miR164）相当或相同。过表达还可以在这样的植物、植物部分和/或植物细胞中发生，其中本发明的该核酸分子或核苷酸序列或功能上相当的核酸分子或核苷酸序列的内源表达正常发生，但是此种正常表达比本发明的一种核酸分子或核苷酸序列的表达水平更低。因此过表达在该植物、植物部分和/或植物细胞中导致该核酸分子或核苷酸序列的产物比正常产量更高，或“过量产生”。

该过表达可以是组成型的，或可替代地，本发明的该（这些）核酸能够以组织特异性方式和/或从一种可诱导型启动子来进行表达，该可诱导型启动子包括响应于外部刺激（比如化学施加和/或寄生体感染）的启动子。如此，取决于所使用的启动子，过表达可以在一种植物各处、在该植物的特异性组织和/或存在或不存在特定环境信号下发生。在本发明的一个实施例中，所采用的启动子可以是在寄生体感染后快速地且短暂地和/或高度地转录的。在一些特别实施例中，该启动子是一种根特异性启动子。在植物中起功能的启动子在本领域内是熟知的，如在此所描述的。

如在此使用的，术语“核酸（nucleic acid）”、“核苷酸分子（nucleic acidmolecule）”和/或“核苷酸序列（nucleotide sequence）”指核一种核苷酸异聚体或来自一种核酸分子的5'至3'末端的这些核苷酸的序列并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段、基因组DNA、合成（例如，化学合成）DNA、质粒DNA、mRNA以及反义RNA，其中的任一项都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”（oligonucleotide）以及“多核苷酸”（polynucleotide）在此还可以互换地使用来指一种核苷酸的异聚体。在此提供的核酸序列在此以5’至3’方向、从左至右存在，并且使用如在美国专利商标局（U.S.Patent and Trademark Office），37CFR§§1.821-1.825以及世界知识产权组织标准ST.25（World Intellectual PropertyOrganization（WIPO）Standard ST.25）中所阐明的用于表示核苷酸字符的标准编码来示出。

如在此使用的，术语“基因（gene)”指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA等等的核酸分子。基因可以能或不能使用来产生功能蛋白或基因产物。基因可以包括编码与非编码的区域（例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'已经3'非翻译区域）。基因可以是“分离的（isolated）”，这意为一种核酸，其实质上或基本上没有正常情况下发现与其天然状态时的核酸相关联的组分。此类组分包括其他细胞材料、来自重组产物的培养基、和/或在化学合成该核酸中所使用的多种化学品。

如在此使用的，术语“互补（complementary）”或“互补性（complementarity）”指在许可的盐以及温度条件下通过碱基配对各多核苷酸的天然结合。例如，序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。两单链分子之间的互补性可以是“部分的（partial）”，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时该互补性可以是完全的。各核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率与强度具有显著影响。

术语“核酸片段（nucleic acid fragment）”应理解为意为一种相对于参考核酸或核苷酸序列长度减少的核苷酸序列并且包括与该参考核酸或核苷酸序列一致或几乎一致（例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、99%一致性）的连续核苷酸的核苷酸序列，或基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明的此一种核酸片段在适当时可以包括在一种更大的多核苷酸中，在该多核苷酸中该核酸片段是一个构成物。在一些实施例中，此类片段可以包含具有根据本发明的核酸或核苷酸序列的至少大约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、或1000个连续核苷酸长度的寡核苷酸，或基本上由其组成和/或由其组成。

本发明的“分离的”核酸大体上没有该核酸衍生自其中的生物体的基因组DNA中的该感兴趣的核酸的侧翼核酸序列（比如存在于5'或3'末端的编码序列）。然而，本发明的该核酸可以包括一些另外的碱基或部分，它们不会有害地影响该核酸的碱基结构和/或功能特征。“分离的”不意味着该制备是工业纯（同质）的。

如此，“分离的核酸”以一种不同于其在自然界中发现的那样的形式或背景存在并且并不与它在其中衍生自的生物体的天然发生的基因组中紧密连续（一个在5'末端并且一个在3'末端）的核苷酸序列紧密连续。因此，在一个实施例中，一个分离的核酸包括一些或全部的5'非编码（例如，启动子）序列，这些序列紧接编码序列。该术语因此包括，例如，一种重组核酸，它结合进入一种载体、进入一种自我复制的质粒或病毒、或进入一种原核生物或真核生物的基因组DNA，或者它作为独立于其他序列的一种单独分子（例如，一种cDNA或一种利用PCR或限制性内切核酸酶处理所得到的基因组DNA片段）而存在。如此，在自然界中发现的、从其原生环境中移除并且转化进入植物的核酸仍被认为是“分离的”，甚至当其结合进入所产生的转基因植物的基因组中的时候。它还包括一种重组核酸，该重组核酸是对一种另外的多肽或肽序列进行编码的杂种核酸的部分。

术语“分离的”可以进一步指一种核酸、核苷酸序列、多肽、肽或片段，它们实质上无细胞材料、病毒材料、和/或培养基（例如，当通过重组DNA技术生产时）、或化学前体或其他化学品（例如，当进行化学合成时）。而且，“分离的片段”是核酸、核苷酸序列或多肽的一种片段，它不是作为片段而自然发生的并且不会按照原样以自然状态被发现。“分离的”不意味着该制备是工业纯的（同质的），但是它是足够地纯以提供处于一种可以用于预期目的的形式的多肽或核酸。

在本发明的代表性实施例中，“分离的”核酸、核苷酸序列、和/或多肽是至少大约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%纯（w/w）或更纯。在其他实施例中，“分离的”核酸、核苷酸序列、和/或多肽表示与该起始材料相比，达到了该核酸至少大约5-倍、10-倍、25-倍、100-倍、1000-倍、10,000-倍、100,000-倍或更高倍数的富集（w/w）。

术语“多肽（polypeptide）”、“蛋白（protein）”和“肽（peptide）”指一种共价地连接的氨基酸链。总体上，术语“（peptide）”可以指更短的氨基酸链（例如，2-50个氨基酸）；然而，所有三个术语在该氨基酸链长度方面重叠。如在此所用，术语“蛋白”与“多肽”是互换地使用并且包括肽，除非另外说明。多肽、蛋白以及肽可以包括自然发生的氨基酸、非自然发生的氨基酸、或两者的一种组合。这些多肽、蛋白以及肽可以分离自它们自然发生于其中的来源（例如细胞或组织），可以在活体内或体外细胞中或者在体外试管中进行重组生产，或者进行化学合成。此类技术对于那些本领域内的普通技术人员是已知的。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual2nd Ed.（《分子克隆：实验室手册第二版》）（Cold SpringHarbor,NY,1989）（冷泉港，纽约，1989）；Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology（《分子生物学现行方案》）（Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York）（格林出版联合公司以及约翰威利父子公司，纽约）。

术语“片段（fragment）”，如适用于多肽，应理解为意为一种相对于参考多肽或氨基酸序列长度减少的氨基酸序列并且包含与该参考多肽或氨基酸序列一致的连续氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成和/或由其组成。根据本发明的此一种多肽片段在适当时可以包括在一种更大的多肽中，在该多肽中该多肽片段是一个构成午。在一些实施例中，此类片段可以包含具有根据本发明的多肽或氨基酸序列的至少大约4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或更多个连续氨基酸长度的肽，或基本上由其组成和/或由其组成。可以通过本领域内熟知的方法与路径来产生多肽或蛋白的片段，比如，通过天然发生的肽或多肽的酶切或其他切割或者通过熟知的合成方案。

多肽片段可以是生物活性片段。“生物活性片段（biologically activefragment）”或“活性片段（active fragment）”指一种保留了参考多肽的一种或多种生物活性的片段。此类片段的生物活性可以根据本领域内描述的方法（这是用于测试多肽活性的常规方法）和/或根据用于鉴定此类活性的任何技术已知的与常规的方法来测试。多肽的生物活性片段的产生与鉴定测试会很好地处在本领域内的普通技术人员的范围之内并且会是常规的。如此，本发明进一步提供了多肽（比如感兴趣的多肽）的生物活性片段以及编码此类生物活性多肽片段的多核苷酸。

如在此使用的，术语“转基因（transgene）”指在植物、动物或其他生物体的转化中使用的任何核酸序列。如此，转基因可以是一种编码序列、非编码序列、cDNA、基因或其片段或部分、基因组序列、调节元件，等等。“转基因的（transgenic）”生物体，比如转基因植物、转基因微生物、或转基因动物，是一种向其中已经递送了或引入了转基因的生物体并且该转基因可以在该转基因生物体中表达以产生一种产物，该产物的存在可以在该生物体中赋予一种效果和/或表型。

具有同源性的不同核酸或多肽在此指做“同源物（homologues）”。术语同源物包括来自相同或其他物种的同源序列以及来自相同或其他物种的直系序列。“同源性（Homology）”指就位置一致性（即，序列相似性或一致性）而言两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性还指不同核酸或蛋白之间相似功能特性的概念。

如在此使用的“序列一致性（sequence identity）”指在整个组元（例如，核苷酸或氨基酸）比对窗口中两个经最佳化比对的多核苷酸或多肽序列无变化的程度。“一致性（identity）”可以通过已知方法容易地计算出，这些方法包括但不限于描述于以下文献中那些：Computational Molecular Biology（《计算分子生物学》）（Lesk,A.M.,ed.）Oxford University Press（牛津大学出版社），New York（纽约）（1988）；Biocomputing:Informatics and Genome Projects（《生物计算信息与基因组预测》）（Smith,D.W.,ed.）Academic Press（《学术出版社》），New York（纽约）（1993）；Computer Analysis of Sequence Data,Part I（《序列数据的计算分析，部分I》）（Griffin,A.M.，以及Griffin,H.G.,eds.）Humana Press（Humana出版社），New Jersey（新泽西州）（1994）；SequenceAnalysis in Molecular Biology（《分子生物学中的序列分析》）（von Heinje,G.,ed.）Academic Press（学术出版社）（1987）；以及Sequence Analysis Primer（《序列分析引物》）（Gribskov,M.以及Devereux,J.,eds.）Stockton Press（Stockton出版社），New York（纽约）（1991）。

测试序列与参考序列的比对区段的“一致性分数（identity fraction）”是两个比对序列共享的一致组元的数目除以参考序列区段中组元的总数目（即，整个参考序列或该参考序列的较小定义部分）。如在此使用的，术语“序列一致性百分数（percent sequence identity）”或“一致性百分数（percentidentity）”指两序列最佳化比对时（具有适当的核苷酸插入、缺失、或缺口，总共少于整个比较窗口中的参考序列的20%），与测试（“对象”（subject））多核苷酸分子（或其互补链）相比较，参考（“查询”（query））多核苷酸分子（或其互补链）的线性多核苷酸序列中一致核苷酸的百分数。在一些实施例中，“一致性百分数”可以指氨基酸序列中一致氨基酸的百分数。

对于比对比较窗口而言的最佳的序列比对对于本领域内的普通技术人员是熟知的并且可以通过工具（比如Smith与Waterman的局部同源性算法、Needleman与Wunsch的同源性比对算法、Pearson与Lipman的相似性搜索方法）来进行，以及可任选地通过这些算法的计算机化实施（比如作为

Wisconsin

（Accelrys Inc.,Burlington（伯灵顿），Mass.（马萨诸塞州））的一部分可得的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA）来进行。测试序列与参考序列的比对区段的“一致性分数”是两个比对序列共享的一致组元的数目除以该参考序列区段中组元的总数目（即，整个参考序列或该参考序列的较小定义部分）。序列一致性百分数表示为该一致性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列可以与全长多核苷酸序列或其部分比较，或者与更长的多核苷酸序列比较。出于本发明的目的，“一致性百分数”还可以使用针对经翻译的核苷酸序列的BLASTX2.0版以及针对多核苷酸序列的BLASTN2.0版来进行确定。

序列一致性的百分数可以使用Sequence Analysis Software PackageTM（版本10；Genetics Computer Group,Inc.（基因计算基团公司），Madison（麦迪逊），Wis.（威斯康辛州））的“Best Fit”或“Gap”程序来进行确定。“Gap”利用Needleman与Wunsch的算法（Needleman与Wunsch,J Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）48:443-453,1970）来寻找使匹配数目最大化并且使缺口数目最小化的两序列比对。“Best Fit”执行两序列之间的相似性最大区段的优化比对并且插入缺口以使用Smith与Waterman的局部同源性算法（Smith与Waterman,Adv.Appl.Math.（《应用数学进展》），2:482-489,1981，Smith等人，Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）11:2205-2220,1983）使匹配数目最大化。

对于确定序列一致性有用的方法还披露于Guide to Huge Computers（《大型计算机指南》）（Martin J.Bishop,ed.,Academic Press（学术出版社），SanDiego（圣地亚哥）（1994)），以及Carillo,H.，与Lipton,D.,Applied Math（《应用数学》）48:1073（1988））。更具体地，用于确定序列一致性的优选计算机程序包括但不限于：Basic Local Alignment Search Tool（基本局部比对搜索工具，BLAST），其在the National Library of Medicine,National Institute of Health,Bethesda,Md.20894（美国国立卫生研究院医学信息库，贝塞斯达，Md.20894）的National Center Biotechnology Information（美国生物技术信息中心，NCBI）公开可用；参见BLAST Manual（《BLAST手册》），Altschul等人，NCBI，NLM，NIH；（Altschul等人，J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）215:403-410（1990））；2.0版或更高版本的BLAST程序允许将缺口（缺失或插入）引入比对；对于肽序列而言BLASTX可以用以确定序列一致性；并且对于多核苷酸序列而言BLASTN可以用以确定序列一致性。

因此，本发明进一步提供了与本发明的核苷酸序列具有显著序列一致性的核苷酸序列。显著的序列相似性或一致性意为与另一个核苷酸序列至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%、99%和/或100%的相似性或一致性。

本发明的另外的方面提供了一种用于在植物或其部分中增加对寄生体的抗性的方法，该方法包括：a)将一种异源miRNA核苷酸序列引入一种植物细胞中以产生一种转基因植物细胞，其中该异源miRNA核苷酸序列在该转基因植物细胞中表达；并且b)从(a)的转基因植物细胞再生一种转基因植物或其部分，其中该转基因植物和/或其部分在其基因组中包含该异源miRNA核苷酸序列并且相对于未用该异源miRNA核苷酸序列转化的对照植物、植物部分和/或植物细胞对该植物寄生体具有增加的抗性。

在本发明的一些实施例中，该miRNA是miR164。在本发明的另一些实施例中，该miRNA是如在此描述的另一种植物miRNA。在另外的实施例中，该miRNA是一种如在此描述的被鉴定为在根中表达的miRNA。

本发明的另外的方面提供了一种用于在植物或其部分中增加对寄生体的抗性的方法，该方法包括：a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种植物细胞中以产生一种转基因植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该转基因植物细胞中表达；并且b)从(a)的转基因植物细胞再生一种转基因植物或其部分，其中该转基因植物和/或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于未用该异源miR164核苷酸序列转化的对照植物、植物部分和/或植物细胞对该植物寄生体具有增加的抗性。

如此，在本发明的具体实施例中提供了用于在大豆植物或其部分中增加对大豆胞囊线虫寄生的抗性的方法，这些方法包括：a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因大豆植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该转基因植物细胞中表达；并且b)从(a)的转基因大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于未用该异源miR164核苷酸序列转化的对照大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。异源miR164核苷酸序列的一个非限制性实例是SEQ ID.NO:1的核苷酸序列。

如此，在本发明的一些实施例中提供了一种用于在大豆植物和/或其部分中增加对大豆胞囊线虫寄生的抗性的方法，该方法包括：a)将一种编码SEQID NO:1的核苷酸序列的异源核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因大豆植物细胞，其中该SEQ ID NO:1的核苷酸序列在该转基因植物细胞中表达；并且b)从(a)的转基因大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该编码SEQID NO:1的核苷酸序列的异源核苷酸序列并且相对于未用该编码SEQ IDNO:1的核苷酸序列的异源核苷酸序列转化的对照大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。

如上述，在本发明的一些实施例中，该异源miRNA核苷酸序列在该转基因植物、植物部分和/或植物细胞中过表达，由此产生一种相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照的植物、植物部分和/或植物细胞对寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞。在本发明的一些实施例中，该异源miRNA核苷酸序列是miR164。

如此，在本发明的一些实施例中，该异源miR164核苷酸序列在该转基因植物、植物部分和/或植物细胞中过表达，由此产生一种相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的植物、植物部分和/或植物细胞对寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞。

在本发明的具体实施例中，该异源miR164核苷酸序列在该转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中过表达，由此产生一种相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

在上下文中，所感兴趣的一种核苷酸序列（例如，miR164）的“引入（introducing）”意为将该感兴趣的核苷酸序列提供给该植物、植物部分和/或植物细胞，其方式为该核苷酸序列进入细胞内部。在有待引入一种以上的核苷酸序列的情况下，这些核苷酸序列可以作为一种单一的多核苷酸或核酸构建体的部分、或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体而进行组装，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中，或作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入到植物细胞中。因此，如在此使用的术语“转化（transformation）”指将异源核酸引入细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。

在多核苷酸背景下的“瞬时转化（transient transformation）”意为：一种多核苷酸被引入细胞中并且不整合进入该细胞的基因组中。

在被引入细胞中的多核苷酸的背景下，“稳定转化（stably introducing）”或“稳定引入（stably introduced）”意在指稳定地结合进入该细胞的基因组的被引入的多核苷酸，并且由此该细胞经该多核苷酸进行了稳定转化。

如在此使用的，“稳定转化（Stable transformation）”或“被稳定地转化的（stably transformed）”意为一种被引入细胞并且整合进入该细胞的基因组的核酸。按照这样，该整合的核酸能够被其子代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如在此使用的，“基因组（genome）”还包括核基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸整合进入例如叶绿体基因组。如在此使用的，稳定转化还可以指一种例如作为微型染色体在染色体外保持的转基因。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫测定（ELISA）或蛋白质印迹来进行检测，这两种方法可以检测由引入生物体的一个或多个转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞基因组DNA与多种核酸序列（这些序列特异性地与引入生物体（例如，植物）的转基因的核苷酸序列杂交）的DNA印记杂交测试来进行检测。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与多种核酸序列（这些序列特异性地与引入植物或其他生物体的转基因的核苷酸序列杂交）的RNA印记杂交测试来进行检测。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应（PCR）或本领域内熟知的其他扩增方法来进行检测，这些方法采用与转基因的一个或多个靶标序列进行杂交的特异性引物序列，从而导致该转基因序列的扩增，这种扩增可以通过标准方法进行检测。转化还可以通过直接测序和/或本领域内熟知的杂交方案进行检测。

可以通过本领域内的普通技术人员已知的任何方法将本发明的核酸（例如，miR164）引入细胞中。在本发明的一些实施例中，细胞的转化包括核转化。在其他实施例中，细胞的转化包括质体转化（例如，叶绿体转化）。

用于转化植物的程序是熟知的并且在本领域内是常规的并且在文献中普遍描述。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过以下的转化：细菌介导的核酸递送（例如，经由农杆菌），病毒介导的核酸递送，碳化硅或核酸须介导的核酸递送，脂质体介导的核酸递送，微注射，微粒轰击，钙-磷酸盐介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，纳米颗粒介导的转化，声处理，浸润，PEG介导的核酸吸收，以及其他的致使核酸引入该植物细胞的电的、化学的、物理的（机械的）和/或生物的机制，包括其任何组合。在本领域内已知的不同的植物转化方法的一般指南包括Miki等人（"Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants"in Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology（在植物分子生物学与生物技术的方法中“用于将外来DNA引入植物的程序”），Glick,B.R.与Thompson,J.E.,Eds.（CRC Press,Inc.,（CRC出版公司）Boca Raton（波卡拉顿），1993），67-88页）以及Rakowoczy-Trojanowska（Cell.Mol.Biol.Lett.（《细胞分子生物学通讯》）7:849-858（2002））。

如此，在一些具体实施例中，向植物、植物部分和/或植物细胞中的引入是通过细菌介导的转化、粒子轰击转化、钙-磷酸盐介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙烯二醇介导的转化、以及其他的致使核酸引入该植物、植物部分和/或其细胞的电的、化学的、物理的和/或生物的机制，或其组合。

农杆菌介导的转化是用于转化植物，尤其是双子叶植物的一种普遍使用的方法，因为它的高转化效率以及它对于许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体转移至合适的农杆菌菌株，这可以依赖于由宿主农杆菌菌株携带的、或者在共同存在的Ti质体上的或染色体的vir基因的互补（Uknes等人（1993）Plant Cell《植物细胞》5:159-169）。将该重组二元载体转移至农杆菌可以利用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌的菌株（该辅助菌株携带一种质粒，该质粒能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中）通过一种三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移到农杆菌中

&Willmitzer（1988）Nucleic Acids Res.《核酸研究》16:9877）。

通过重组农杆菌转化植物通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的方法。将转化的组织在携带有位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素标记或除草剂抗性标记的选择性培养基上再生。

另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性的或生物学活性的粒子。参见，例如，美国专利号4,945,050；5,036,006以及5,100,792。总体上，这种方法涉及在有效穿透该细胞的外表面并提供结合进入其内部中的条件下在植物细胞上推进惰性的或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子（例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含一种或多种被试图引入的核酸）推进入到植物组织中。

如此，在本发明的具体实施例中，植物细胞可以通过本领域内已知的任何方法或如在此描述地进行转化并且可以使用多种已知技术中的任一种来从这些经转化的细胞再生出完整的植物。从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生是描述于例如Evans等人（Handbook of PlantCell Cultures（《植物细胞培养手册》），Vol.1,MacMilan Publishing Co.（MacMilan出版公司）New York（纽约）（1983））；以及Vasil I.R.（ed.）（CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants（《植物的细胞培养与体细胞遗传学》），Acad.Press（学术出版社），Orlando（奥兰多），Vol.I（1984），与Vol.II（1986））。对转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物进行选择的方法在本领域内是常规的并且可以在于此提供的本发明的方法中采用。

同样地，工程化进入以上描述的本发明的转基因种子与植物、植物部分和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长被传递，并且因此可以在子代植物中被维持和遗传。总体而言，维持和繁殖利用了已知的农业方法，这些方法被开发为适合特定的目的（如收获、播种或耕作）。

因此能以本领域内熟知的任何数目的方法将一种核苷酸序列引入该植物、植物部分和/或植物细胞中。本发明的这些方法并不取决于用于将一种或多种核苷酸引入植物中的具体方法，仅仅取决于它们获得进入该植物至少一个细胞内部的途径。在有待引入一种以上的核苷酸序列的情况下，它们可以作为一种单一核酸构建体的部分、或者作为分开的核酸构建体而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸载体上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中，或例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些核苷酸序列引入感兴趣的细胞中。

本发明的实施例涉及经设计以表达本发明的核酸（例如，miRNAs、miRNA164）的表达盒。如在此使用的，“表达盒（expression cassette）”意为一种核酸分子，该核酸分子具有至少一种可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列（例如，miRNA序列，miR164序列）上的控制序列。以这种方式，例如，可操作地与针对本发明的miRNA的核苷酸序列相互作用的植物启动子可以在表达盒中提供，用以在一种植物、植物部分和/或植物细胞中的表达。

如在此使用的，术语“启动子（promoter）”指核苷酸序列的一个区域，该区域包含编码序列有效表达的必要信号。这可以包括RNA聚合酶结合于其上的序列，但是并不限于此类序列并且可以包括与包含在蛋白翻译控制中的区域一起的其他调节蛋白结合的区域并且还可以包括编码序列。

此外，本发明的“启动子”是一种能够在植物细胞中起始转录的启动子。此类启动子包括驱动核苷酸序列组成型表达的那些，当受诱导时驱动表达的那些，以及以组织特异性或发育特异性方式驱动表达的那些，这些不同类型的启动子在本领域内是已知的。

为了本发明的目的，这些调节区域（即，启动子、转录调节区域、以及翻译终止区域）对于该植物、植物部分和/或植物细胞可以是原生的/类似的和/或这些调节区域对于其他调节区域来说可以是原生的/类似的。可替代地，这些调节区域对于该植物（和/或植物部分和/或植物细胞）和/或对于彼此（即，这些调节区域）可以是异源的。如此，例如，当启动子被可操作地连接至来自一个物种的一种多核苷酸（该物种与该核苷酸衍生自的物种不同）时可以是异源的。可替代地，如果一种启动子是来自与多核苷酸自其衍生的物种相同/类似的物种，则该启动子也可以对于该选定的核苷酸序列是异源的，但是一者或两者（即，启动子以及多核苷酸）从其原初形式和/或基因组座经过了实质性的修饰，或者该启动子不是该可操作地连接的多核苷酸的原生启动子。

有待使用的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：细胞-或组织-特异性表达、所希望的表达水平、效率、可诱导性以及可选择性。例如，当希望在特异性组织或器官中表达时，可以使用一种组织特异性启动子（例如，根特异性启动子）。相比之下，当希望进行刺激应答表达时，可以使用可诱导型启动子。当希望在植物的所有细胞中连续表达时，可以使用组成型启动子。对于本领域的技术人员而言，通过相对于一种核苷酸序列来适当地选择并且定位启动子以及其他的调节区而调整该核苷酸序列的表达是一种惯例。

所以，在一些情况下，可以使用组成型启动子。组成型启动子的实例包括但不限于，夜香树属病毒启动子（cmp）（美国专利号7,166,770），水稻肌动蛋白1启动子（Wang等人（1992），Mol.Cell.Biol.（《分子细胞生物学》）12:3399-3406；以及美国专利号5,641,876）、CaMV35S启动子（Odell等人（1985），Nature（《自然》）313:810-812）、CaMV19S启动子（Lawton等人（1987），Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）9:315-324）、nos启动子（Ebert等人（1987），Proc.Natl.Acad.Sci USA（《美国科学院院刊》）84:5745-5749）、Adh启动子（Walker等人（1987），《美国科学院院刊》84:6624-6629）、蔗糖合酶启动子（Yang&Russell（1990），《美国科学院院刊》87:4144-4148）、以及泛素启动子。

此外，在植物中已经报道了组织特异性调节的核酸和/或启动子。因此，在一些实施方案中，可以使用组织特异性启动子。一些报道的组织特异性核酸包括对种子贮藏蛋白（例如β-伴大豆球蛋白、cruciferin、油菜籽蛋白以及菜豆球蛋白）、玉米素或油体蛋白（比如油质蛋白）或参与脂肪酸生物合成的蛋白（包括酰基载体蛋白、硬脂

ACP去饱和酶以及脂肪酸去饱和酶（fad2-1））进行编码的那些，以及在胚胎发育期间表达的其他核酸（比如Bce4，参见例如，Kridl等人（1991）Seed Sci.Res.（《种子科学研究》）1:209-219；以及欧洲专利号255378）。因此，与这些组织特异性核酸相关的启动子可以使用于本发明中。组织特异性启动子的另外的实例包括但不限于：根特异性启动子RCc3（Jeong等人Plant Physiol.（《植物生理学》）153:185-197（2010））与RB7（美国专利号5459252），凝集素启动子（Lindstrom等人（1990）Der.Genet.11:160-167；以及Vodkin（1983）Prog.Clin.Biol.Res.（《临床生物学研究进展》）138:87-98），玉米醇脱氢酶1启动子（Dennis等人（1984）NucleicAcids Res.（《核酸研究》）12:3983-4000），S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶（SAMS）（Vander Mijnsbrugge等人（1996）Plant and Cell Physiology（《植物与细胞生理学》），37(8):1108-1115），玉米集光复合体启动子（Bansal等人（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）89:3654-3658），玉米热激蛋白启动子（O'Dell等人（1985）EMBO J.5:451-458；以及Rochester等人（1986）EMBO J.5:451-458），豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子（Cashmore,"Nucleargenes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase"29-39In:Genetic Engineering of Plants（《植物遗传工程》中的29-39“编码核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因”）（Hollaender ed.，Plenum Press（Plenum出版社）1983；以及Poulsen等人（1986）Mol.Gen.Genet.（《分子与普通遗传学》）205:193-200），Ti质粒甘露氨酸合酶启动子（Langridge等人（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）86:3219-3223），Ti质粒胭脂氨酸合酶启动子（Langridge等人（1989），同上），矮牵牛查尔酮异构酶启动子（van Tunen等人（1988）EMBO J.7:1257-1263），豆富甘氨酸蛋白1启动子（Keller等人（1989）Genes Dev.（《基因与发育》）3:1639-1646），截短的CaMV35S启动子（O'Dell等人（1985）Nature（《自然》）313:810-812），马铃薯块茎储藏蛋白启动子（Wenzler等人（1989）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）13:347-354），根细胞启动子（Yamamoto等人（1990）Nucleic AcidsRes.（《核酸研究》）18:7449），玉米素启动子（Kriz等人（1987）Mol.Gen.Genet.（《分子与普通遗传学》）207:90-98；Langridge等人（1983）Cell（《细胞》）34:1015-1022；Reina等人（1990）Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）18:6425；Reina等人（1990）Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）18:7449；以及Wandelt等人（1989）Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）17:2354），球蛋白-1启动子（Belanger等人（1991）Genetics（《遗传学》）129:863-872），α-微管蛋白cab启动子（Sullivan等人（1989）Mol.Gen.Genet.（《分子与普通遗传学》）215:431-440），PEPCase启动子（Hudspeth&Grula（1989）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）12:579-589），R基因复合体-相关启动子（Chandler等人（1989）Plant Cell（《植物细胞》）1:1175-1183），以及查尔酮合酶启动子（Franken等人（1991）EMBO J.10:2605-2612）。对于种子特异性表达特别有用的是豌豆球蛋白启动子（Czako等人（1992），Mol.Gen.Genet.（《分子与普通遗传学》）235:33-40；以及美国专利号5,625,136）。对于在成熟叶中表达的其他有用的启动子是在衰老起始时打开的那些，比如来自拟南芥的SAG启动子（Gan等人（1995），Science（《科学》）270:1986-1988）。此外，可以使用在质体中起功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因95'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。有用于本发明的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子以及Kunitz胰蛋白酶抑制因子基因启动子（Kti3）。

在一些情况下，可以使用可诱导型启动子。可诱导型启动子的实例包括但不限于，四环素阻抑物系统启动子、Lac抑制物系统启动子、可诱导的铜系统启动子、可诱导的水杨酸盐系统启动子（例如PR1a系统）、可诱导的糖皮质激素系统启动子（Aoyama T.等人（1997），Plant J.（《植物杂志》）11:605-612）和可诱导的蜕皮激素系统启动子。其他可诱导型的启动子包括可诱导的ABA启动子和可诱导的膨胀启动子、生长素结合蛋白基因的启动子（Schwob等人（1993），Plant J.（《植物杂志》）4:423-432）、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子（Ralston等人（1988），Genetics（《遗传学》）119:185-197）、MPI蛋白酶抑制剂启动子（Cordero等人（199），Plant J.（《植物杂志》）6:141-150）、以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子（Kohler等人（1995），Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）29:1293-1298；Martinez等人（1989），J.Mol.Biol.（《分子生物学杂志》）208:551-565；以及Quigley等人（1989），J.Mol.Evol.（《分子进化学杂志》）29:412-421）。还包括苯磺酰胺可诱导的系统（美国专利号5,364,780）以及醇可诱导的系统（国际专利申请公开号WO97/06269和WO97/06268）以及谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于以下文献之中的任何可诱导型启动子：Gatz（1996），CurrentOpinion Biotechnol.（《生物工艺学现行观点》）7:168-172以及Gatz（1997），Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.（《植物生理学与植物分子生物学年度综述》）48:89-108。

除了以上所描述的启动子，该表达盒还可以包括其他调节序列。如在此使用的，“调节序列”意为位于一种编码序列的上游（5'非编码序列）、内部、或下游（3'非编码序列）的核苷酸序列，并且这些核苷酸序列影响了相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括但不限于，增强子、内含子、翻译前导序列以及多腺苷酸化信号序列。

还已知一些从病毒得到的非翻译前导序列可以增强基因表达。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒（TMV，“ω-序列”）、玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）以及苜蓿花叶病毒（AMV）在增强表达方面有效（Gallie等人（1987）Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）15:8693-8711；以及Skuzeski等人（1990）Plant Mol.Biol.（《植物分子生物学》）15:65-79）。本领域中已知的其他前导序列类包括但不限于：小RNA病毒病毒前导序列，例如脑心肌炎（EMCV）5'非编码区前导序列（Elroy-Stein等人（1989），Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）86:6126-6130）；马铃薯Y病毒属前导序列，例如烟草蚀纹病毒（TEV）前导序列（Allison等人（1986），Virology（《病毒学》）154:9-20）；玉米矮花叶病毒（MDMV）前导序列；（Allison等人（1986），如以上）；人类免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）前导序列，（Macejak&Samow（1991），Nature（《自然》）353:90-94）；来自苜蓿花叶病毒（AMV）的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列（AMV RNA4；Jobling&Gehrke（1987），《自然》325:622-625）；烟草花叶病毒（TMV）前导序列，（Gallie等人（1989），Molecular Biology of RNA（《RNA分子生物学》）237-256）；以及MCMV前导序列（Lommel等人（1991），《病毒学》81:382-385）。还参见Della-Cioppa等人（1987），Plant Physiol.（《植物生理学》）84:965-968。

该表达盒还以可任选地包括在植物中起作用的一种转录和/或翻译终止区（即，终止区）。对于在表达盒中使用而言，多种转录终止子是可利用的并且负责在超出该转基因时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是原生的，对于该可操作地连接的感兴趣的核苷酸序列可以原生的，对于该宿主植物可以是原生的，或者可以是源自另一种来源（即，对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该宿主植物、或其的任何组合而言是外来的或异源的）。适当的转录终止子包括但不限于，CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用一种编码序列的天然转录终止子。

一种信号序列可以被可操作地连接至本发明的核酸（例如，miR164），以指导该核苷酸序列进入细胞区室。以这种方式，该表达盒将包括一种对可操作地连接至该信号序列的核酸序列上的miRNA进行编码的核苷酸序列。该信号序列可以是可操作地连接在该miRNA的N-或C-末端上。

不考虑所使用的一种或多种调节序列的类型，可以将它们可操作地连接至该miRNA的核苷酸序列上。如在此使用的，“可操作地连接（operablylinked）”意为，对一种核酸构建体（比如一种表达盒）的元件进行配置以执行它们的常规功能。因此，可操作地连接至一种感兴趣的核苷酸序列上的调节或控制序列（例如，启动子）能够影响该感兴趣的核苷酸序列的表达。这些控制序列不需要与该该兴趣的核苷酸序列邻接，只要它们起功能指导其表达。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以在一种启动子与一种编码序列之间存在，并且该启动子序列仍可以被认为“可操作地连接”至该编码序列。本发明的核苷酸序列（即，miRNA）可以可操作地连接至一种调节序列，由此允许其在细胞核/或对象中表达。

该表达盒还可以包括一种用于可选择性标记的核苷酸序列，该核苷酸序列可以用以对一种经转化的植物、植物部分或植物细胞进行选择。如在此使用的，“可选择性标记（selectable marker）”意为是一种核酸，当该核酸表达时赋予一种不同的表型给表达该标记的植物、植物部分或植物细胞，并且因此允许此类经转化的植物、植物部分或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样的核酸可以编码一种可选择的或者可筛选的标记，这取决于该标记是否给予一种可以通过化学方法而被选择的性状，比如通过使用一种选择性试剂（例如，一种抗生素、除草剂、或类似物），或者取决于该标记是否仅仅是一种可以通过观察或测试而鉴别的性状，比如通过筛选（例如，R位点性状）。当然，适合的可选择性标记的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于在此描述的这些表达盒中。

可选择性标记的实例包括但不限于，一种编码neo或nptII的核酸，它赋予对卡那霉素、G418、以及类似物的抗性（Potrykus等人（1985），Mol.Gen.Genet.（《分子与普通遗传学》）199:183-188）；一种编码bar的核酸，它赋予对草丁膦的抗性；一种编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSP）的核酸，它赋予对草甘膦的抗性（Hinchee等人（1988），Biotech.（《生物技术》）6:915-922）；一种编码腈水解酶（例如来自臭鼻克雷白氏杆菌的bxn）的核酸，它赋予对溴草腈的抗性（Stalker等人（1988），Science《科学》242:419-423）；一种编码改变的乙酰乳酸合酶（ALS）的核酸，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性（欧洲专利申请号154204）；一种编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶（DHFR）的核酸（Thillet等人（1988），J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》）263:12500-12508）；一种编码茅草枯脱卤素酶的核酸，它赋予对茅草枯的抗性；一种编码甘露糖-6-磷酸异构酶（也称为磷酸甘露糖异构酶（PMI））的核酸，它赋予代谢甘露糖的能力（美国专利号5,767,378与5,994,629）；一种编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核酸，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性；和/或一种编码hph的核酸，它赋予对潮霉素的抗性。本领域中普通技术人员能够选择一种适合的用于表达盒的可选择性标记。

另外的可选择性标记包括但不限于：一种编码β-葡萄糖醛酸酶的核酸或uidA（GUS）（其编码多种显色底物已知的一种酶）；一种编码在植物组织中对花色苷色素（红色）进行调节的产物的R-位点核酸（Dellaporta等人，"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac"263-282In:Chromosome Structure and Function:Impact of New Concepts（《染色体结构与功能：新概念的影响》中的263-282“通过Ac转座子标记技术对玉米R-nj等位基因的分子克隆”），18th Stadler Genetics Symposium（第18届斯特德莱遗传学专题讨论会）（Gustafson&Appels eds.,Plenum Press（Plenum出版社）（1988））；一种编码β-内酰胺酶的核酸，对于β-内酰胺酶而言多种显色底物是已知的（例如，PADAC，一种显色头孢菌素）（Sutcliffe（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）75:3737-3741）；一种编码xylE的核酸，xylE对一种儿茶酚双加氧酶进行编码（Zukowsky等人（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）80:1101-1105）；一种编码酪氨酸酶的核酸，酪氨酸酶能够氧化酪氨酸成为DOPA以及多巴醌，多巴醌转而缩合形成黑色素（Katz等人（1983）J.Gen.Microbiol.（《普通微生物学杂志》）129:2703-2714）；一种编码β-半乳糖苷酶的核酸，对于β-半乳糖苷酶而言存在显色底物；一种编码荧光素酶（lux）的核酸，荧光素酶允许生物发光检测（Ow等人（1986）Science（《科学》）234:856-859）；一种编码水母发光蛋白的核酸，水母发光蛋白可以在钙敏感的生物发光检测中采用（Prasher等人（1985）Biochem.Biophys.Res.Comm.（《生物化学与生物物理学研究通讯》）126:1259-1268）；或一种编码绿色荧光蛋白的核酸（Niedz等人（1995）Plant Cell Reports（《植物细胞报道》）14:403-406）。本领域中普通技术人员能够选择一种适合的用于表达盒的可选择性标记。

本发明的表达盒还可以包括对其他希望的性状进行编码的核苷酸序列。此类序列可以与任何的核苷酸序列组合叠加，以创造出具有所希望表型的植物、植物部分或植物细胞。叠加的组合可以通过任何方法来产生，这些方法包括但不限于，通过任何常规的方法学或通过遗传转化的杂交育种植物。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，所感兴趣的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。这些另外的核苷酸序列可以在一种共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的针对该异源miR164的核苷酸序列同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以包含在分开的盒（反式）中或包含在相同的盒（顺式）中。这些核苷酸序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。进一步认识到的是，核苷酸序列可以在一种所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见，例如，国际专利申请公开号WO99/25821；WO99/25854；WO99/25840；WO99/25855以及WO99/25853。

该表达盒还可以包括有关农艺学性状的一种或多种多肽的编码序列，这些主要地是对种子公司、种植者、或谷粒处理机有益的，例如细菌性病原体抗性、真菌抗性、除草剂抗性、昆虫抗性、线虫抗性以及病毒抗性。参见，例如，美国专利号5,304,730；5,495,071；5,569,823；6,329,504以及6,337,431。该性状还可以是提高植物活力或产量（包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状）的性状、或是允许对展现感兴趣性状的植物进行鉴定的性状（例如，可选择性标记、种皮颜色等）。不同的感兴趣的性状，以及用于引这些性状进入植物的方法描述于例如，美国专利号4,761,373；4,769,061；4,810,648；4,940,835；4,975,374；5,013,659；5,162,602；5,276,268；5,304,730；5,495,071；5,554,798；5,561,236；5,569,823；5,767,366；5,879,903；5,928,937；6,084,155；6,329,504与6,337,431；以及美国专利申请公开号2001/0016956。还参见，万维网（World Wide Web）上的lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。

众多序列已知于增强来自转录单位之内的表达并且这些序列可以与本发明的miRNA的核苷酸序列（例如，miR164）结合使用以增加其在转基因植物中的表达。例如，已经显示玉米Adhl基因的内含子与内含子1增强基因表达。参见，例如，Gibbs等人（1987），Genes Develop.（《基因与发育》）1:1183-1200。

可以将该miRNA的核苷酸序列克隆进入该表达盒，并且将得到的表达盒引入/转化进入例如一种植物、植物部分和/或植物细胞。

除了表达盒，众多植物转化载体在对于本领域的普通技术人员而言是熟知的，并且在此描述的这些核苷酸序列可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标物种。对于某些目标物种，如在此讨论的，不同的抗生素或除草剂选择标记可以是优选的。

术语“载体（vector）”指用于将一种核酸（或多种核酸）转移、递送或引入细胞中的组合物。载体包括一种核酸，该核酸包含有待被转移、递送或引入的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明的载体可以是一种病毒载体，其可以包含，例如，一种病毒衣壳和/或其他材料用于便利于该核酸进入细胞和/或该载体的核酸在该细胞中的复制（例如，包装在该衣壳中或作为该衣壳的一部分的逆转录酶或其他酶）。该病毒载体可以是一种感染性病毒颗粒，该病毒颗粒感染细胞后将核酸递送进入该细胞。

本发明的进一步提供了一种用于在植物、植物部分和/或植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括：将一种异源miRNA核苷酸序列引入该植物、植物部分和/或植物细胞中，其中该异源miRNA核苷酸序列在该植物和/或其部分中表达，由此相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照的植物、植物部分和/或植物细胞在一种植物、植物部分和/或植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。在本发明的一些实施例中，该异源miRNA核苷酸序列是miR164。

因此，本发明的进一步提供了一种用于在植物、植物部分和/或植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该植物、植物部分和/或植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物和/或其部分中表达，由此相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的植物、植物部分和/或植物细胞在该植物、植物部分和/或植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。

本发明的进一步提供了一种用于在大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物和/或其部分中表达，由此相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞在该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。异源miR164核苷酸序列的一个非限制性实例是SEQ ID.NO:1的核苷酸序列。

如此，在本发明的一些实施例中，提供了一种用于在大豆植物和/或其部分中减少大豆胞囊线虫形成的方法，该方法包括：将一种编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中，其中该异源核苷酸序列在该植物、植物部分和/或植物细胞中表达，由此产生一种相对于未经该编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞具有减少的大豆胞囊线虫形成的转基因大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

本发明的另外的实施例提供了用于从该转基因植物部分或植物细胞再生一种转基因植物的方法，其中该再生的转基因植物在其基因组中包含一种异源miRNA核苷酸序列并且相对于对照（如在此定义的）在植物中具有增加的对大豆胞囊线虫寄生的抗性和/或减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。可以使用如以上描述的多种已知技术中的任一种来从经转化的植物部分、植物组织和/或植物细胞再生植物。

本发明的再另外的实施例提供了用于从该转基因植物部分或植物细胞再生一种转基因植物的方法，其中该再生的转基因植物在其基因组中包含一种异源miR164核苷酸序列并且相对于对照（如在此定义的）在植物中具有增加的对大豆胞囊线虫寄生的抗性和/或减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

本发明的其他实施例提供了用于从该转基因植物部分或植物细胞再生一种转基因植物的方法，其中该再生的转基因植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照（如在此定义的）在植物中具有增加的对大豆胞囊线虫寄生的抗性和/或减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

本发明的另外的实施例提供了用于从该转基因大豆植物部分或大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物的方法，其中该再生的转基因大豆植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照（如在此定义的）在大豆植物中具有增加的对大豆胞囊线虫寄生的抗性和/或减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。可以使用如以上描述的多种已知技术中的任一种来从经转化的植物部分、植物组织和/或植物细胞再生植物。

在一些实施例中，本发明提供了用于减少大豆植物和/或其部分中的大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，这些方法包括：a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物细胞中表达；并且b)从(a)的转基因大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物和/或其部分，其中该转基因大豆植物和/或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。异源miR164核苷酸序列的一个非限制性实例是SEQ ID.NO:1的核苷酸序列。

如此，在本发明的一些实施例中，提供了一种用于在大豆植物或其部分中减少大豆胞囊线虫形成的方法，该方法包括：a)将一种编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中，其中该SEQ IDNO:1核苷酸序列在该植物细胞中表达；并且b)从(a)的大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列并且相对于未经该编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

如前所论，在本发明的一些实施例中，该异源miR164核苷酸序列在该异源miRNA引入的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆细胞中是过表达的。如此，在一些实施例中，本发明的提供了一种用于在大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括：将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列（例如，SEQ ID NO:1）在该植物和/或其部分中过表达，由此相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞在一种大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。

另外地，本发明提供了用于减少大豆植物和/或其部分中的大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，这些方法包括：a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列（例如，SEQ ID NO:1）在该植物细胞中过表达；并且b)从(a)的转基因大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物和/或其部分，其中该转基因大豆植物和/或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

如在此使用的，术语“减少（reduce）”、“减少的（reduced）”、“减少（reducing）”、“减少（reduction）”、“减小（diminish）”以及“降低（decrease）”（及其语法上的变体）描述了一种植物上（例如，大豆）的大豆胞囊线虫胞囊形成的降低，这是通过将本发明的miRNA引入该植物来进行的，由此产生一种在该转基因植物上具有降低的或减少的胞囊形成的转基因植物。可以通过将经该异源miR164核苷酸序列转化的植物上形成的胞囊数目与未经该异源miR164核苷酸序列转化的大豆植物上形成的胞囊数目进行比较来观察胞囊形成方面的这一降低。

在一个另外的方面，本发明进一步提供了用于获得衍生自本发明的转基因植物的子代植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含一种异源miRNA核苷酸序列并且相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照植物具有增加的对植物寄生体的抗性。

在一个另外的方面，本发明提供了用于获得衍生自本发明的转基因植物的子代植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照植物具有增加的对植物寄生体的抗性。在具体实施例中，本发明提供了用于获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于如在此定义的对照大豆植物具有增加的对大豆胞囊线虫寄生抗性。在又另外的实施例中，本发明提供了用于获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含一种编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列并且相对于如在此定义的对照大豆植物具有增加的对大豆胞囊线虫寄生抗性。

在本发明的其他实施例中，提供了用于获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含一种异源miRNA核苷酸序列并且相对于未经该异源miRNA核苷酸序列转化的对照大豆植物具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

在本发明的又其他实施例中，提供了用于获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于未经该异源miR164核苷酸序列转化的对照大豆植物具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。如此，在一些实施例中，本发明提供了用于获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于如在此定义的对照具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。在又另外的实施例中，本发明提供了用于获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物的方法，其中所述子代植物在其基因组中包含一种编码SEQ ID NO:1核苷酸序列的异源核苷酸序列并且相对于如在此定义的对照具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

如上所论，该异源miRNA核苷酸序列（例如，miR164）可以存在于一种核酸构建体中，比如一种表达盒和/或载体。当存在于一种核酸构建体中时，该异源miRNA核苷酸序列可以可操作地与如上所述的一种启动子相联系（例如，该异源miRNA核苷酸序列的上游）。包含该异源miRNA核苷酸序列的核酸构建体可以另外地包含一种可操作地与该异源miRNA核苷酸序列相联系的NOS终止子（例如，该异源miRNA核苷酸序列的下游）。如此，在具体实施例中，本发明提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含可操作地与一种启动子以及一种NOS终止子相联系的异源miRNA核苷酸序列。在其他实施例中，本发明提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含可操作地与一种启动子以及一种NOS终止子相联系的异源miR164核苷酸序列。

在其他实施例中，本发明提供了通过本发明的方法所产生的、具有增加的对植物寄生体的抗性的植物、植物部分和/或植物细胞。如此，在一些实施例中，本发明提供了通过本发明的方法所产生的、具有增加的对大豆胞囊线虫寄生的抗性的植物、植物部分和/或植物细胞。在又其他实施例中，本发明提供了通过本发明的方法所产生的、具有增加的对大豆胞囊线虫寄生的抗性的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

本发明的另外的方面提供了通过本发明的方法所产生的、具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成的植物、植物部分和/或植物细胞。在又另外的实施例中，本发明提供了通过本发明的方法所产生的、具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成的大豆植物、大豆植物部分和/或大豆植物细胞。

在一些实施例中，本发明提供了从包含一种异源miRNA核苷酸序列（例如，miRNA164）的转基因种子生长而来的转基因植物，以及从包含近交与杂交株系的植物而产生的子代，这些近交与杂交植物株系通过将从该转基因种子生长而来的转基因植物与不是从相同转基因种子生长而来的一个第二植物进行交配而制得。另外地提供了由本发明的大豆植物所产生的大豆种子，其中该种子包含该异源miRNA核苷酸序列。在一些实施例中，本发明提供了从包含该异源miRNA核苷酸序列的转基因种子生长而来的转基因植物，以及从包含近交与杂交植物株系的植物而产生的子代，这些近交与杂交株系通过将从该转基因种子生长而来的转基因植物与不是从相同转基因种子生长而来的一个第二植物进行交配而制得。本发明的另外的实施例提供了从本发明的大豆种子产生的大豆种子粕。

现在参照以下实例对本发明进行描述。应理解，这些实例是用于阐释本发明的各方面，并且并不限制如在权利要求中所定义的本发明的范围。

实例

实例1.表达盒的制备。

将miR164（gma-miR164；附图1；SEQ ID NO:1）克隆进入prCMP:MIR164:tNOS表达盒。然后将具有miR164的表达盒克隆进入一种双元载体以创建载体pKS033（a.k.a.15312prCMP-MIR164-tNOS；在附图2中展示）。

然后将该pKS033载体转化进入发根农杆菌菌株K599。作为对照，将具有prAR6:GUS:tNOS盒的载体pKS001（a.k.a.B-15312-prAR6-cGUS-tNOS）转化进入该发根农杆菌菌株K599。在该对照的情况下，该表达盒不包括miR164。

实例2.包含prCMP:MIR164:tNOS表达盒以及prAR6:GUS:tNOS盒的转基因大豆毛状根事件的诱导与选择。

Narayanan等人（Crop Science（《作物科学》）39:1680-1686（1999））指出，整个植物中的SCN抗性表型在转基因毛状根中得以保持，因此转基因毛状根系统对于评估候选的SCN抗性基因是有用的。因此，使用该大豆毛状根系统来评估对SCN的抗性。使用大豆栽培品种Williams82作为用于毛状根转化的种质。将大豆种子在皮氏培养皿中在含有0.5%蔗糖的1%琼脂上在27℃萌发5天。然后将子叶从苗上切下，并且用携带pKS033以及pKS001的农杆菌的培养物对创伤面进行接种。将这些子叶放置在1%琼脂上持续6天并且然后转移到选择培养基上。在大约两周之后，将从这些子叶诱导的独立转基因毛状根事件进行收获并且转移到培养基上，并且在27℃在黑暗中进行培养。

实例3.大豆毛状根系统中胞囊形成的评估。

包含prCMP:MIR164:tNOS表达盒的毛状根中的评估。

在转移到培养平板上两周之后，将这些经转化的毛状根用表面消毒的J2阶段的大豆胞囊线虫（SCN J2）进行接种并且将这些根在27℃在黑暗中进行培养，这允许这些毛状根事件上的胞囊形成。在线虫接种后一个月之后，确定包含prCMP:MIR164:tNOS表达盒的根以及包含prAR6:GUS:tNOS盒的根两者上的胞囊数目。如附图3中所示，基于ANOVA单因子分析，发现在过表达miR164的根中的平均胞囊数目显著低于表达GUS基因（即，不是miR164）的对照植物的平均胞囊数目（p<0.01）。

包含prAR6:gma-MIR396b表达盒的毛状根中的评估

在一个类似实验中，过表达了另一种大豆miRNA—gma-miR396a。如附图4所示，与对照相比miR396b的过表达没有减少在这些转基因毛状根上发展的胞囊。

实例4.用双元载体18963对大豆的转化。

将miR164（gma-miR164；附图1；SEQ ID NO:1）克隆进入prCMP:MIR164:tNOS表达盒（附图2A）。然后将具有miR164的表达盒克隆进入一种双元载体以创建载体18963。然后将该18963载体转化进入根瘤农杆菌菌株EHA101。

通过根瘤农杆菌介导的转化（使用如在Hwang等人（WO08112044）以及Que等人（WO08112267）中所述（除了以下有注释的地方外）的外植体材料和培养基配方）使用品种Williams82的未成熟种子靶标来完成大豆的转化而产生转基因大豆植物。使用这一方法，该转化质粒的左以及右边界区域之内的遗传元件有效率地转移并且整合进入了植物细胞的基因组，而这些边界区域之外的遗传元件大体上未被转移。从温室培养植物收获成熟的大豆荚，并且用稀释的漂白溶液进行消毒并且用无菌水进行冲洗。将未成熟的种子从种子荚中去除并且用无菌水进行短暂冲洗。从无菌的未成熟种子来制备外植体（如Hwang等人（WO08112044）所述）并且用包含转化双元载体18963的根瘤农杆菌菌株EHA101进行感染并且允许进行接种持续另外的30至240分钟。然后通过抽吸将过量的根瘤农杆菌悬浮液除去并且将这些外植体移至包含非选择性共培养基的平板上。将这些外植体与剩余的根瘤农杆菌在黑暗中在23℃共培养持续4小时并且然后转移至补充有一种由替卡西林（75mg/L）、头孢噻肟（75mg/L）以及万古霉素（75mg/l）组成的抗生素混合物的再生培养基上，在此处将它们在黑暗中孵育七天。然后将这些外植体转移至包含潮霉素B（3mg/L至6mg/L）以及一种由替卡西林（75mg/L）、头孢噻肟（75mg/L）以及万古霉素（75mg/l）组成的抗生素混合物的再生培养基上以抑制并杀死根瘤农杆菌。在含有2mg/L至4mg/L的潮霉素B的伸长培养基中进行芽再生与伸长。在该转化过程中使用潮霉素磷转移酶（HPT）基因作为可选择性标记。将再生的小植株移植至土壤（如所描述的（WO08112267））并且通过TaqMan PCR分析检测HPT与CMP启动子序列的存在（Ingham等人，2001）。这一筛选允许对携带该T-DNA并且没有载体骨架DNA的转基因事件进行选择。将对于HPT基因以及CMP序列而言呈阳性的植物以及对于壮观霉素（spec）基因而言呈阴性的植物转移至温室中用于miRNA表达种子背景的分析。

使用经prAR6:GUS:tNOS（附图2B）表达盒转化的植物作为对照。

实例5.经转化的植物中的胞囊形成的评估。

将经prCMP:MIR164:tNOS表达盒转化的植物用J2截短的恶大豆胞囊线虫（SCN J2）进行接种。短暂地，将生长在盆里的转基因T1代大豆幼苗的3周龄幼苗以每一植物3000个J2的水平用SCN J2悬浮液进行接种。在线虫接种后一个月之后，确定包含prCMP:MIR164:tNOS表达盒的转基因植物以及来自相同T0亲本的空分离体两者上的胞囊数目。

在本说明书中提到的所有公开物和专利申请对于本发明所涉及的领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有公开物和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。

尽管已经为了清楚理解的目的通过解释和实例详细地描述了以上发明，清楚的是在以上实施例列表以及所附权利要求的范围内可以实施某些改变和变更。

Claims (22)

1.一种用于产生对线虫植物寄生体具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞的方法，该方法包括：

将一种异源miRNA核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中，其中该异源miRNA核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞对线虫植物寄生体具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞。

2.一种用于在大豆植物或其部分中增加对线虫植物寄生体的抗性的方法，该方法包括：a)将一种异源miRNA核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因大豆植物细胞，其中该异源miRNA核苷酸序列在该大豆转基因植物细胞中表达；并且b)从(a)的大豆转基因植物细胞再生一种大豆转基因植物或其部分，其中该大豆转基因植物和/或其部分在其基因组中包含该异源miRNA核苷酸序列并且相对于未用该异源miRNA核苷酸序列转化的对照大豆植物和/或其部分对该线虫植物寄生体具有增加的抗性。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该线虫植物寄生体是大豆胞囊线虫。

4.一种用于产生对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分或植物细胞的方法，该方法包括：

将一种异源miR164核苷酸序列引入该植物、植物部分或植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该植物、植物部分或植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的植物、植物部分或植物细胞对植物寄生体具有增加的抗性的转基因植物、植物部分或植物细胞。

5.一种用于产生对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞的方法，该方法包括：

将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中表达，由此产生一种相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的转基因大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞。

6.一种用于在大豆植物或其部分中增加对大豆胞囊线虫寄生的抗性的方法，该方法包括：

a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因大豆植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该转基因大豆植物细胞中表达；并且

b)从(a)的转基因大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照大豆植物或其部分对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。

7.一种用于在大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括：

将一种异源miR164核苷酸序列引入该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中表达，由此相对于对照的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞在该大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中减少大豆胞囊线虫胞囊形成。

8.一种用于在大豆植物或其部分中减少大豆胞囊线虫胞囊形成的方法，该方法包括

a)将一种异源miR164核苷酸序列引入一种大豆植物细胞中以产生一种转基因大豆植物细胞，其中该异源miR164核苷酸序列在该大豆植物细胞中表达；并且

b)从(a)的转基因大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物或其部分，其中该转基因大豆植物或其部分在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照大豆植物或其部分具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成。

9.如权利要求4所述的方法，进一步包括从该转基因植物部分或植物细胞再生一种转基因植物，其中该再生的转基因植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照植物对植物寄生体具有增加的抗性。

10.如权利要求5所述的方法，进一步包括从该转基因大豆植物部分或大豆植物细胞再生一种转基因大豆植物，其中该再生的转基因大豆植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照大豆植物对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。

11.如权利要求7所述的方法，进一步包括从该转基因大豆植物部分或大豆细胞再生一种转基因大豆植物，其中该再生的转基因大豆植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照大豆植物具有减少的大豆胞囊线虫形成。

12.如权利要求4所述的方法，进一步包括获得衍生自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照植物对植物寄生体具有增加的抗性。

13.如权利要求5、6或10中任一项所述的方法，进一步包括获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照大豆植物对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性。

14.如权利要求7、8或11中任一项所述的方法，进一步包括获得衍生自该转基因大豆植物的子代大豆植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该异源miR164核苷酸序列并且相对于对照大豆植物具有减少的大豆胞囊线虫形成。

15.如权利要求4至14中任一项所述的方法，其中该异源miR164核苷酸序列存在于一种核酸构建体中。

16.如权利要求15所述的方法，其中该异源miR164核苷酸序列可操作地与一种启动子相联系。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该引入是通过细菌介导的转化、粒子轰击转化、钙-磷酸盐介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙烯二醇介导的转化、以及其他的致使核酸引入该植物、植物部分或其细胞中的电的、化学的、物理的或生物的机制，或其组合。

18.一种根据权利要求1、4、9、12或15-17中任一项所述的方法所产生的对植物寄生体具有增加的抗性的植物、植物部分或植物细胞。

19.一种根据权利要求3、5、6、10或12-14中任一项所述的方法所产生的对大豆胞囊线虫寄生具有增加的抗性的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞。

20.一种根据权利要求7、8、11、14或15-17中任一项所述的方法所产生的具有减少的大豆胞囊线虫胞囊形成的大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞。

21.一种由权利要求19或权利要求20所述的大豆植物而产生的大豆种子，其中该种子包含该异源miR164核苷酸序列。

22.一种从权利要求21所述的大豆种子而产生的大豆种子粕。

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