CN112522297B - 调控植物抗虫性状的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种调控植物抗虫性状的基因及其应用。本发明揭示了发现miR319与植物的抗虫性状密切相关，下调miR319可增强植物的抗虫性；本发明也揭示了上调PCF5的表达可增强植物的抗虫性，且这一过程是通过PCF5负调控茉莉酸途径而介导的；本发明也揭示了下调Coi1a或Coi1b可增强植物的抗虫性。因此，调控miR319、调控PCF5、调控PCF5与茉莉酸途径基因相互作用或调控Coi1a或Coi1b的物质或方法可应用于实现植物品种的改良。

Description

调控植物抗虫性状的基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及调控植物抗虫性状的基因及其应用。
背景技术
植物在生长发育的过程中遭受着各种各样的植食性昆虫的威胁，所以植物需要一套非常复杂的防御体系来抵抗这些昆虫的侵害。植物的自身免疫被激活时，会启动先天免疫反应，激发一系列的生理生化反应和基因的表达，先天免疫反应包括细胞膜表面的模式识别受体激发的免疫反应(PTI)和植物专化性的抗性蛋白(R蛋白)识别受体，分泌效应蛋白激发的免疫反应(ETI)。植物的免疫反应被激发后，包括茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)，H2O2等在植物体内编织起一个复杂的防御信号网络。
除此之外，植物还拥有组成型防御体系，包括植物表面的蜡质、角质层、木质素等物理屏障。而构成这些防御网络的基本单元是植物中的基因，过表达或敲除某个基因可能会影响到其中的一些防御通路，从而显示出对昆虫抗性的增强或减弱。
目前，植物如禾本科植物对昆虫，例如飞虱科昆虫抗性分子机制的研究还处于初级阶段，发掘昆虫抗性相关的基因，增强对昆虫抗性分子机制的了解，将有助于田间对于昆虫的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供调控植物抗虫性状的基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种提高植物抗虫性的方法，包括进行选自下组的操作：(a)上调植物中PCF5的表达或活性；(b)下调植物中miR319或其前体的表达或活性；(c)下调Coi1a和/或Coi1b的表达或活性；或(d)促进PCF5负调控茉莉酸信号途径；其中，所述的PCF5、miR319、Coi1a或Coi1b包括其同源物。
在一个优选例中，(a)中，包括：给予植物PCF5的上调剂，从而提高植物中PCF5的表达或活性；较佳地，所述上调剂包括编码PCF5的多核苷酸或构建物。
在另一优选例中，(b)中，包括：利用基于Target mimicry技术的miR319沉默体下调miR319或其前体的表达，在植物中敲除或沉默miR319或其前体，或抑制miR319的活性；较佳地，包括：以特异性干扰miR319或其前体的干扰分子来沉默miR319或其前体，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除miR319或其前体，以同源重组的方法敲除miR319或其前体，或在含有miR319或其前体的植物中将miR319或其前体进行功能丧失性突变；较佳地，所述的miR319包括miR319a和miR319b；或
在另一优选例中，(c)中，包括：在植物中敲除或沉默Coi1a和/或Coi1b，或抑制Coi1a和/或Coi1b的活性；较佳地，包括：以特异性干扰Coi1a和/或Coi1b的干扰分子来沉默Coi1a和/或Coi1b，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除Coi1a和/或Coi1b，以同源重组的方法敲除Coi1a和/或Coi1b，或在含有Coi1a和/或Coi1b的植物中将Coi1a和/或Coi1b进行功能丧失性突变。
在另一优选例中，所述的PCF5负调控茉莉酸信号途径，包括：PCF5抑制茉莉酸信号途径中Coi1a和/或JAZ4基因的表达；较佳地，包括：PCF5结合于Coi1a和/或JAZ4基因的启动子，从而抑制Coi1a和/或JAZ4基因的表达。
在另一优选例中，所述的虫为半翅目昆虫；更佳地为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphaxstriatellus)。
在另一优选例中，所述的植物是表达PCF5或其同源物的植物，表达miR319或其同源物的植物，存在茉莉酸信号途径(包括该途径中的基因，如JAZ4，Coi1a或Coi1b)的植物；较佳地，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。
在本发明的另一方面，提供一种PCF5或其上调剂的应用，用于：提高植物抗虫性；制备提高植物抗虫性的制剂；或，作为鉴定植物的抗虫性的分子标记物；其中，所述的PCF5包括其同源物。
在一个优选例中，所述上调剂包括编码PCF5的多核苷酸或构建物。
在本发明的另一方面，提供一种miR319或其前体的下调剂的应用，用于：提高植物抗虫性；制备提高植物抗虫性的制剂；或，作为鉴定植物的抗虫性的分子标记物；其中，所述的miR319或其前体包括其同源物。
在一个优选例中，所述miR319或其前体的下调剂包括：基于Target mimicry技术的miR319沉默体，敲除或沉默miR319或其前体的试剂，抑制miR319活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰miR319或其前体表达的干扰分子，针对miR319或其前体的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将miR319或其前体进行功能丧失性突变；较佳地，所述miR319沉默体基于target mimicry技术建立，其包括IPS基因序列以及位于该序列中的mimicry miR319序列；较佳地，所述的miR319包括miR319a和miR319b。
在本发明的另一方面，提供一种Coi1a和/或Coi1b的下调剂的应用，用于：提高植物抗虫性；制备提高植物抗虫性的制剂；或，作为鉴定植物的抗虫性的分子标记物；其中，所述的Coi1a和/或Coi1b包括其同源物。
在另一优选例中，所述Coi1a和/或Coi1b的下调剂包括：敲除或沉默Coi1a和/或Coi1b的试剂，抑制Coi1a和/或Coi1b活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰Coi1a和/或Coi1b表达的干扰分子，针对Coi1a和/或Coi1b的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将Coi1a和/或Coi1b进行功能丧失性突变。
在另一优选例中，所述的虫为半翅目昆虫；更佳地为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphaxstriatellus)。
在另一优选例中，所述的植物是表达PCF5或其同源物的植物，表达miR319或其同源物的植物，存在茉莉酸信号途径(包括该途径中的基因，如JAZ4，Coi1a或Coi1b)的植物；较佳地，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定具有抗虫性的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的PCF5的表达或活性，若该测试植物PCF5表达或活性高(如，高于该种植物的平均值)，则其为具有抗虫性的植物；或，鉴定测试植物中的miR319的表达或活性，若该测试植物miR319低表达或不表达或活性低(如，低于该种植物的平均值)，则其为具有抗虫性的植物；较佳地，所述的miR319包括miR319a和miR319b；或，鉴定测试植物中Coi1a和/或Coi1b的表达或活性，若该测试植物Coi1a和/或Coi1b低表达或不表达或活性低(如，低于该种植物的平均值)，则其为具有抗虫性的植物；或，鉴定测试植物中PCF5对于茉莉酸信号途径的负调控作用，若该测试植物中PCF5对于茉莉酸信号途径的负调控作用强(如，强于该种植物的平均值)，则其为具有抗虫性的植物；其中，所述的PCF5、miR319、Coi1a或Coi1b包括其同源物。
在另一优选例中，所述的PCF5对于茉莉酸信号途径的负调控作用强包括：PCF5显著性抑制茉莉酸信号途径中Coi1a和/或JAZ4基因的表达；更佳地，包括：PCF5结合于Coi1a和/或JAZ4基因的启动子，从而显著性抑制Coi1a和/或JAZ4基因的表达。
在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达PCF5；和(2)检测所述体系中PCF5的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)PCF5的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质；其中，所述的PCF5包括其同源物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达miR319或其前体；和(2)检测所述体系中miR319或其前体的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低(如降低20％以上，较佳的降低50％以上；更佳的降低80％以上)miR319或其前体的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质；其中，所述的miR319包括其同源物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达Coi1a和/或Coi1b；和(2)检测所述体系Coi1a和/或Coi1b的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低(如降低20％以上，较佳的降低50％以上；更佳的降低80％以上)Coi1a和/或Coi1b的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质；其中，所述的Coi1a或Coi1b包括其同源物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达PCF5且包含茉莉酸信号途径或包含该途径中的Coi1a和/或JAZ4基因及其启动子；和(2)检测所述体系中PCF5与Coi1a和/或JAZ4基因的启动子的相互作用(结合)；若所述候选物质在统计学上促进(如促进20％以上，较佳的促进50％以上；更佳的促进80％以上)PCF5与Coi1a和/或JAZ4基因的启动子的相互作用，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质；其中，所述的PCF5、Coi1a或JAZ4基因包括其同源物。
在另一优选例中，还包括设置对照组，从而明确分辨PCF5、miR319或其前体或茉莉酸信号途径基因(包括Coi1a，Coi1b，JAZ4)的表达或活性。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对PCF5、miR319或其上游或下游蛋白或基因，或针对茉莉酸信号途径或包含该途径的蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、miR319a和miR319b在褐飞虱取食后不同时间段(0，4，8，12，24h)的表达检测。
(a)qRT-PCR技术检测miR319a和miR319b在褐飞虱取食后不同时间段的表达；
(b)miRNA Northern技术检测miR319a和miR319b在褐飞虱取食后不同时间段的表达。
图2、miR319aOE、miR319bOE和MIM319转基因植株的抗褐飞虱检测。
(a)单株鉴定法检测miR319aOE植株对褐飞虱的抗性；
(b)单株鉴定法检测miR319bOE植株对褐飞虱的抗性；
(c)单株鉴定法检测MIM319OE植株对褐飞虱的抗性；
(d)miR319bOE、MIM319OE和野生型ZH11植株上褐飞虱数目在不同取食天数的变化。
图3、OsPCF5基因的表达分析、PCF5OE植株的抗性分析、OsPCF5蛋白的性质分析。
(a)OsPCF5、OsPCF6和OsTCP21基因在miR319aOE、miR319bOE和MIM319OE植株中的表达检测；
(b)OsPCF5、OsPCF6和OsTCP21基因响应褐飞虱取食的检测；
(c)OsPCF5基因在水稻不同组织部位的表达检测，LS：Leaf Sheath；YP：YoungPanicle；
(d)OsPCF5基因在PCF5OE转基因植株中的表达检测；
(e，f)PCF5OE转基因植株抗褐飞虱的检测；
(g)OsPCF5蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位检测；(h)OsPCF5蛋白的激活能力检测。
图4、OsPCF5蛋白对JA信号途径的基因，Coi1b和JAZ4基因启动子的直接结合。
(a)Coi1a，Coi1b和JAZ4基因的结构模式图。蓝色竖线表示PCF5的结合位置，橙色框表示外显子，箭头表示基因编码的方向，灰色虚线表示内含子，灰色线表示启动子区域；
(b)PCF5蛋白和Coi1a基因的启动子片段的酵母单杂交实验；
(c)PCF5蛋白和JAZ4基因的启动子片段的酵母单杂交实验；
(d)PCF5蛋白和Coi1a基因的启动子片段的Dual-LUC实验；
(e)PCF5蛋白和Coi1a基因的启动子片段的Dual-LUC实验的荧光值量化结果；
(f)PCF5蛋白和JAZ4基因的启动子片段的Dual-LUC实验；
(g)PCF5蛋白和JAZ4基因的启动子片段的Dual-LUC实验的量化结果。
图5、JA信号途径介导水稻对褐飞虱的抗性。
(a)MeJA处理和对照处理的水稻褐飞虱取食后的状态；
(b)MeJA处理和对照处理的水稻褐飞虱取食后的死亡率统计；
(c)单株鉴定法鉴定CoiR和野生型植株对褐飞虱的抗性。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，发现miR319与植物的抗虫性状密切相关，下调miR319可增强植物的抗虫性；上调PCF5的表达也可增强植物的抗虫性，且这一过程是通过PCF5负调控茉莉酸途径而介导的；并且，下调Coi1a或Coi1b也可增强植物的抗虫性。因此，调控miR319、调控PCF5、调控PCF5与茉莉酸途径基因相互作用、调控Coi1a或Coi1b的物质或方法可应用于实现植物品种的改良。
如本文所用，所述的“植物(包括作物)”是表达PCF5或其同源物的植物，表达miR319或其同源物的植物，存在茉莉酸信号途径(包括该途径中的基因，如JAZ4，Coi1a或Coi1b)的植物；较佳地，所述的植物包括：禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物包括：禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。例如包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。
如本文所用，所述的虫包括半翅目昆虫，同翅目昆虫，双翅目昆虫鳞翅目昆虫(如二化螟)等；较佳地为飞虱科昆虫。所述的“飞虱科昆虫”包括但不限于：褐飞虱(Brownplanthopper，BPH)，白背飞虱(white back planthopper，WBPH)及灰飞虱(small brownplanthopper，SBPH)。“飞虱科”是属于同翅目的1个科，“飞虱科昆虫”具有较多共性如下：通称飞虱，全部植食性，很多种生活于禾本科植物，为刺吸式农业害虫。有迁飞习性，是我国和许多亚洲国家当前水稻上的首要害虫。其中褐飞虱为单食性害虫，在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代。白背飞虱和灰飞虱食性广，可危害水稻、小麦、玉米等禾本科植物。
调控植物抗虫性
本发明人发现，上调PCF5的表达也可增强植物的抗虫性，这一过程是通过PCF5负调控茉莉酸途径而介导的。
本发明中，来源于水稻的PCF5是具有GenBank登录号LOC_Os01g11550的多肽/基因。本发明还包括其序列变异形式。所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的PCF5同源性高(比如同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述PCF5相同功能的多肽/基因也包括在本发明内。本发明中，所述的PCF5也包括其同源物，也即存在于水稻以外的其它物种中、与本发明上述的序列具有同源性且功能与本发明中PCF5相同的多肽/基因、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽/基因。由于PCF5在多种物种中保守性地存在，应理解，本发明中并不仅限于实施例中具体列举的PCF5。
在得知了所述PCF5的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来过表达PCF5，从而提高植物抗虫性。比如可通过本领域人员已知的途径将携带PCF5基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的PCF5。优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：(1)将外源的PCF5的编码核酸转入植物组织、器官或组织，获得转化入PCF5的编码多核苷酸的植物组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了外源的编码核酸的植物组织、器官或种子再生成植物植株。其它增加PCF5基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强PCF5基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该PCF5的表达。适用于的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
本发明中，所述PCF5的多肽或其编码基因的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了多肽活性的“上调”、“促进”或多肽表达的“上调”、“促进”。任何可提高PCF5的活性、提高PCF5的稳定性、上调PCF5的表达、增加PCF5有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调PCF5有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的PCF5或其上调剂特别适合应用于一类植物，其PCF5的表达低于该类植物的平均值或其PCF5不表达；从而，所述的PCF5蛋白或其上调剂的运用可以使该类植物回复为野生型表型或更优的表型。
本发明中，来源于水稻的“miR319”是具有以下序列的miRNA：
miR319a：UUGGACUGAAGGGUGCUCCC(SEQ ID NO:1)；
miR319b：UUGGACUGAAGGGUGCUCCC(SEQ ID NO:2)。
本发明中，所述的miR319也包括其同源物，也即存在于水稻以外的其它物种中、与本发明上述的序列具有同源性且功能与本发明中miR319相同的miRNA。由于miR319在多种物种中保守性地存在，应理解，本发明中并不仅限于实施例中具体列举的miR319。
miR319的前体天然地存在于植物中，在了解了miR319的序列后，本领域技术人员可以确定其前体。当进行人工改造时，所述的miR319或其前体或基于它们所设计的靶向性序列可以是人工合成的或被置于构建物或表达盒中，这是本领域技术人员在本发明的指引下容易制备的。
在得知了所述的miR319的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来下调所述的miR319的表达，这些方法均可被包含在本发明中。作为一种实施方式，提供了一种下调植物中miR319或其前体的表达的方法，包括：(1)将干扰miR319或其前体表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。作为另一种实施方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除或下调靶基因。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。
作为一种更为具体的实施方式，提供了一种降低植物中miR319的表达的方法，所述的方法包括：(1)构建基于target mimicry技术的miR319沉默体，其包括IPS基因序列中以及位于该序列中的mimicry miR319序列；(2)将(1)获得的miR319沉默体转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(3)将步骤(2)获得的转入了所述miR319沉默体的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
发明还提供了用于下调所述的miR319或其前体的物质，其通过下调miR319或其前体从而发挥改良植物的性状的功能。所述物质可以是：下调剂、核酸抑制物、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调miR319或其前体的表达水平。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miR319或其前体的下调剂是指任何可降低miR319活性、降低miR319或其前体的稳定性、下调miR319的表达、减少miR319有效作用时间、或抑制miR319或其前体的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miR319或其前体有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰miR319或其前体表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑miR319或其前体的基因编辑试剂，等等。
作为本发明的优选方式，所述物质包括特异性下调miR319或其前体的干扰分子或基于Target mimicry技术的miR319沉默体。本发明还提供包含所述干扰分子或沉默体的表达载体，优选植物表达载体；更优选适合于进行后续转基因操作(如应用农杆菌的转基因操作)的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明还提供遗传工程化的宿主细胞，其含有干扰分子或沉默体序列或含有包含干扰分子或沉默体序列的载体。宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。
本发明中，来源于水稻的Coi1a是具有GenBank登录号LOC_Os01g63420的多肽/基因；来源于水稻的Coi1b是具有GenBank登录号LOC_Os05g37690的多肽/基因；来源于水稻的JAZ4是具有GenBank登录号LOC_Os09g23650的多肽/基因。本发明还包括其序列变异形式。所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述Coi1a、Coi1b或JAZ4同源性高(比如同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述Coi1a、Coi1b或JAZ4相同功能的多肽/基因也包括在本发明内。所述的Coi1a、Coi1b或JAZ4也包括其同源物，也即存在于水稻以外的其它物种中、与本发明上述的序列具有同源性且功能与本发明中Coi1a、Coi1b或JAZ4相同的多肽/基因、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽/基因。
在得知了所述的Coi1a、Coi1b的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来下调所述的Coi1a、Coi1b的表达，这些方法均可被包含在本发明中。
植物定向筛选或靶向性筛选调控分子
基于本发明人的新发现，本发明还涉及利用PCF5、miR319或其前体、Coi1a、Coi1b作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用PCF5、miR319或其前体、Coi1a、Coi1b作为一种分子标记，通过检测植物中PCF5、miR319或其前体、Coi1a、Coi1b的表达情况或活性，早期确定植物的抗虫性能。
因此，本发明提供了一种特异性鉴定植物的抗虫性的方法，包括：鉴定待测植物的PCF5的表达情况，若是该测试植物的PCF5高表达，则其为具有抗虫性的植物。
本发明还提供了一种特异性鉴定植物的抗虫性的方法，包括：鉴定待测植物的miR319，若是该测试植物的miR319低表达或不表达，则其为具有抗虫性的植物。
本发明还提供了一种特异性鉴定植物的抗虫性的方法，包括：鉴定测试植物中PCF5对于茉莉酸信号途径的负调控作用，若是该测试植物中PCF5对于茉莉酸信号途径的负调控作用强，则其为具有抗虫性的植物。
本发明还提供了一种特异性鉴定植物的抗虫性的方法，包括：鉴定待测植物的Coi1a和/或Coi1b，若是该测试植物的Coi1a和/或Coi1b低表达或不表达，则其为具有抗虫性的植物。
本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列分析或蛋白分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，免疫组化法，等等。
在种植早期就能够鉴定出植物的抗虫性，可为植物育种工作带来极大的便利。
在得知了PCF5、miR319、Coi1a、Coi1b的功能及其分子机制以后，可以基于此进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节PCF5、miR319或其前体、Coi1a、Coi1b从而定向调控植物抗虫性的潜在物质。
本发明提供了一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达PCF5；和(2)检测所述体系中PCF5的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高PCF5的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质。
本发明提供了一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达miR319或其前体；和(2)检测所述体系中miR319或其前体的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低miR319或其前体的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质。
本发明提供了一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达Coi1a和/或Coi1b；和(2)检测所述体系中Coi1a和/或Coi1b的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低Coi1a和/或Coi1b的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质。
本发明提供了一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达PCF5且包含茉莉酸信号途径或包含该途径中的Coi1a或JAZ4基因及其启动子；和(2)检测所述体系中PCF5与Coi1a或JAZ4基因的启动子的相互作用(结合)；若所述候选物质在统计学上促进PCF5与Coi1a或JAZ4基因的启动子的相互作用，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于PCF5、miR319或其前体、Coi1a、Coi1b或其它对调控茉莉酸途径相关基因有调控作用的潜在物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、水稻遗传转化
参照文献Hiei Y等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant journal:for cell and molecular biology 1994，6(2):271-282中的方法进行。
2、单株鉴定法抗褐飞虱鉴定
种子经过催芽后，分单株播种于小的塑料盆钵中，正常生长管理，约1个月后，待苗子将进入分蘖期，进行抗虫鉴定。预先制备高40cm，直径约8cm的透塑料罩子，在罩子一侧留有6*10cm大小的通风口，用纱网遮盖。用罩子将苗子罩住，以纱网罩住顶部。鉴定时，将每个罩子中接入15头左右3龄若虫。第二天重复数虫一次，确保虫子数量每个单株一致。正常生长管理条件下，待5-8天，观察苗子的存活状况。
3.miRNA Northern
参照文献Dai Z，Wang J，Zhu M，Miao X，Shi Z:OsMADS1 Represses microRNA172in Elongation of Palea/Lemma Development in Rice.Frontiers in plant science2016，7:1891中相应的方法。
4.超表达转基因质粒的构建及转基因植株MIM319OE的构建
分别克隆miR319a和miR319b前体的基因组序列大约200bp左右，以及OsPCF5的全长cDNA序列：
miR319a前体基因组序列(SEQ ID NO:3)：
UGUGUAAGAAGAGAGCUCUCUUCAGUCCACUCUCAGAUGGCUGUAGGGUUUUAUUAGCUGCCGAAUCAUCCAUUCACCUACCAAGAAAGUUGCAGGAGUGUAUCUCUUGGUAGCGGACUGGAUGACGCGGGAGCUAAAAUUUAGCUCUGCGCCGUUUGUGGUUGGACUGAAGGGUGCUCCCUUGCUCAAGC
miR319b前体的基因组序列(SEQ ID NO:4)：
GAUGGAUGGAAGAGAGCGUCCUUCAGUCCACUCAUGGGCGGUGCUAGGGUCGAAUUAGCUGCCGACUCAUUCACCCACAUGCCAAGCAAGAAACGCUUGAGAUAGCGAAGCUUAGCAGAUGAGUGAAUGAAGCGGGAGGUAACGUUCCGAUCUCGCGCCGUCUUUGCUUGGACUGAAGGGUGCUCCCUCCUCCUCGA
OsPCF5的全长cDNA序列(SEQ ID NO:5)：
ATGGGCGACGCCGGCGGCCACTCCCACCACCACCAACACGGCTTCCAGCCTCAGCTCCTCTCCTTCGGTGGCGTCGGCCACCACCACCACCTGCATCAGTTCACGGCGCAGCCACAGCCCCCCGCCGCGTCCCACACTCGGGGTCGTGGAGGTGGAGGTGAGATTGTCCCCGCGACGACAACTCCACGGTCGAGGGGCGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGGGAGATCGTGGCGGTGCAGGGCGGGCACATTGTGCGGTCGACAGGGCGGAAGGACCGGCACAGCAAGGTCTGCACGGCGCGCGGGCCGCGCGACCGCCGCGTGCGGCTGTCGGCGCACACCGCCATCCAGTTCTACGACGTGCAGGACCGGCTGGGCTACGACCGCCCGAGCAAGGCGGTGGACTGGCTCATCAAGAACGCCAAGGACGCCATCGACAAGCTCGACGTGCTGCCGGCGTGGCAGCCCACTGCCGGCGGCGCAGGCGCGGGCAATGCCGCCGCGCCGCCGTCCTCCTCGACCCACCCCGACTCCGCCGAGAACTCCGACGACCAGGCGCAGGCCATCACCGTCGCGCACACCGCCTTCGACTTCGCCGGCGGGGGCAGCGGCGGGACCAGCTTCCTCCCGCCGTCGCTCGACTCGGACGCCATAGCCGACACGATCAAGTCCTTCTTCCCCATGGGTGGCACCGCAGGCGGGGAGGCATCGTCGTCCACCACGGCGGCGCAGTCGTCGGCCATGGGTTTCCAGAGCTACACGCCTGACCTCCTGTCCCGCACCGGCAGCCAGAGCCAGGAGCTCCGGCTGTCGCTGCAGTCCTTACCAGACCCCATGTTCCACCACCAGCAACATCGCCATGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAATGGCACCACGCAGCAGGCGCTCTTCTCCGGCGCCGCCAATTACTCGTTCGGCGGCGGAGCCATGTGGGCCACCGAGCAGCAGGCGCAGAACCAGCGCATGCTGCCGTGGAACGTGCCCGACCCCGGCGGCGGCGGCGGCGCCGCCTACCTGTTCAACGTGTCGCAGCAAGCGGCGCATATGCAGGCGGCGGCTGCGGCGCTGGGTGGCCACCAGAGCCAGTTCTTCTTCCAGAGGGGACCCCTTCAGTCCAGTAACCAGCCCTCCGAGCGAGGATGGCCGGAGACCGTCGAAGCCGACAACCAGATGAGCCACCACCAAGGAGGGCTGAGCCCCTCCGTGTCGGCGGCCATCGGTTTTGCCGCTCCCGGCATCGGCTTCTCCGGCTTCCGCCTCCCCGCGAGGATACAGGGCGACGAGGAGCACAACGGCGGCGGCGGCGGCAATGGCGACAAGCCGCCGCCGCCGTCGTCTGTCTCCTCGGCTTCTCACCACTGA
引物两端添加酶切位点的序列，然后通过双酶切定向克隆到p130135Snos载体(35S启动子驱动表达)中，分别形成各自的超表达载体miR319aOE、miR319bOE和PCF5OE。
MIM319质粒的构建，参照Gao F，Wang K，Liu Y，Chen Y，Chen P，Shi Z，Luo J，Jiang D，Fan F，Zhu Y et al:Blocking miR396 increases rice yield by shapinginflorescence architecture.Nature plants 2015，2:15196中相应的方法。
构建获得的超表达转基因质粒的，通过常规的农杆菌法制备转基因植物。
利用Target mimicry技术，构建将miR319a和miR319b同时下调的转基因植株MIM319OE：通过引物IPSF(GTGGATCCaagaaaaatggccatcccctagc(SEQ ID NO:6))和IPSR(CTGGAGCTCgaggaattcactataaagagaatcg(SEQ ID NO:7))从拟南芥中扩增IPS基因，通过引物上的双酶切位点，克隆到p130135Snos载体上。通过IPSF和MIM319-1(cgaagctUUGGACUGAAtagaGGGUGCUCCCtt tctagagggagataa(SEQ ID NO:8))，IPSR和MIM319-II(cctctagaaaGGGAGCA CCCTCTATTCAGTCCAAagcttcg gttcccctcg(SEQ ID NO:9))搭配作为引物，然后再用引物IPSF和IPSR进行overlapping PCR扩增，将MIM319替换到IPS基因骨架中进行超表达。
5.酵母单杂交
参照文献Dai Z，Tan J，Zhou C，Yang X，Yang F，Zhang S，Sun S，Miao X，Shi Z:The OsmiR396-OsGRF8-OsF3H-flavonoid pathway mediates resistance to the brownplanthopper in rice(Oryza sativa).Plant biotechnology journal 2019中相应的方法。
6.Dual-LUC
参照文献Dai Z，Tan J，Zhou C，Yang X，Yang F，Zhang S，Sun S，Miao X，Shi Z:The OsmiR396-OsGRF8-OsF3H-flavonoid pathway mediates resistance to the brownplanthopper in rice(Oryza sativa).Plant biotechnology journal 2019中相应的方法。
7.MeJA处理
10株水稻苗种植在10cm见方的塑料盒中，在两叶一心时期，喷洒100μM的MeJA，之后2小时放入褐飞虱。正常生长管理条件下，待5-8天，观察苗子的存活状况。
8.水稻材料
野生型水稻材料为ZH11(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.ZhonghuaNo.11).同时作为转基因的受体材料。
9、亚细胞定位
参照文献Dai Z，Wang J，Yang X，Lu H，Miao X，Shi Z:Modulation of plantarchitecture by the miR156f-OsSPL7-OsGH3.8 pathway in rice.Journal ofexperimental botany 2018，69(21):5117-5130中相应的方法。
10、自激活实验
参照文献Dai Z，Wang J，Yang X，Lu H，Miao X，Shi Z:Modulation of plantarchitecture by the miR156f-OsSPL7-OsGH3.8 pathway in rice.Journal ofexperimental botany 2018，69(21):5117-5130中相应的方法。
11、q RT-PCR
参照文献Dai Z，Wang J，Yang X，Lu H，Miao X，Shi Z:Modulation of plantarchitecture by the miR156f-OsSPL7-OsGH3.8 pathway in rice.Journal ofexperimental botany 2018，69(21):5117-5130中相应的方法。
12、下调Coi1a和Coi1b基因的转基因植株CoiR的建立
参考文献(Proc Natl Acad Sci U S A.2012May 8；109(19):E1192-200.doi:10.1073/pnas.1201616109.Epub 2012Apr 23)。
实施例1、miR319a和miR319b的表达受到褐飞虱取食的诱导
水稻中有两个基因编码miR319，一个是MIR319a，一个是MIR319b(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PNRD)。为研究miR319a和miR319b是否介导水稻对褐飞虱的抗性，本发明人首先检测了它们的表达是否响应褐飞虱的取食。
选取褐飞虱取食后不同时间段(0，4，8，12，24小时)的水稻材料，通过miRNANorthen技术和qRT-PCR技术检测miR319a和miR319b的表达。
两种检测技术的结果均表明，miR319a和miR319b的表达均明显地被褐飞虱取食所诱导，且诱导的高峰在取食后8-12h(图1a，b)。
实施例2、miR319超表达转基因植株以及功能下调转基因植株对褐飞虱的抗性检测
本发明人构建了MIR319a和MIR319b超表达的质粒，并通过转基因技术，转化到水稻品种ZH11中，分别获得转基因植株miR319aOE和miR319bOE。同时，通过Target mimicry技术，构建了将miR319a和miR319b同时下调的转基因植株MIM319OE。
对这些转基因植株进行检测，发现miR319aOE(图2a)和miR319bOE(图2b)均呈现出感褐飞虱的表型，而MIM319OE转基因植株呈现出抗褐飞虱的表型(图2c)。对取食不同转基因植株的褐飞虱数目进行观察，发现MIM319OE植株上，褐飞虱的数目衰减的比较快，从而更加显示出MIM319OE植株具有很强的抗褐飞虱能力(图2d)。
实施例3、miR319的靶基因OsPCF5正调控水稻抗褐飞虱
本发明人检测了miR319的部分靶基因在miR319aOE、miR319bOE和MIM319OE植株中的表达变化。发现OsPCF5、OsPCF6和OsTCP21基因在miR319aOE和miR319bOE的植株中被明显下调，而在MIM319OE植株中，被明显上调(图3a)。
进一步检测OsPCF5、OsPCF6和OsTCP21基因响应褐飞虱取食的表达情况，发现与miR319a和miR319b被褐飞虱取食诱导相适应，OsPCF5基因被褐飞虱取食所抑制(图3b)。
检测OsPCF5基因在水稻不同组织部分的表达，发现除了在幼穗(YP)中有较高表达之外，OsPCF5基因在褐飞虱的取食部位，叶鞘(LS)以及叶片(leaf)中也有表达，暗示了其可能在水稻抗褐飞虱过程中发挥作用(图3c)。
随后，本发明人构建了OsPCF5基因的超表达转基因植株(PCF5OE)，OsPCF5基因在其中的表达被高度上调(图3d)。
单株鉴定法检测PCF5OE植株对褐飞虱的抗性，发现同野生型ZH11相比较，PCF5OE植株具有抗褐飞虱的能力(图3e，f)。
生化分析显示，OsPCF5蛋白定位在细胞核(图3g)，具有自激活能力，而且具有激活能力的结构域，位于蛋白的N端(图3h)。
实施例4、OsPCF5可能对JA信号途径的基因进行直接调控
茉莉酸(Jasmonic acid，JA)信号途径是植物抗虫的一条重要的信号传导途径。本发明人分析了几个JA信号途径的基因的启动子，发现在Coi1a(GenBank登录号：LOC_Os01g63420)，Coi1b(GenBank登录号：LOC_Os05g37690)和JAZ4基因(GenBank登录号：LOC_Os09g23650)的启动子区域，分别都有PCF5的结合位点(图4a)。
进一步的酵母单杂交显示，PCF5能够结合到Coi1a或JAZ4基因的启动子(图4b，c)，而不能结合Coi1b基因的启动子(图略)。
Dual-LUC结果显示，PCF5能够分别抑制Coi1a或JAZ4基因的表达(图4d，e，f，g)。
上述结果提示，PCF5蛋白通过结合到Coi1a或JAZ4基因的启动子，对这些基因进行调控，从而通过JA信号传导途径介导对褐飞虱的抗性。
实施例5、JA信号途径负调控水稻抗褐飞虱
为了进一步确证JA信号途径在介导水稻抗褐飞虱中的作用，本发明人以野生型水稻ZH11为材料，人工喷洒100μM的茉莉酸甲酯MeJA，然后饲喂褐飞虱，发现喷洒了MeJA的水稻，明显地呈现出易感褐飞虱的表型(图5a，b)。
另外，本发明人获得了同时下调Coi1a和Coi1b基因的转基因植株CoiR，对CoiR植株和野生型(日本晴，NIP)进行褐飞虱抗性鉴定，结果显示CoiR植株与野生型相比，明显地呈现更优异的抗褐飞虱(图5c)特性。
上述实验显示，JA能够负调控水稻对褐飞虱的抗性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 调控植物抗虫性状的新型基因及其应用
<130> 195542
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 1
uuggacugaa gggugcuccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 2
uuggacugaa gggugcuccc 20
<210> 3
<211> 191
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 3
uguguaagaa gagagcucuc uucaguccac ucucagaugg cuguaggguu uuauuagcug 60
ccgaaucauc cauucaccua ccaagaaagu ugcaggagug uaucucuugg uagcggacug 120
gaugacgcgg gagcuaaaau uuagcucugc gccguuugug guuggacuga agggugcucc 180
cuugcucaag c 191
<210> 4
<211> 197
<212> RNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 4
gauggaugga agagagcguc cuucagucca cucaugggcg gugcuagggu cgaauuagcu 60
gccgacucau ucacccacau gccaagcaag aaacgcuuga gauagcgaag cuuagcagau 120
gagugaauga agcgggaggu aacguuccga ucucgcgccg ucuuugcuug gacugaaggg 180
ugcucccucc uccucga 197
<210> 5
<211> 1377
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 5
atgggcgacg ccggcggcca ctcccaccac caccaacacg gcttccagcc tcagctcctc 60
tccttcggtg gcgtcggcca ccaccaccac ctgcatcagt tcacggcgca gccacagccc 120
cccgccgcgt cccacactcg gggtcgtgga ggtggaggtg agattgtccc cgcgacgaca 180
actccacggt cgaggggcgg aggcggcggc ggcggcgggg agatcgtggc ggtgcagggc 240
gggcacattg tgcggtcgac agggcggaag gaccggcaca gcaaggtctg cacggcgcgc 300
gggccgcgcg accgccgcgt gcggctgtcg gcgcacaccg ccatccagtt ctacgacgtg 360
caggaccggc tgggctacga ccgcccgagc aaggcggtgg actggctcat caagaacgcc 420
aaggacgcca tcgacaagct cgacgtgctg ccggcgtggc agcccactgc cggcggcgca 480
ggcgcgggca atgccgccgc gccgccgtcc tcctcgaccc accccgactc cgccgagaac 540
tccgacgacc aggcgcaggc catcaccgtc gcgcacaccg ccttcgactt cgccggcggg 600
ggcagcggcg ggaccagctt cctcccgccg tcgctcgact cggacgccat agccgacacg 660
atcaagtcct tcttccccat gggtggcacc gcaggcgggg aggcatcgtc gtccaccacg 720
gcggcgcagt cgtcggccat gggtttccag agctacacgc ctgacctcct gtcccgcacc 780
ggcagccaga gccaggagct ccggctgtcg ctgcagtcct taccagaccc catgttccac 840
caccagcaac atcgccatgg cggcggcggc ggcggcggca atggcaccac gcagcaggcg 900
ctcttctccg gcgccgccaa ttactcgttc ggcggcggag ccatgtgggc caccgagcag 960
caggcgcaga accagcgcat gctgccgtgg aacgtgcccg accccggcgg cggcggcggc 1020
gccgcctacc tgttcaacgt gtcgcagcaa gcggcgcata tgcaggcggc ggctgcggcg 1080
ctgggtggcc accagagcca gttcttcttc cagaggggac cccttcagtc cagtaaccag 1140
ccctccgagc gaggatggcc ggagaccgtc gaagccgaca accagatgag ccaccaccaa 1200
ggagggctga gcccctccgt gtcggcggcc atcggttttg ccgctcccgg catcggcttc 1260
tccggcttcc gcctccccgc gaggatacag ggcgacgagg agcacaacgg cggcggcggc 1320
ggcaatggcg acaagccgcc gccgccgtcg tctgtctcct cggcttctca ccactga 1377
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
gtggatccaa gaaaaatggc catcccctag c 31
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
ctggagctcg aggaattcac tataaagaga atcg 34
<210> 8
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
cgaagctuug gacugaatag agggugcucc ctttctagag ggagataa 48
<210> 9
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
cctctagaaa gggagcaccc tctattcagt ccaaagcttc ggttcccctc g 51

Claims (15)

1.一种提高植物抗虫性的方法，其特征在于，包括下调植物中miR319或其前体的表达或活性；所述的miR319包括miR319a和miR319b；所述的虫为半翅目昆虫；所述的植物是水稻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下调水稻中miR319或其前体的表达或活性包括：利用基于Target mimicry技术的miR319沉默体下调miR319或其前体的表达，在水稻中敲除或沉默miR319或其前体，或抑制miR319的活性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述敲除或沉默miR319或其前体包括：以特异性干扰miR319或其前体的干扰分子来沉默miR319或其前体，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除miR319或其前体，以同源重组的方法敲除miR319或其前体，或在含有miR319或其前体的水稻中将miR319或其前体进行功能丧失性突变。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，下调水稻中miR319或其前体的表达或活性后，
水稻中PCF5的表达或活性被上调；
Coi1a和/或Coi1b的表达或活性被下调；或
PCF5负调控茉莉酸信号途径被促进。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCF5负调控茉莉酸信号途径，包括：PCF5抑制茉莉酸信号途径中Coi1a和/或JAZ4基因的表达。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：PCF5结合于Coi1a和/或JAZ4基因的启动子，从而抑制Coi1a和/或JAZ4基因的表达。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半翅目昆虫为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphaxstriatellus)。
8.一种miR319或其前体的下调剂的应用，用于：提高植物抗虫性；制备提高植物抗虫性的制剂；或，作为鉴定植物的抗虫性的分子标记物；所述的miR319包括miR319a和miR319b；所述的虫为半翅目昆虫；所述的植物是水稻。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miR319或其前体的下调剂包括：基于Target mimicry技术的miR319沉默体，敲除或沉默miR319或其前体的试剂，抑制miR319活性的试剂。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述miR319或其前体的下调剂包括：特异性干扰miR319或其前体表达的干扰分子，针对miR319或其前体的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述定点突变试剂将miR319或其前体进行功能丧失性突变。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述miR319沉默体基于target mimicry技术建立，其包括IPS基因序列以及位于该序列中的mimicry miR319序列。
12.如权利要求8～11任一所述的用途，其特征在于，所述半翅目昆虫为飞虱科昆虫，包括褐飞虱(Nilaparvata lugens)，白背飞虱(Sogatella furcifera)和灰飞虱(Lalielphaxstriatellus)。
13.一种定向选择或鉴定具有抗虫性的植物的方法，其特征在于，所述方法包括：
鉴定测试植物中的miR319的表达或活性，若该测试植物miR319低表达或不表达或活性低，则其为具有抗虫性的植物；所述的miR319包括miR319a和miR319b；所述的植物是水稻。
14.一种筛选提高植物抗虫性的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达miR319或其前体；和
(2)检测所述体系中miR319或其前体的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低miR319或其前体的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物抗虫性的潜在物质；
所述的植物是水稻。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括设置对照组，从而明确分辨miR319或其前体的表达或活性。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418040A (zh) * 2008-12-04 2009-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用
CN106282225A (zh) * 2015-06-10 2017-01-04 中国科学院上海生命科学研究院 一种负调控植物对飞虱科昆虫的抗性的基因及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2985353A1 (en) * 2006-10-12 2016-02-17 Monsanto Technology LLC Plant micrornas and methods of use thereof
BR112013009186A2 (pt) * 2010-10-29 2016-07-26 Syngenta Participations Ag superexpressão de mirnas de plantas para o controle de parasitas
CN106676106B (zh) * 2015-11-05 2019-12-10 中国科学院上海生命科学研究院 调控植物的种子粒形、抗虫性和耐盐性的miRNA及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418040A (zh) * 2008-12-04 2009-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用
CN106282225A (zh) * 2015-06-10 2017-01-04 中国科学院上海生命科学研究院 一种负调控植物对飞虱科昆虫的抗性的基因及其应用

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