CN114958845B

CN114958845B - miR319-TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用

Info

Publication number: CN114958845B
Application number: CN202210434817.4A
Authority: CN
Inventors: 简超; 李甜; 郝平安; 郝晨阳; 张学勇
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114958845A

Abstract

本发明公开了miR319‑TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用。本发明提供了miR319和/或TaGAMYB3或其相关生物材料在调控植物株型和/或产量上的应用。本发明表明，通过对miR319的沉默或者编辑，同时也可对其靶基因TaGAMYB3的过表达，可以实现对小麦株型的调控，进而大幅度提高小麦产量。

Description

miR319-TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及miR319-TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用。

背景技术

株型是作物形态特征中的重要表型，主要由地上部分的茎部、叶部和穗部以及地下部分的根部构成，其表现性状直接决定作物空间分布、光合作用速率、耐逆性及生物量产出，适宜的株型对作物产量提升和品种改良有重要作用(马梦影等，2020)。

目前，研究人员已在水稻、玉米等作物中发现了许多重要的株型基因，而大多为一因多效基因。如TB1基因不仅影响分蘖，还影响穗型和株高等性状(Dixon et al.,2018)。这种一因多效性既有不利的一面，可能对作物单一性状的改良造成了困难，但也有有利的一面，提供了协同改良作物株型结构的可能性，即所谓理想株型。理想株型是指通过改变株高、叶型、分蘖数量等方式来改良作物的空间构型，使其能够最大限度的利用光能，促进结实转化，从而提高生物量和收获指数。水稻理想株型基因IPA1(IdealPlantArchitecture1)是一个很好的范例。IPA1编码一个OsSPL14的转录因子，并在体内受到OsmiR156的调控OsSPL14基因上的一个点突变扰乱了OsmiR156对其mRNA的靶向切割，从而提OsSPL14表达量，产生了无效分蘖减少、抗倒伏能力增强(茎秆变粗)、产量增加(同时提高穗粒数和千粒重)的理想水稻(Jiaoetal.,2010)。因此，对IPA1之类的理想株型基因的精细调控可以有效的改良株型，有望应用于作物分子育种，从而培育高产、优质、广适的作物新品种。

微小RNA(miRNAs)是一类长度约为21nt的内源单链非编码小分子RNA，在生物体内可以从转录水平(介导甲基化等)和转录后水平(介导靶mRNA切割或抑制mRNA翻译)控制着基因表达过程，在植物生长、发育、抵御环境胁迫等诸多方面发挥重要作用(Voinnet,2009)。越来越多的证据表明，miRNAs对作物株型起着核心调控作用(Tang and Chu,2017)。如miR156可以调控多个SPL类型转录因子，包括理想株型基因IPA1(OsSPL14)、穗长和粒重基因OsSPL13、OsSPL16等。在小麦中过量表达miR156，会引起转基因植物的株型显著改变，包括分蘖数增加、穗变短、小穗数和穗粒数急剧减少(Liu et al.,2017)。miR172的靶基因为AP2类型转录因子，可以调控穗发育和穗型，影响小穗形成和穗分枝(Zhu et al.,2009)。Q基因是小麦重要的驯化基因之一，影响株高、穗型、脱粒性等重要农艺性状。Q编码一个AP2转录因子，受miR172调控，从q驯化为Q是由于AP2在miR172调控位点发生一个同义点突变，导致miR172剪切效率下降，Q表达水平提高(Liu et al.,2017)。由此可见，miRNAs通过靶向调控一系列核心转录因子或信号蛋白等，对作物的株型调控发挥至关重要的作用，随着基因编辑技术等手段的发展和应用，操纵miRNAs(敲除或敲入)有可能成为株型改良的关键。

miR319是一类单、双子叶植物中高度保守的miRNA家族，调控的靶基因为TCP类，可以控制叶、花等器官的生长命运，并参与部分激素生物合成和信号转导等过程，在植物发育、抗逆等过程中发挥重要生物学功能(罗茂等，2011)。拟南芥中miR319可以通过靶向调控TCP4控制花瓣的生长和发育，也能通过调控TCP4等靶基因控制叶片的发育以及叶锯齿状形成(Nag et al.,2009；Koyama et al.,2017)。在水稻中过量表达Osa-miR319，可以显著降低靶基因TCP类转录因子OsPCF5和OsPCF8等的表达，导致叶片宽度增加、小叶脉数目明显增多的表型，同时也增强了转基因水稻的耐冷能力(Yang et al.,2013)。在柳枝稷(switchgrass)中过表达水稻的Osa-miR319b，能够增强植株的乙烯合成从而提高了耐盐能力，这一过程主要是通过负调控靶基因PvPCF5实现的(Liu et al.,2019)。miR319/TCP调控模块还参与了调控杨树表皮毛的起始过程，以及促进棉花纤维从细胞延伸到细胞壁加厚的转换过程(Fan et al.,2020；Cao et al.,2020)。

小麦是我国最重要的粮食作物之一，提高小麦单产对于保证国家粮食安全具有重要意义。小麦分子育种的主要方向之一是将育种与分子技术相结合，将株型有利基因聚合在一起，通过株型改良来进一步提高小麦单产。但是目前为止，在小麦中克隆的株型相关基因还比较有限，相关调控机制及作用通路还有待进一步解析。

发明内容

本发明的目的是提供miR319-TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用。

第一方面，本发明要求保护如下a)和/或b)在如下P1至P12任一中的应用：

a)miR319或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够转录成所述miR319的DNA分子或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

b)TaGAMYB3蛋白或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

P1、调控植物株型；

P2、调控植物产量；

P3、调控植物株高；

P4、调控植物分蘖数；

P5、调控植物穗长；

P6、调控植物每穗颖花数；

P7、调控植物每穗粒数；

P8、调控植物旗叶长；

P9、调控植物旗叶宽；

P10、调控植物茎秆粗细；

P11、调控植物千粒重；

P12、调控植物单株产量。

其中，所述调控可体现为如下任一：

(a1)使所述植物体内miR319的表达量增加，和/或使所述植物体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性降低，所述植物的株高降低和/或分蘖数增多和/或穗长缩短和/或每穗粒数降低和/或旗叶长降低和/或茎秆变细和/或千粒重降低和/或单株产量降低；

(a2)使所述植物体内miR319的表达量减少，和/或使所述植物体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性增加，所述植物的株高增高和/或分蘖数减少和/或穗长增加和/或每穗颖花数增多和/或每穗粒数增多和/或旗叶长增加和/或旗叶宽增加和/或茎秆变粗和/或千粒重增加和/或单株产量增加。

第二方面，本发明要求保护培育具有如下(b1)-(b8)所示性状中至少一种的植物品种的方法：

(b1)株高降低；(b2)分蘖数增多；(b3)穗长缩短；(b4)每穗粒数降低；(b5)旗叶长降低；(b6)茎秆变细；(b7)千粒重降低；(b8)单株产量降低。

所述方法可包括使植物体内miR319的表达量增加，和/或使所述植物体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。

第三方面，本发明要求保护培育具有如下(c1)-(c11)所示性状中至少一种的植物品种的方法：

(c1)株高增高；(c2)分蘖数减少；(c3)穗长增加；(c4)每穗颖花数增多；(c5)每穗粒数增多；(c6)旗叶长增加；(c7)旗叶宽增加；(c8)茎秆变粗；(c9)千粒重增加；(c10)单株产量增加；(c11)产量提高。

所述方法可包括使植物体内miR319的表达量减少，和/或使所述植物体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性增加的步骤。

第四方面，本发明要求保护培育具有如下(b1)-(b8)所示性状中至少一种的转基因植物的方法：

所述方法可包括向受体植物中导入能够转录成miR319的DNA分子，和/或对所述受体植物中能够表达TaGAMYB3蛋白的核酸分子进行敲除或敲低的步骤。

第五方面，本发明要求保护培育具有如下(c1)-(c11)所示性状中至少一种的转基因植物的方法：

所述方法可包括向受体植物中导入能够沉默miR319表达的转基因载体，和/或向所述受体植物中导入能够表达TaGAMYB3蛋白的核酸分子的步骤。

在前文第四方面中，所述能够转录成miR319的DNA分子可通过重组载体的形式导入所述受体植物。

在前文第五方面中，所述能够表达TaGAMYB3蛋白的核酸分子可通过重组载体的形式导入所述受体植物。

在前文第五方面中，所述能够沉默miR319表达的转基因载体上含有如SEQ IDNo.5所示片段。

在上述各方面中，所述miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示。所述miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列。

在上述各方面中，所述TaGAMYB3蛋白可为如下(A1)-(A4)中任一所示的蛋白质：

(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

(A2)将(A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且来源于小麦具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost 和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述各方面中，能够转录成所述miR319的DNA分子如SEQ ID No.2所示。

在上述各方面中，能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaGAMYB3蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述TaGAMYB3蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost 和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为小麦属植物。

更加具体地，所述小麦属植物可为小麦。

实验证明，miR319通过直接靶向TaGAMYB3控制小麦株型和产量。对转基因植株重要农艺性状统计，沉默miR319后，穗粒数，千粒重及单株产量均显著提高。旗叶变大增加光合速率，茎秆变粗可以抗倒伏。在未来大田育种中，通过对miR319的沉默或者编辑，同时也可对其靶基因TaGAMYB3的调控，可以实现对小麦株型的调控，进而大幅度提高小麦产量。

附图说明

图1为miR319、TaGAMYB3的PCR扩增。(a)miR319扩增条带，(b)TaGAMYB3扩增条带。

图2为TaGAMYB3突变miR319结合位点后形成的rTaGAMYB3的结构示意图及序列。

图3为转基因过表达、沉默株系中miR319的表达量。(a)为转基因过表达插入miR319前体序列片段；(b)为转基因过表达不同株系miR319的表达量；(c)为转基因沉默插入miR319-STTM插入片段；(d)为转基因沉默不同株系miR319的表达量。

图4为转基因rTaGAMYB3过表达植株中TaGAMYB3的表达量

图5为tae-miR319调控小麦株型。(a)为转基因株系的整体株型；(b)为旗叶和穗子表型；(c)为茎秆表型；(d)为籽粒表型。

图6为miR319过表达、沉默转基因株系农艺性状统计。*P<0.05(ANOVA)，与WT差异显著；**P<0.01(ANOVA)，与WT差异极显著

图7为miR319靶向TaGAMYB3正向调控小麦旗叶与穗。(a)和(b)为抽穗期野生型与3个独立rTaGAMYB3过表达株系的全株(a)、旗叶和穗表型比较比较(b)；(c)和(d)为野生型和rTaGAMYB3-OE系的旗叶长度(c)和穗长(d)；数值以平均值±SD表示。(e)和(f)为WT、miR319-OE、miR319-OE/rTaGAMYB3-OE和miR319-STTM在抽穗期的全株(e)、旗叶和穗(f)表型比较。(g)和(h)为WT、miR319-OE、miR319-OE/rTaGAMYB3-OE和miR319-STTM植株的旗叶长度(g)和穗长(h)。数值以平均值±SD表示。**P<0.01(ANOVA)，与WT差异极显著。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及到的miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示，miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列。TaGAMYB3蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

实施例1、miR319-TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用

一、miR319、TaGAMYB3克隆及STTM319的人工合成及相关载体构建

所用小麦品种为科农199。

1、RNA提取

科农199种子萌发后2周左右取样，采用trizon法提取叶片部位的RNA样品，使用TransScript All-in-one First-Strand cDNASynthesis Super Mix for qPCR反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)对RNA样品进行反转录得到cDNA。trizon法提取RNA具体步骤如下：

(1)取下样品后直接置于液氮中速冻，研钵(事先用清水洗干净并用DEPC水处理过夜，120℃20min灭菌2次，使用前置于-20℃预冷)用液氮预冷，将样品迅速用力研磨(中间添加液氮时应小心防止液氮溅出)后，转移到RNase-free的2ml离心管中，加入1.0ml TRIZOL，涡旋震荡15秒，室温静置5min，12000rpm，4℃，离心10min，将上清转移到一新的RNase-free的2ml离心管中。

(2)加入200μl氯仿，用手晃动均匀后，室温静置3min，10000g，4℃，离心15min，将上清(约500μl)转移到一新的RNase-free的1.5ml离心管中。

(3)向上清中等体积的异丙醇，用手晃动均匀后，置于-20℃中30min，使RNA逐渐析出。10000g，4℃，离心10min，弃掉上清。

(4)向有RNA沉淀的1.5ml离心管中加入70％乙醇1.2ml。涡旋震荡悬浮沉淀，反复用手晃动混匀室温静置10-15min，10000rpm，4℃，离心5min，弃上清(注意避免将RNA倒出)。重复此步骤。吸净剩余液体并置于超净台中吹干(10min)。

(5)加入50μl DEPC-ddH₂O，轻弹离心管使RNA沉淀溶解，室温溶解30min。

反转录反应体系如表1所示。

表1、反转录反应体系

2、miR319、TaGAMYB3的获得及STTM319的合成

miR319引物的设计主要是基于miRbase中报道的tae-miR319前体序列(www.miRbase.org)。在小麦基因组数据库中(http://plants.ensembl.org/index.html)定位pre-miR319的位置，设计引物。从小麦基因组DNA中扩增出一个351bp的pri-miR319序列，连接T载体，测序，备用。

在EensemblePlants网站(http://plants.ensembl.org/index.html)上，查找靶基因TaGAMYB3的序列号(TraesCS3A02G336500，TraesCS3B02G367500，TraesCS3D02G329400)，并获得完整的CDS序列，我们根据A基因组上根据TaGAMYB3-3A的CDS序列设计引物用来扩增目的基因。

STTM319序列(用于干扰miR319，具体序列如SEQ ID No.5所示)由Soagon Biotech(中国上海)合成。合成的STTM319与pEASY-blunt载体连接。

以反转录的科农199叶片cDNA为模板，分别使用引物miR319-F、miR319-R以及TaGAMYB3-F、TaGAMYB3-R进行PCR扩增，引物序列如下：

miR319-F：5’-ATTAGTTGTTGAGCCATTAG-3’；

miR319-R：5’-ATTGTTGACGGTCTGTT-3’。

TaGAMYB3-F：5’-ATGAGCTTTTACAAAGACATCGT-3’；

TaGAMYB3-R：5’-TCATTTGAATTCCTCCGACATTTG-3’。

PCR反应体系如表2。

表2、PCR反应体系

成分	体积(μl)
		2×PCR Buffer for KOD FX Neo	12.5
2mM dNTPs	5
		ddH₂O	3
上游引物(10μM)	1
		下游引物(10μM)	1
cDNA模板	2
		KOD FX Neo(1U/μl)	0.5
总体积(μl)	25

反应程序：95℃3min，(98℃10sec；68℃30sec/1min30sec)×35，68℃10min。

PCR扩增产物用1.5％琼脂糖140V电压下电泳20min后，分别在0.3和1.0kb位置存在扩增条带(图1)，切下条带后使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(北京百灵克生物科技有限责任公司)回收PCR产物。再将回收的DNA片段与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物)连接20min，转化大肠杆菌感受态细胞TransT1(北京全式金生物)。过夜培养后挑单克隆，通过PCR鉴定后将单克隆测序，备用。

经测序，用引物miR319-F和miR319-R扩增得到的Pri-miR319的DNA编码序列如SEQID No.2所示；用引物TaGAMYB3-F和TaGAMYB3-R扩增得到的TaGAMYB3基因序列如SEQ IDNo.4所示。

3、tae-miR319、TaGAMYB3及STTM转基因载体构建

为了构建抗miR319切割的TaGAMYB3(rTaGAMYB3)过表达载体，我们通过PCR介导将突变引入TaGAMYB3，使得miR319不结合TaGAMYB3，同时保证TaGAMYB3氨基酸序列不发生改变。如图2所示，与miR319结合部位的TaGAMYB3碱基由5’-AUGGAGCUCCCUUCACUCCAA-3’改变为5’-AUGGAGCUGCCAUCUCUGCAA-3’(下划线部分为突变碱基)。

引物：

Myb-mF：5’-CTTTGAAGATGGAGCTGCCATCTCTGCAAGATACC-3’；

Myb-mR：5’-AGCTCCATCTTCAAAGGACCATT-3’。

以克隆得到的pri-miR319(SEQ ID No.2)、rTaGAMYB3(SEQ ID No.6)及经过合成的STTM319质粒为模板，通过在目的基因引物上增加过表达载体接头序列，进行PCR扩增。将扩增产物纯化后与酶切回收的pWMB201载体(记载于“凌悦铭.小黑麦茉莉酸诱导蛋白基因的克隆与功能分析[D].新疆:石河子大学,2020.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)使用infusion连接酶(北京博迈德基因技术有限公司)连接(体系见表3)，转化到大肠杆菌感受态细胞(Trans T1)，获得阳性克隆。提取质粒后分别进行测序验证，将测序正确的阳性克隆菌液保菌，并将提取好的质粒载体用于后续基因转化。

201-miR319载体的结构描述为：在pWMB201载体的酶切位点BamHI和SpeI之间插入SEQ ID No.2所示DNA片段的重组质粒。

201-rTaGAMYB3载体的结构描述为：在pWMB201载体的酶切位点BamHI和SpeI之间插入SEQ ID No.6所示DNA片段的重组质粒。

201-STTM319载体的结构描述为：在pWMB201载体的酶切位点BamHI和SpeI之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段的重组质粒。

表3、连接反应体系

成分	体积(μl)
		PCR纯化产物	2μl
线性化载体	2μl
		ddH₂O	1μl
2×Seamless Cloning Mix	5μl
		总体积	10μl

infusion连接，pWMB201接头序列如下：

F：5’-AGGTCGACTCTAGAGGATCCA-3’；

R：5’-TCGAGCTCTCTAGAACTAGT-3’。

二、基因转化以及表型鉴定

1、基因转化

以科农199小麦材料为受体，重组质粒201-miR319、201-STTM319、201-rTaGAMYB3以农杆菌介导的遗传转化方法分别转化小麦受体材料科农199。基因转化委托天津吉诺沃生物科技有限公司。

我们分别选取6个独立转基因株系，对于转基因植株进行miR319(201-miR319、201-STTM319)和TaGAMY3(201-rTaGAMYB3)的表达量进行荧光定量qPCR检测。

(1)miR319定量检测方法

采用RNAiso Plus Reagent(Takara)RNA提取试剂盒进行总RNA提取，方法见上文。取miR319转基因沉默与过表达植株五叶期叶片，提取组织RNA。使用加尾反转录试剂盒Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(北京宝日医生物技术有限公司)对RNA样品进行加尾反转录，得到cDNA用于miR319的定量分析。根据所得到的tae-miR319基因序列，设计一条tae-miR319的qRT-PCR引物。使用SYBR Premix Ex Taq(Takara)，进行荧光定量分析。

引物序列如下：

miR319-qPCR-F：5’-TTGGACTGAAGGGAGCTCCCT-3’。

反转录反应体系如表4所示：

表4、反转录反应体系

qRT-PCR反应体系如表5所示：

表5、qRT-PCR反应体系

成分	体积(μl)
		SYBR@Taq Ex	10
miR319-qPCR-F(10μM)	0.2
		mRQ 3’Primer(10μM)	0.2
模板	2
		ddH₂O	7.6
总体积(μl)	20

反应程序：94℃5min，(94℃30sec；60℃30sec；72℃30sec)×40，72℃7min。

(2)TaGAMY3定量检测方法

采用RNAiso Plus Reagent(Takara)RNA提取试剂盒进行总RNA提取，方法见上文。取rTaGAMYB3过表达植株五叶期叶片，提取总RNA。对RNA样品进行反转录(见上文)，获得cDNA稀释后，使用SYBR Premix Ex Taq(Takara)，进行荧光定量分析，GAPDPH为内参。

引物序列：

qMYB3-F：5’-CTTCGCTGGGATCTGGTGA-3’；

qMYB3-R：5’-AAGACGGACGAGTCAGTTGTG-3’。

GADPH-F：5’-CCTTCCGTGTTCCCACTGTTG-3’；

GADPH-R：5’-ATGCCCTTGAGGTTTCCCTC-3’。

miR319过表达和沉默植株检测结果如图3所示，在所选株型中，过表达株系，miR319的表达量显著高于野生型；沉默株型显著低于野生型。rTaGAMYB3转基因检测结果显示，过表达rTaGAMYB3植株中，TaGAMYB3的表达量显著高于野生型(图4)。

2、转基因材料表型鉴定

在孕穗期和成熟期对于转基因植株农艺性状进行统计分析。

(1)tae-miR319转基因植株表型鉴定

miR319-OE和miR319-STTM转基因植株株型都发生了显著变化。与野生型相比，miR319-OE转基因植株株高降低、分蘖数增加、穗长缩短、每穗粒数降低、旗叶长降低、茎秆变细、千粒重降低、单株产量降低，沉默株系miR319-STTM与之相反(图5和图6)。

(2)tae-miR319靶基因的转基因表型鉴定

在孕穗期和成熟期对于转基因rTaGAMYB3阳性植株农艺性状进行统计分析。

靶基因转基因表性鉴定，如图7所示，过表达靶基因rTaGAMYB3，旗叶变大，穗子变大。同时，我们以miR319-OE株系为母本，以过表达rTAGAMYB3为父本进行杂交，如图7所示，杂交后，rTAGAMYB3恢复因过表达tae-miR319植株旗叶和穗子。至此，充分证明了在小麦tae-miR319靶向TaGAMYB3调控小麦株型。

因此，本发明得出结论：miR319通过直接靶向TaGAMYB3控制小麦旗叶和穗的发育。对转基因植株重要农艺性状统计，沉默miR319后，穗粒数，千粒重及单株产量均显著提高。旗叶变大增加光合速率，茎秆变粗可以抗倒伏。

在未来大田育种中，通过对miR319的沉默或者编辑，同时也可对其靶基因TaGAMYB3的调控，可以实现对小麦株型的调控，进而大幅度提高小麦产量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> miR319-TaGAMYB3模块在调控小麦株型和增加产量上的应用

<130> GNCLN221186

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ucuccuacuc uacuaccaac ggcca 25

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

attagttgtt gagccattag ctagtttttt gttggaaaaa tgcaggagta gcagcagcag 60

gatgaggatg atgatgatga tgatgaggat gatgatgtat tagtttgagg gagctcactt 120

cagtccactc atgggaggta gcggggattg aacgagctgc cgactcattc actcgagcac 180

acagtagata tgagactagt ccagggcata ccagtatgtt acaatatgta ctgtgcgaat 240

gagcgaatgc agcgggagat tgttctctct ttcctcctcc atgcttggac tgaagggagc 300

tccctcatct ctcatcagct tcatcaggaa tatgaacaga ccgtcaacaa t 351

<210> 3

<211> 586

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ser Phe Tyr Lys Asp Ile Val Gly Ala Ser Tyr Ser Thr Gly Thr

1 5 10 15

Ser His Pro Thr Gln Arg Ala Asn Pro Ala Ile Asn Pro Gly His Asp

20 25 30

Gly Glu Met Tyr Arg Val Lys Ser Glu Ser Asp Cys Glu Met Met His

35 40 45

Gln Glu Asp Gln Met Asp Ser Pro Val Gly Asp Asp Gly Ser Ser Gly

50 55 60

Gly Ser Pro His Arg Gly Gly Gly Pro Pro Leu Lys Lys Gly Pro Trp

65 70 75 80

Thr Ser Ala Glu Asp Ala Ile Leu Val Asp Tyr Val Lys Lys His Gly

85 90 95

Glu Gly Asn Trp Asn Ala Val Gln Lys Asn Thr Gly Leu Phe Arg Cys

100 105 110

Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ala Asn His Leu Arg Pro Asn Leu

115 120 125

Lys Lys Gly Ala Phe Thr Pro Glu Glu Glu Arg Leu Ile Ile Gln Leu

130 135 140

His Ser Lys Met Gly Asn Lys Trp Ala Arg Met Ala Ala His Leu Pro

145 150 155 160

Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Arg Ile Lys

165 170 175

Arg Cys Gln Arg Ala Gly Leu Pro Ile Tyr Pro Ala Ser Val Cys Asn

180 185 190

Gln Ser Ser Asn Glu Asp Gln Gln Gly Ser Ser Asp Phe Asn Cys Gly

195 200 205

Glu Asn Leu Ser Ser Asp Leu Leu Asn Gly Asn Gly Leu Tyr Leu Pro

210 215 220

Asp Phe Thr Cys Asp Asn Phe Ile Ala Asn Ser Glu Ala Leu Ser Tyr

225 230 235 240

Ala Pro Gln Leu Ser Ala Val Ser Ile Ser Ser Leu Leu Gly Gln Ser

245 250 255

Phe Ala Ser Lys Asn Cys Gly Phe Met Asp Gln Val Asn Gln Ala Gly

260 265 270

Met Leu Lys Gln Ser Asp Pro Leu Leu Pro Gly Leu Ser Asp Thr Ile

275 280 285

Asn Gly Ala Leu Ser Ser Val Asp Gln Phe Ser Asn Asp Ser Glu Asn

290 295 300

Leu Lys Lys Ala Leu Gly Phe Asp Tyr Leu His Glu Ala Asn Ser Ser

305 310 315 320

Ser Lys Met Ile Ala Pro Phe Gly Gly Thr Leu Thr Gly Ser His Ala

325 330 335

Phe Leu Asn Gly Thr Phe Ser Thr Ser Arg Thr Ile Asn Gly Pro Leu

340 345 350

Lys Met Glu Leu Pro Ser Leu Gln Asp Thr Glu Ser Asp Pro Asn Ser

355 360 365

Trp Leu Lys Tyr Thr Val Ala Pro Ala Met Gln Pro Thr Glu Leu Val

370 375 380

Asp Pro Tyr Leu Gln Ser Pro Thr Ala Thr Pro Ser Val Lys Ser Glu

385 390 395 400

Cys Val Ser Pro Arg Asn Ser Gly Leu Leu Glu Glu Leu Leu His Glu

405 410 415

Ala Gln Gly Leu Lys Ser Gly Lys Asn Gln Gln Leu Ser Val Arg Ser

420 425 430

Ser Ser Ser Ser Val Ser Thr Pro Arg Asp Thr Thr Val Val Ser Pro

435 440 445

Glu Phe Asp Ile Cys Gln Asp Tyr Trp Glu Glu Pro Leu Asn Glu Tyr

450 455 460

Ala Pro Phe Ser Gly Asn Ser Leu Thr Gly Ser Thr Ala Pro Val Ser

465 470 475 480

Ala Ala Pro Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Lys Ile Ser Pro Ala Gln

485 490 495

Ser Pro Ser Leu Gly Ser Gly Glu Gln Ala Met Glu Pro Ala Tyr Glu

500 505 510

Pro Gly Ala Gly Asp Thr Ser Ser His Pro Glu Asn Phe Arg Pro Asp

515 520 525

Ala Leu Phe Ser Gly Asn Thr Thr Asp Ser Ser Val Phe Asn Asn Ala

530 535 540

Ile Ala Met Leu Leu Gly Asn Asp Met Asn Thr Asp Cys Lys Pro Val

545 550 555 560

Phe Gly Asp Gly Ile Val Phe Asp Thr Ser Pro Trp Ser Asn Met Pro

565 570 575

His Ala Cys Gln Met Ser Glu Glu Phe Lys

580 585

<210> 4

<211> 1761

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgagctttt acaaagacat cgtaggcgcc tcgtattcga cgggaacatc tcatcccact 60

caacgcgcaa accctgcaat caatccaggg cacgacggag agatgtaccg ggtgaagagc 120

gagagcgact gcgagatgat gcatcaggag gaccagatgg actcgccggt gggcgacgac 180

ggcagcagcg gagggtcgcc ccacaggggc ggcgggccgc ctctgaagaa gggcccctgg 240

acgtcggcgg aggacgccat cctggtggac tacgtgaaga agcacggcga ggggaactgg 300

aacgcggtgc agaagaacac cgggttgttc cggtgcggca agagctgccg cctccggtgg 360

gcgaaccacc tcaggcccaa cctcaagaag ggggccttca cccccgagga ggagaggctc 420

atcatccagc tccactccaa gatgggcaac aagtgggctc ggatggccgc tcatttgcca 480

gggcgtactg acaatgaaat aaagaattac tggaacactc gaataaagag atgtcagcga 540

gctggcttgc caatatatcc tgctagcgta tgcaaccaat cttcaaatga agatcagcag 600

ggctccagcg atttcaactg cggcgagaat ctttccagtg accttctgaa tggaaatggt 660

ctttatctgc cagattttac ctgtgacaat ttcattgcta attcagaggc tttatcttat 720

gcaccacagc tttcagctgt ttcaataagc agtttgcttg gtcagagctt tgcatccaaa 780

aactgcggct tcatggatca agtaaaccaa gcagggatgc taaaacagtc tgacccttta 840

ctccctggat tgagcgacac catcaatggc gcgctctcct cggtcgatca gttctcaaat 900

gactctgaga atctcaagaa ggctctgggt tttgactatc tccatgaagc caactctagc 960

agcaagatga ttgcaccatt tgggggtaca cttactggca gccatgcctt tttaaatggc 1020

accttctcta cttctaggac catcaatggt cctttgaaga tggagctccc ttcactccaa 1080

gataccgaat ctgatccgaa tagctggctc aagtataccg tggctcctgc gatgcagcct 1140

acggagttgg ttgatcccta ccttcagtct ccgacagcaa ctccgtcagt gaagtcggag 1200

tgtgtgtcgc caaggaacag cggtctcttg gaagagctgc ttcatgaagc tcagggacta 1260

aaatctggga agaatcagca gctttccgtg agaagttcaa gttcctctgt cagtacgccg 1320

cgtgatacta cggtggttag cccagagttt gatatctgtc aggactattg ggaagaacct 1380

ctgaatgaat atgctccttt cagtggcaat tcactcactg gatccacggc tcctgttagc 1440

gctgcgccgc ctgatgtttt tcagctctcc aaaatttctc ctgcacaaag cccttcgctg 1500

ggatctggtg agcaggcaat ggagcctgca tatgagcctg gggctgggga cacttcgtct 1560

catcctgaaa acttcaggcc agacgcactc ttctccggga acacaactga ctcgtccgtc 1620

ttcaacaacg ccatagccat gctcctgggc aacgacatga acacggactg caagcctgtt 1680

ttcggcgacg gtatcgtgtt tgatacttcc ccgtggagca acatgccaca tgcttgccaa 1740

atgtcggagg aattcaaatg a 1761

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

agggagctcc cctattcagt ccaagttgtt gttgttatgg tctaatttaa atatggtcta 60

aagaagaaga atagggagct cccctattca gtccaa 96

<210> 6

<211> 1761

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgagctttt acaaagacat cgtaggcgcc tcgtattcga cgggaacatc tcatcccact 60

caacgcgcaa accctgcaat caatccaggg cacgacggag agatgtaccg ggtgaagagc 120

gagagcgact gcgagatgat gcatcaggag gaccagatgg actcgccggt gggcgacgac 180

ggcagcagcg gagggtcgcc ccacaggggc ggcgggccgc ctctgaagaa gggcccctgg 240

acgtcggcgg aggacgccat cctggtggac tacgtgaaga agcacggcga ggggaactgg 300

aacgcggtgc agaagaacac cgggttgttc cggtgcggca agagctgccg cctccggtgg 360

gcgaaccacc tcaggcccaa cctcaagaag ggggccttca cccccgagga ggagaggctc 420

atcatccagc tccactccaa gatgggcaac aagtgggctc ggatggccgc tcatttgcca 480

gggcgtactg acaatgaaat aaagaattac tggaacactc gaataaagag atgtcagcga 540

gctggcttgc caatatatcc tgctagcgta tgcaaccaat cttcaaatga agatcagcag 600

ggctccagcg atttcaactg cggcgagaat ctttccagtg accttctgaa tggaaatggt 660

ctttatctgc cagattttac ctgtgacaat ttcattgcta attcagaggc tttatcttat 720

gcaccacagc tttcagctgt ttcaataagc agtttgcttg gtcagagctt tgcatccaaa 780

aactgcggct tcatggatca agtaaaccaa gcagggatgc taaaacagtc tgacccttta 840

ctccctggat tgagcgacac catcaatggc gcgctctcct cggtcgatca gttctcaaat 900

gactctgaga atctcaagaa ggctctgggt tttgactatc tccatgaagc caactctagc 960

agcaagatga ttgcaccatt tgggggtaca cttactggca gccatgcctt tttaaatggc 1020

accttctcta cttctaggac catcaatggt cctttgaaga tggagctgcc atctctgcaa 1080

gataccgaat ctgatccgaa tagctggctc aagtataccg tggctcctgc gatgcagcct 1140

acggagttgg ttgatcccta ccttcagtct ccgacagcaa ctccgtcagt gaagtcggag 1200

tgtgtgtcgc caaggaacag cggtctcttg gaagagctgc ttcatgaagc tcagggacta 1260

aaatctggga agaatcagca gctttccgtg agaagttcaa gttcctctgt cagtacgccg 1320

cgtgatacta cggtggttag cccagagttt gatatctgtc aggactattg ggaagaacct 1380

ctgaatgaat atgctccttt cagtggcaat tcactcactg gatccacggc tcctgttagc 1440

gctgcgccgc ctgatgtttt tcagctctcc aaaatttctc ctgcacaaag cccttcgctg 1500

ggatctggtg agcaggcaat ggagcctgca tatgagcctg gggctgggga cacttcgtct 1560

catcctgaaa acttcaggcc agacgcactc ttctccggga acacaactga ctcgtccgtc 1620

ttcaacaacg ccatagccat gctcctgggc aacgacatga acacggactg caagcctgtt 1680

ttcggcgacg gtatcgtgtt tgatacttcc ccgtggagca acatgccaca tgcttgccaa 1740

atgtcggagg aattcaaatg a 1761

Claims

1.如下a）和/或b）在如下P1至P12任一中的应用：

a）miR319或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够转录成所述miR319的DNA分子或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

b）TaGAMYB3蛋白或其相关生物材料；所述相关生物材料为能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

P1、调控小麦株型；

P2、调控小麦产量；

P3、调控小麦株高；

P4、调控小麦分蘖数；

P5、调控小麦穗长；

P6、调控小麦每穗颖花数；

P7、调控小麦每穗粒数；

P8、调控小麦旗叶长；

P9、调控小麦旗叶宽；

P10、调控小麦茎秆粗细；

P11、调控小麦千粒重；

P12、调控小麦单株产量；

所述miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示；

所述miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列；

所述TaGAMYB3蛋白为如下（A1）或（A2）所示的蛋白质：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控体现为如下任一：

（a1）使所述小麦体内miR319的表达量增加，和/或使所述小麦体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性降低，所述小麦的株高降低和/或分蘖数增多和/或穗长缩短和/或每穗粒数降低和/或旗叶长降低和/或茎秆变细和/或千粒重降低和/或单株产量降低；

（a2）使所述小麦体内miR319的表达量减少，和/或使所述小麦体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性增加，所述小麦的株高增高和/或分蘖数减少和/或穗长增加和/或每穗颖花数增多和/或每穗粒数增多和/或旗叶长增加和/或旗叶宽增加和/或茎秆变粗和/或千粒重增加和/或单株产量增加。

3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：能够转录成所述miR319的DNA分子如SEQID No.2所示。

4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子为SEQ ID No.4所示的DNA分子。

5.培育具有如下（b1）-（b8）所示性状中至少一种的小麦品种的方法，包括使小麦体内miR319的表达量增加和/或使所述小麦体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

（b1）株高降低；（b2）分蘖数增多；（b3）穗长缩短；（b4）每穗粒数降低；（b5）旗叶长降低；（b6）茎秆变细；（b7）千粒重降低；（b8）单株产量降低；

所述miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示；

所述miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列；

所述TaGAMYB3蛋白为如下（A1）或（A2）所示的蛋白质：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

6.培育具有如下（c1）-（c11）所示性状中至少一种的小麦品种的方法，包括使小麦体内miR319的表达量减少，和/或使所述小麦体内TaGAMYB3蛋白的表达量和/或活性增加的步骤；

（c1）株高增高；（c2）分蘖数减少；（c3）穗长增加；（c4）每穗颖花数增多；（c5）每穗粒数增多；（c6）旗叶长增加；（c7）旗叶宽增加；（c8）茎秆变粗；（c9）千粒重增加；（c10）单株产量增加；（c11）产量提高；

所述miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示；

所述miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列；

所述TaGAMYB3蛋白为如下（A1）或（A2）所示的蛋白质：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

7.培育具有如下（b1）-（b8）所示性状中至少一种的转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入能够转录成miR319的DNA分子，和/或对所述受体小麦中能够表达TaGAMYB3蛋白的核酸分子进行敲除或敲低的步骤；

所述miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示；

所述miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列；

所述TaGAMYB3蛋白为如下（A1）或（A2）所示的蛋白质：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：能够转录成所述miR319的DNA分子是通过重组载体的形式导入所述受体小麦的。

9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：能够转录成所述miR319的DNA分子如SEQID No.2所示。

10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子为SEQ ID No.4所示的DNA分子。

11.培育具有如下（c1）-（c11）所示性状中至少一种的转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入能够沉默miR319表达的转基因载体和/或向所述受体小麦中导入能够表达TaGAMYB3蛋白的核酸分子的步骤；

所述miR319的成熟体序列如SEQ ID No.1所示；

所述miR319的前体序列为将SEQ ID No.2中的T替换为U后所得序列；

所述TaGAMYB3蛋白为如下（A1）或（A2）所示的蛋白质：

（A1）氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子是通过重组载体的形式导入所述受体小麦的；

能够沉默所述miR319表达的转基因载体上含有如SEQ ID No.5所示片段。

13. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于：能够表达所述TaGAMYB3蛋白的核酸分子为SEQ ID No.4所示的DNA分子。