CN111748556A - SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系 - Google Patents

SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系。所述SlmiR319b序列如SEQ ID NO.1所示。将SlmiR319b序列经限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切，连接至pCAMBIA3301载体中，得到重组质粒pCAMBIA3301/Luc‑preSlmiR319b。本发明通过人工合成番茄miR319b的前体序列SlmiR319b并构建过表达转基因材料，过表达miR319b，揭示了miR319b在番茄植株高度以及根系发育状态的调控作用，该SlmiR319b序列还可以在调控番茄果实产量中得到应用，为解决番茄等果菜类蔬菜的株型和果实品质提供一条有效途径。

Description

SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转 基因株系
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系。
背景技术
株型是作物增产的一个重要因素，番茄作为喜光蔬菜，也是研究果实发育的重要模式作物，所以株型对番茄生产的影响尤为重要。株型作为植物的形态特征，主要包含植株的高度、叶片大小、叶夹角、扩展幅度等植物学性状。目前株型研究集中在小麦和水稻等大田作物上。理想株型的研究最早在水稻上开展。日本栽培雪茄的松岛省三最早提出水稻的理想株型具备矮杆、短穗、多穗、叶片短厚等具体的形态指标。株型育种已经成为育种学家和栽培学家重点关注的课题。除水稻理想株型的研究，玉米株型也受到越来越多的关注。
但是蔬菜作物的株型研究很少，番茄株型方面的研究更少。佟友丽(佟友丽.番茄株型特性的研究[博士学位论文].沈阳农业大学，2001)筛选出在番茄中叶形差异较大的品系，并对其进行研究。结果表明，上举型番茄的叶形紧凑，更好地适应环境，同时果实产量也随之提高。番茄株型相关基因的研究主要集中在以下几个方面：SlGRAS转录因子可以调控番茄植株高度、叶片大小以及侧枝数(Naeem M.,Waseem M.,Zhu Z.G.,Zhang L.C.(2020)Downregulation of SlGRAS15 manipulates plant architecture in tomato(Solanumlycopersicum).Development Genes and Evolution 230:1-12.)；SlCAND1沉默后也会导致矮化番茄植株，缺少顶端优势以及异常的根构型(Cheng W.J.,Yin S.Q.,Tu Y.,Mei H.,Wang Y.Z.,Yang Y.W.(2020)SlCAND1,encoding cullin-associated Nedd8-dissociatedprotein 1,regulates plant height,flowering time,seed germination,and rootarchitecture in tomato.Plant Molecular Biology 102:537-551.)；SlYABBY2b可以通过赤霉素路径调控番茄植株高度(Sun M.H.,Li H.,Li Y.B.,Xiang H.Z.,Liu Y.D.,HeY.,Qi M.F.,Li T.L.(2020)Tomato YABBY2b controls plant height throughregulating indole-3-acetic acid-amido synthestase(GH3.8)expression.PlantScience 297:110530.)。
miRNA319是20个保守的miRNA家族之一，且主要靶向TCP转录因子。miR319家族是发现较早的一类高度保守的microRNA家族。miR319与植物叶、花器官的生长发育密切相关。TCP转录因子是miR319的靶基因。miR319直接定量调控TCP4调控拟南芥叶片的大小。miR319靶基因的功能主要是TCP转录因子。miR319通过调控TCPs的表达影响下胚轴的发育。水稻中miR319bc过表达可以增加叶片宽度和增强耐冷性。miR319还可以控制植物对干旱和盐胁迫的反应。虽然miR319在调控拟南芥叶片大小和水稻叶片大小等方面具有应用效果，但是，现有技术并未发现miRNA319序列或者其相似序列在调控植株高度、根构型方面的应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系。
本发明的第一个目的是提供一种SlmiR319b在调控番茄株型中的应用，所述SlmiR319b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种含有所述的SlmiR319b核苷酸序列的重组质粒。
本发明的第三个目的是提供一种所述的重组质粒的构建方法，包括：人工合成SlmiR319b核苷酸序列；将SlmiR319b序列经限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切，连接至pCAMBIA3301载体中，得到重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b。
本发明的第四个目的是提供一种包含所述的重组质粒的农杆菌。
本发明的第五个目的是提供一种包含所述的重组质粒的转基因番茄株系。
本发明的第六个目的是提供一种所述的转基因番茄株系的构建方法，包括以下步骤：
以重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b转化农杆菌，获得转化菌菌液；
以野生型栽培番茄作为遗传转化材料，取饱满完整的种子，利用所述农杆菌菌液进行遗传转化，并培养获得转化植株；
从番茄植株叶片中提取基因组DNA，以miR319b-F/miR319b-R为引物进行PCR鉴定；
miR319b-F:TCTAGA ATTTTGTGATTTAGATGTAATGTGG
miR319b-R:CCCGGGCTTCCACATTACATCTAAATCACA
以转化植株为检测对象，以重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b为阳性对照，以未转化的野生型JZ34为阴性对照；若检测对象的扩增结果与阳性对照一致，则该检测对象为阳性转化植株；
对上述筛选出阳性转化植株进行TCP10表达水平检测，以野生型JZ34的TCP10表达量为对照，TCP10的表达水平低于野生型JZ34的为目的转基因番茄株系。
与现有技术相比，本发明提供的SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系，具有以下有益效果：
1、本发明通过人工合成番茄miR319b前体序列并构建过表达转基因材料，过表达miR319b，揭示了miR319b在番茄植株高度以及根系发育状态的调控作用。进而该SlmiR319b还可以在调控番茄果实产量中得到应用，为解决番茄等果菜类蔬菜的株型和果实品质提供一条有效途径。对番茄高产株型的分子机制研究以及高产品种选育具有重要的理论及实际指导意义。
附图说明
图1为pCAMBIA3301/Luc过表达载体转化入大肠杆菌的菌液PCR产物凝胶电泳图；
图中M泳道为DL 2000DNA marker；1-5泳道均为miR319b目的片段；
图2为构建转基因植株构建流程图；
图中a，无菌苗；b，共培养；c，培养皿生芽；d，组培瓶生芽；e，生根；f，移栽；
图3为转基因植株的PCR检测图；
图中M泳道为DL 2000DNA marker；质粒泳道为阳性对照，WT泳道为阴性对照，1-10泳道均为转基因株；
图4为过表达miR319b番茄转基因株系miR319b表达量分析；
图中L1-10、L12、L14、L16-17：过表达株系；每组数据为三次重复平均值，#表示JZ34对照，*代表与JZ34差异显著性p＜0.05，**代表与JZ34差异显著性p＜0.01；注：L3的miR319b表达量降低，不是目的植株，所以未进行差异分析；
图5为miR319b与靶基因TCP10序列对比；
图6为过表达miR319b番茄转基因株系TCP10表达量分析；
图中L6-9、L12、L14、L16-17：过表达植株，每组数据为三次重复平均值，#表示JZ34对照，**代表与JZ34差异显著性p＜0.01；注：TCP10表达量升高的几株不是目的植株，所以未进行差异分析；
图7为野生型JZ34和35S:SlmiR319b番茄株型对比；
图8为野生型JZ34和35S:SlmiR319b番茄水培第0d、7d根系发育对比；
图9为35S:SlmiR319b和野生型JZ34番茄水培第0d、12h、24h、3d、7d的叶片叶绿素含量对比。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明提供了一种人工合成的SlmiR319b序列在调控番茄株型中的应用，具体的，SlmiR319b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
利用上述SlmiR319b序列制备转基因番茄株型的方法如下：
步骤1，miR319b的前体序列合成
miR319b的前体序列命名为SlmiR319b，SlmiR319b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为
GTCCCCTTTTTTAAGATTCTAATTTTGTGATTTAGATGTAATGTGGAAGATGGTATAAGAGAGCTTCCTTTAGTCCACTCATAGGTAGACGAAGGATTTGAATTATCTCCCGACTCATTCATTCAAACGCAATAGGAAGTATGTAATCTTATACTATTGTGAATGTGTGAATGATGCGGGAGATAAATTCTCTCCTTTTTATCTGTGCTTGGACTGAAGGGAGCTCCCTTTTACCTTCTTTCTTCGGTTCCCGGG
其中，酶切位点为：TCTAGA；CCCGGG。
步骤2，构建过表达miR319b的pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒
将SlmiR319b的序列连接于PM18-T载体中，通过限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ进行双酶切；pCAMBIA3301载体也进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切；两个长片段的酶切产物相连接，得到pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒；pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选获得的大肠杆菌菌液进行PCR扩增鉴定(如图1)，菌液均扩增出与目的基因大小一致的条带。将鉴定正确的菌液提取重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b，采用液氮冻融法转入根癌农杆菌感受态GV3101中，用于番茄的遗传转化。
步骤3，构建转基因植株
以野生型栽培番茄JZ34作为遗传转化材料，取200粒饱满完整的种子，利用农杆菌介导的叶盘法进行遗传转化。过程如图2所示，培养JZ34的无菌苗(图2a)，当子叶完全展开时进行切苗，将pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒转化的农杆菌菌液进行侵染，在共培养基上暗培养2天(图2b)。之后将子叶转移至含有生芽培养基的培养皿中生芽(图2c)，大约一个周后，将愈伤组织完全切除，转移至含有生芽培养基的组培瓶中(图2d)。培养大约1个月左右，再次切除愈伤组织，将其转入生根培养基中(图2e)，待根系发育健壮，洗净根系移栽至经过高温灭菌的基质中(图2f)。
步骤4，过表达miR319b番茄转基因阳性植株的鉴定
为明确miR319b基因在番茄中的功能，首先根据pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒上的Bar基因位点设计特异引物进行检测，引物为Bar-F:GAAGTCCAGCTGCCAGAAA，SEQ ID NO.2；Bar-R:CACCATCGTCAACCACTACAT，SEQ ID NO.3。用Bar基因去筛选遗传稳定的阳性植株。从番茄叶片中提取基因组DNA进行PCR鉴定，以重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b为阳性对照，以未转化的野生型JZ34为阴性对照，结果发现在10个转基因株系均检测到Bar基因的表达，且大小与质粒扩增出的片段大小一致，未转化的JZ34中未检测到Bar基因表达。PCR产物检测结果如图3所示，这10个株系均为转基因阳性植株(对应图4的L1-L10)，可以用于后续的试验分析。
步骤5，过表达miR319b番茄转基因阳性植株表达量分析
利用步骤4的方法共筛选出14株阳性转基因株系，对应编号为L1-L10、L12、L14、L16、L17，并对14株过表达miR319b转基因株系提取总RNA，通过正常反转录成cDNA和茎环反转录，进行实时定量PCR分析。以野生型JZ34的miR319b表达量为对照，对鉴定出的14株转基因株系的miR319b表达量进行分析，发现有13株转基因株系的表达水平显著高于对照，如图4，只有株系L3的表达量显著低于对照，对这一株系进行舍去。其中株系L16的表达水平高于对照大约9倍，株系L6、L7、L12和L17均高于对照4-5倍。实时定量的结果表明了构建的过表达miR319b的pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒能够升高番茄中的miR319b表达水平，也进一步验证步骤4筛选的转基因植株基本都是阳性植株。
根据序列比对预测已表明miR319b可以与靶基因TCP10互补，参见图5，因此，对上述筛选出miR319b表达量高的株系进行TCP10表达水平检测。结果如图6所示，以野生型JZ34的TCP10表达量为对照，株系L6、L8、L9、L12和L14的TCP10的表达水平显著低于对照，且比野生型JZ34番茄下降约3-4倍。对其他株系进行舍去。结果进一步验证pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b重组质粒成功转入番茄并起到提高miR319b表达水平并且降低TCP10表达水平的作用。选取过表达株系L6、L8、L9、L12和L14进行定植收取种子，用于下一步试验的鉴定。
步骤6，过表达miR319b番茄转基因株系株型及根系发育
对步骤5筛选转基因阳性株系L6、L8、L9、L12和L14进行初步的表型鉴定，选取经过PCR鉴定的过表达miR319b的转基因纯合L6的T1代株系(命名为35S:SlmiR319b)和野生型JZ34进行指标测定。从图7-8中可以看出，过表达miR319b的转基因番茄株系35S:SlmiR319b(图7中的两株OE)的株高要显著低于野生型JZ34对照。野生型JZ34的根系长势更强，而过表达株系移栽水培第0d和第7d的根系较为稀疏(图8)。
对转基因番茄株系35S:SlmiR319b进行叶片叶绿素含量进行测定，发现过表达miR319b的株系35S:SlmiR319b中番茄叶片叶绿素含量番茄移栽水培7d后增高(图9)。待番茄果实成熟，对其品质进行测定，从表1番茄果实大小上看转基因株系35S:SlmiR319b番茄果实并没有显著改变，但在果实品质上，转基因株系35S:SlmiR319b番茄果实可溶性固形物含量要显著低于对照野生型JZ34。
表1 35S:SlmiR319b与JZ34果实大小及品质变化情况
WT(JZ34) 35S:SlmiR319b
果重(g) 59.91±25.14a 65.09±22.68a
果径(cm) 5.13±0.73a 5.26±0.54a
可溶性固形物(％) 6.08±0.80a 3.51±0.72b
注：不同字母代表两个样品数据差异显著。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtcccctttt ttaagattct aattttgtga tttagatgta atgtggaaga tggtataaga 60
gagcttcctt tagtccactc ataggtagac gaaggatttg aattatctcc cgactcattc 120
attcaaacgc aataggaagt atgtaatctt atactattgt gaatgtgtga atgatgcggg 180
agataaattc tctccttttt atctgtgctt ggactgaagg gagctccctt ttaccttctt 240
tcttcggttc ccggg 255
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gaagtccagc tgccagaaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
caccatcgtc aaccactaca t 21

Claims (6)

1.一种SlmiR319b在调控番茄株型中的应用，其特征在于，所述SlmiR319b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种含有权利要求1所述的SlmiR319b核苷酸序列的重组质粒。
3.根据权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括：人工合成SlmiR319b核苷酸序列；将SlmiR319b核苷酸序列经限制性内切酶XbaI和SmaI双酶切，连接至pCAMBIA3301载体中，得到重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b。
4.一种包含权利要求2所述的重组质粒的农杆菌。
5.一种包含权利要求2所述的重组质粒的转基因番茄株系。
6.根据权利要求5所述的转基因番茄株系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
以重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b转化农杆菌，获得转化菌菌液；
以野生型栽培番茄作为遗传转化材料，取饱满完整的种子，利用所述农杆菌菌液进行遗传转化，并培养获得转化植株；
从番茄植株叶片中提取基因组DNA，以miR319b-F/miR319b-R为引物进行PCR鉴定；
miR319b-F:TCTAGA ATTTTGTGATTTAGATGTAATGTGG
miR319b-R:CCCGGGCTTCCACATTACATCTAAATCACA
以转化植株为检测对象，以重组质粒pCAMBIA3301/Luc-preSlmiR319b为阳性对照，以未转化的野生型JZ34为阴性对照；若检测对象的扩增结果与阳性对照一致，则该检测对象为阳性转化植株；
对上述筛选出阳性转化植株进行TCP10表达水平检测，以野生型JZ34的TCP10表达量为对照，TCP10的表达水平低于野生型JZ34的为目的转基因番茄株系。
CN202010724278.9A 2020-07-24 2020-07-24 SlmiR319b在调控番茄株型中的应用及重组质粒、重组菌、转基因株系 Active CN111748556B (zh)

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