CN114480487A - 水稻转录因子OsMADS61及其应用 - Google Patents

水稻转录因子OsMADS61及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超量表达载体pUbi‑MADS61及其构建方法。本发明还公开了水稻转录因子OsMADS61、所述的超量表达载体pUbi‑MADS61在提高OsSWEET11基因表达量或促进水稻灌浆或增加结实率、千粒重或最终水稻产量中的应用。本发明的转基因材料结实率显著提高；转基因材料千粒重为28.9g，与野生型相比千粒重显著增加。本发明公开的OsMADS61超表达材料与野生相比产量提高15%，千粒重和结实率是影响水稻最终产量的重要指标，有可能是由于OsMADS61超表达后显著促进蔗糖转运，从而促进灌浆使产量得到提高。

Description

水稻转录因子OsMADS61及其应用
技术领域
本发明涉及水稻转录因子OsMADS61及其应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
MADS家族是一类数量庞大，分布广泛的基因家族。在植物(单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、笞藓、藻类)、动物、真菌(酵母)等物种中都发现了该类基因的存在，是一类十分重要的转录调控因子。MADS-box基因现分为两类：I型和II型，目前研究更为广泛的是II型基因，其又被称为MIKC型基因，是该类型所有基因中已鉴定出的四个不同结构域的缩写。II型基因的关键结构域包括N端的60个高度保守氨基酸的MADS-box结构域(DNA结合的关键区域)，约30个较为不保守氨基酸的I区域(与DNA结合形成二聚体的关键部位)，约70个保守氨基酸的K-box区域(蛋白互作域)和高度可变的C末端(参与转录激活和多聚体转录因子复合物的形成)，在调控植物器官生长发育、响应逆境胁迫上有着关键作用。
现阶段，在水稻中已经发现了大约75个MADS-box转录因子，但只有少数基因功能被研究出来。目前被鉴定出功能的MADS-box基因主要参与分蘖、花发育、根系发育、营养吸收、抗逆等。
水稻籽粒主要由淀粉组成，其来源于输入的可溶性碳水化合物。这些碳水化合物通过韧皮部从叶片(源组织)并传递到颖果(库组织)。而蔗糖是水稻韧皮部汁液中转运的主要糖类。为了填满种子，大量的蔗糖必须被运输到发育中的颖果。蔗糖从进入种皮的韧皮部链中卸载，糖从那里转移到发育中的颖果中以向细胞提供营养，特别是糖作为能量来源和细胞壁和淀粉生物合成的碳骨架。SWEET(Sugars Will Eventually be ExportedTransporters)是一类新鉴定的、广泛存在于不同类型真核生物中的糖运输蛋白。利用FRET技术对拟南芥中17个SWEET家族成员进行糖运输活性检测，发现该家族成员不同程度的表现出对不同糖具有吸收活性，并在拟南芥中验证其具有多重生理功能，主要表现在糖的转运、与病原微生物相互作用、植物的抗逆作用、胚及胚乳的发育等。
目前还没有报道过关于转录因子OsMADS61关于水稻的灌浆，提高结实率和千粒重的功能。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了超量表达载体pUbi-MADS61及其构建方法和应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了水稻转录因子OsMADS61或超量表达载体pUbi-MADS61在提高促进植物灌浆或增加结实率、千粒重或最终植物产量中的应用。
本发明的水稻转录因子OsMADS61的基因序列在NCBI网站登录号是AK243669.1。
技术方案：本发明提供了一种超量表达载体pUbi-MADS61的构建方法，所述超量表达载体pUbi-MADS61的构建方法包括以下步骤：
1)水稻种子总RNA的提取；
2)步骤1)的总RNA反转录得到总cDNA；
3)以步骤2)得到的总cDNA为模板，设计PCR引物，扩增得到产物OsMADS61基因的cDNA，然后将扩增产物连接载体导入感受态细胞中，获得的阳性菌提取得到质粒：
4)根据水稻基因OsMADS61的cDNA序列，设计PCR引物，扩增得到的产物与步骤3)得到的质粒连接导入感受态细胞中，获得的阳性菌提取得到质粒即为超量表达载体pUbi-MADS61。
其中，所述步骤3)中的PCR引物序列为：
OsMADS61-CDS-F：ATGGGGAGGGGCAAGATAGT
OsMADS61-CDS-R：TCATGGATGCAATTGGAGCC。
其中，所述步骤4)中的PCR引物序列为：
OsMADS61 OE-F：CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGGGAGGGGCAAGA
OsMADS61 OE-R：GGTCTTTGTAGTCCATACTAGTTGGATGCAATTGGAGC。
本发明内容还包括所述的构建方法得到的超量表达载体pUbi-MADS61。
本发明内容还包括水稻转录因子OsMADS61、所述的超量表达载体pUbi-MADS61在提高OsSWEET11基因表达量或促进水稻灌浆或增加结实率、千粒重或最终水稻产量中的应用。
本发明内容还包括所述一种获得具有高产量植物的方法，所述方法包括使植物包含水稻转录因子OsMADS61或所述的超量表达载体pUbi-MADS61。
其中，所述方法具体包括如下步骤：将所述的超量表达载体pUbi-MADS61转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞，得到阳性菌落，然后将转有pUbi-OsMADS61质粒的农杆菌侵染预先准备好的Hwayoung愈伤组织，然后转入含有抗生素培养基上进行第一轮筛选；2-3周后将仍然正常生长的愈伤组织转移至含有抗生素培养基上进行第二轮筛选；2周后，将新长出的阳性愈伤组织转入分化培养基中进行分化，一个月后出苗，将分化出的水稻幼苗转移至生根培养基中，生根培养7-10天，经过炼苗后获得完整的转基因水稻植株T0代；对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T1代和T2代材料。
其中，所述植物为大豆、棉花、烟草、水稻、玉米或小麦中的一种。
本发明内容还包括所述鉴定植物的方法，其中植物是包含所述的方法获得的植物，其特征在于，所述方法包括测定所述植物是否包含水稻转录因子OsMADS61或所述的超量表达载体pUbi-MADS61。
其中，所述植物为大豆、棉花、烟草、水稻、玉米或小麦中的一种。
该水稻转录因子OsMADS61在调控水稻灌浆过程、氮素吸收，提高氮肥利用效率和/或最终产量方面的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：
1、通过系统研究，本发明首次提供了水稻转录因子OsMADS61的生物学功能，发现超表达植株灌浆效果更好，具有更高的结实率和千粒重。
2、利用特异引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)研究OsMADS61在开花期的表达，发现OsMADS61在幼穗中表达。
3、OsMADS61基因超表达后OsSWEET11基因表达量增加，增大了水稻的蔗糖运输，促进灌浆从而使水稻产量得到提高。
此外，与野生型水稻相比，转基因材料(OE1、OE2、OE3)结实率显著提高；转基因材料(OE1、OE2、OE3)千粒重为28.9g，与野生型相比千粒重显著增加。本发明公开的OsMADS61超表达材料(OE1、OE2、OE3)与野生相比产量提高15％，千粒重和结实率是影响水稻最终产量的重要指标，有可能是由于OsMADS61超表达后显著促进蔗糖转运，从而促进灌浆使产量得到提高。
附图说明
图1：水稻开花期OsMADS61的表达模式；
图2：T2代OsMADS61三个超表达株系(OE1、OE2、OE3)的超表达效果鉴定(WT是wildtype，OE1、OE2和OE3分别是三个独立的超表达株系)；
图3：T2代三个超表达株系(OE1、OE2、OE3)的千粒重相对于野生型(Hwayoung)显著增加；
图4：T2代三个超表达株系(OE1、OE2、OE3)的籽粒大小相对于野生型(Hwayoung)显著增大；
图5：T2代OsMADS61超表达材料(OE1、OE2、OE3)与野生型(Hwayoung)相比结实率显著增加；
图6：统计的单株收获的种子重量，T2代OsMADS61超表达材料(OE1、OE2、OE3)与野生型(Hwayoung)相比产量提高15％；
图7：开花后0天到15天颖果中OsSWEET11表达量变化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1、试剂和溶液缩写：
本发明中培养基所用到的英文所写缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；Car(Carbenicillin，羧苄青霉素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein EnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；L-pro(L-脯氨酸)；L-Glu(L-谷氨酰胺)；MES(2-(N-Morpholino)EthaneSulfonic Acid)；N6(N6大量元素成份溶液)；B5(B5微量元素成份溶液)；AA(AA大量元素成份溶液)。
2、溶液与培养基配方
1)N6培养基母液每升含量(20倍)：
Figure BDA0003491727550000041
2)B5微量母液每升含量(100倍)：
Figure BDA0003491727550000051
3)有机母液：
Figure BDA0003491727550000052
4)铁盐(100倍)：
Figure BDA0003491727550000053
5)AA大量元素母液(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000054
6)诱导愈伤组织与继代培养基(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000055
7)水稻愈伤组织与农杆菌共培养培养基(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000056
8)抗性愈伤组织选择培养基(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000057
Figure BDA0003491727550000061
9)分化培养基配方(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000062
10)生根培养基配方(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000063
11)感菌液配方(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000064
12)农杆菌生长的YEP液体培养基配方(每升含量)：
Figure BDA0003491727550000065
13)国际水稻所水稻营养液母液配方
Figure BDA0003491727550000066
Figure BDA0003491727550000071
注：
(1)大量元素母液时，每种母液分别配制，分开存放。
(2)配制微量元素母液(Fe除外)时，先加入部分水，随后称取一种盐后，溶解完毕再称取下一种，以防沉淀产生，最后定容至所要体积。
(3)Fe盐的制备：溶解5.57g Na2-EDTA于200mL蒸馏水中，加热Na2-EDTA(70℃水浴)，随后溶解4.45g FeSO4·7H2O于200mL蒸馏水，往Na2-EDTA中缓缓加入FeSO4·7H2O，边加边搅拌，然后于70℃水浴锅或烘箱中避光螯合2h，冷却后定容至1L并储藏于棕色或遮光处理过的试剂瓶中。
(4)配制母液时，由于所用盐类可能与表中不同，故需要通过母液浓度精确计算，避免称错。
(5)上述母液浓度均为水稻正常营养液浓度的1000倍，故需要的母液量为所需营养液体积的1/1000，正常浓度营养液调制好后将pH调节为5.0～5.5。
(6)在有铵存在的营养液母液中需添加硝化抑制剂双氰胺(C2H4N4)防止铵氧化，添加量为1g/L。
实施例1 OsMADS61基因(登录号为AK243669.1)在水稻中表达特征
1)总RNA的提取
水稻Hwayoung种子经体积比30％NaClO消毒，催芽，培养到二叶一心时，挑选出大小一致的水稻植株，去掉胚乳后移栽至pH5.5的1/2国际水稻所营养液中，四叶一心时换为国际水稻所营养液(Mao D R.The methods of plant nutrition research.Beijing：Beijing Agricultural University Press，1994.)，培养一周后，取根及叶片迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右样品，用液氮研碎，研磨充分加入1.5mL离心管，迅速加入1mLTrizol试剂，加入0.2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心后弃上清，加入70％乙醇洗涤沉淀，RNA溶于DEPC水中(体积比为1‰)，用质量比为1.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；其它生育期的水稻均按需要分部位采样并迅速置于液氮中保存，其余步骤与上述一致。
2)总cDNA合成
每个RNA样品2μg，加入50μmol L-1 Oligo dT18，加1‰DEPC水补足10μL，70℃下水浴5min，冰上放置5min后，依次加入RNase inhibitor 0.5μL和5×RT buffer 5μL，10mMdNTP 2.5μL，M-MLV反转录酶1μL，1‰DEPC水补足25μL，42℃水浴60min后，70℃水浴10min终止反应(Oligo dT18由南京金斯瑞公司合成；反转录试剂盒购自Fermentas公司，Canada)。
3)定量PCR
反转录合成总cDNA第一链后，以其为模板进行PCR扩增。反应过程：水稻各组织cDNA扩增反应在96孔PCR板中进行。反应体系为20μl：SYBRmix(2x)，(TaKaRa，大连宝生物)10μl，ROX 0.4μl，正向引物和反向引物各0.4μl，cDNA模板1μl，无菌水7.8μl，总体积20μl。配制混合物充分混匀后分配PCR板中。反应条件如下：95℃5s、94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s，40次循环，72℃延伸5min。
计算方法：采用双ΔΔCt值计算获得结果。基因的序列号和引物设计如下表：
Figure BDA0003491727550000081
*：参考文献，Xiaorong Fan，Lijun Jia，Yilin Li，Susan J.Smith，Anthony JMiller and Qirong Shen，2007 Comparing nitrate storage and remobilization intwo rice cultivars that differ in their nitrogen use efficiency，Journal ofExperimental Botany 58(7)：1729-40
利用特异性引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)研究OsMADS61在水稻开花期的表达，发现OsMADS61主要在根和根茎结合处表达(图1)，同时OsMADS61在茎节、穗及籽粒均有表达。
实施例2：OsMADS61基因的超量表达植株
1)OsMADS61基因的cDNA全长的获得
用以上获得的水稻Hwayoung总cDNA为模板，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsMADS61CDS序列(从起始密码子ATG至TAG)，引物序列为：
OsMADS61-CDS-F：5′-ATGGGGAGGGGCAAGATAGT-3′(SEQ ID NO.5)
OsMADS61—CDS-R：5′-TCATGGATGCAATTGGAGCC-3′；(SEQ ID NO.6)
PCR程序如下：95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火72℃复性延伸1min20s，35个循环后，72℃复性延伸5min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为1281bp片段，将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将回收的片段与P-easy blunt载体连接，酶连体系总体积5μL，包含1μL载体，4μL的PCR纯化产物，加完样后混合均匀，离心甩至管底，28℃放置15min，然后转化；
42℃热击转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，加500-700μL不含抗生素的LB液体培养基摇菌1h，然后低速离心，富集菌体，将其涂在含有卡那霉素100μg mL-1的LB固体培养基上生长12h-14h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsMADS61基因登录号为AK243669.1，OsMADS61的CDS序列全长723bp；将测序正确的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存备用，将含有OsMADS61CDS序列的P载体命名为pOsMADS61inP。
2)超量表达载体pUbi-OsMADS61的构建
根据水稻转录因子基因OsMADS61的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsMADS61CDS序列(从起始密码子ATG至终止密码TAG)，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点KpnI和SpeI，引物序列为：
OsMADS61 OE-F：5′-CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGGGAGGGGCAAGA-3′KpnI(SEQ IDNO.7)
OsMADS61 OE-R：5′-GGTCTTTGTAGTCCATACTAGTTGGATGCAATTGGAGC-3′SpeI(SEQ IDNO.8)
以从上述转入pOsMADS61inP载体的大肠杆菌提取的质粒为模板，PCR程序如下：95℃预变性1min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃复性延伸1min20s，35个循环后，72℃复性延伸5min，扩增的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小约为750bp。将目的PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，回收产物用限制性内切酶KpnI和SpeI进行酶切回收，同时用KpnI和SpeI双酶切植物过量表达载体pTCK303质粒，然后分别回收酶切过的PCR片段和载体，将载体进行去磷酸化后再次回收；回收后通过T4连接酶将线性化的载体与酶切过的PCR片段在16℃下连接过夜，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂在含有卡那霉素100μg mL-1的LB固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落，提取质粒经KpnI和SpeI酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行DNA测序，将含有测序正确克隆的菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，提取阳性克隆质粒命名为pUbi-OsMADS61；
最后通过电击法将pUbi-OsMADS61质粒转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μg mL-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经KpnI和SpeI双酶切验证无误后，菌液加入等体积30％甘油于-70℃保存，转基因备用；
3)转基因植株的获得
为了避免转基因过程产生的植物细胞质基因突变，我们进行了不同批次的转基因实验。将以上获得的转有pUbi-OsMADS61质粒的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养2.5天，经过抗性愈伤组织的选择培养、分化、生根、炼苗得到T0代转基因植株。为了避免植株性状的改变是由于非基因组插入导致的细胞质嵌合体造成的，我们在对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T1代和T2代材料，并对稳定遗传的T2代材料进行生理测定。
实施例3农杆菌介导的水稻转化
诱导愈伤组织：去皮的水稻Hwayoung种子(一盘14粒)入三角瓶，用70％乙醇浸泡1min(淹没种子)，倒掉70％乙醇，用30％次氯酸钠浸泡30min，然后用灭菌水清洗5-6次直至清亮。用镊子把种子拨到灭菌的滤纸上，吸干水分，最后把种子置于诱导培养基上，在30℃光照培养箱培养20-30d。
继代培养：选择小米粒大小的黄色有韧性的脱落下来的愈伤组织，用灭菌的镊子转移到继代培养基生长7-14d。
农杆菌的准备：挑取转有pUbi-OsMADS61质粒的农杆菌EHA105原液20μL，接种于5mL含50mgL-1链霉素和50mgL-1卡那霉素的YEP(Sambrook，etal.分子克隆实验指南.2001)液体培养基中，28℃振荡过夜。取活化菌液500μL，接种于5mL含相同抗生素新鲜的YEP培养基中，继续培养至菌液在600nm波长处的吸光值(OD600)0.8-1.0。
侵染愈伤组织和共培养：将水稻愈伤组织从继代培养基中挑出放入离心管中，愈伤组织的数量量没过50mL离心管锥形部位即可(选择淡黄圆润有韧性的愈伤组织)。取培养好的菌液1mL于1.5mL离心管中，4℃，5000rpm，离心1min，去上清。用含200μmolL-1乙酰丁香酮(As)的30mL感菌液将收集的菌体制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min。倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无菌的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min。将愈伤组织置于共培养培养基上(上面垫上一层9cm无菌滤纸)，25℃暗培养60小时。
洗菌和抗生素筛选培养：将愈伤组织从共培养培养基中取出，用无菌水清5次，每次不停的振荡5min。再用含500mgL-1羧苄青霉素(car)的无菌水浸泡40～60min。最后置于无菌滤纸上沥干2h。第一轮筛选：将晾干的愈伤组织转入含250mgL-1羧苄青霉素(car)和50mgL-1潮霉素(Hyg)的选择培养基上进行第一次选择，30℃，光照培养14d；第二轮筛选：将长有抗性愈伤组织的初始愈伤组织转到含250mg L-1羧苄青霉素(car)和80mg L-1潮霉素(Hyg)的选择培养基上，30℃，光照培养10d然后转移到组培室中培养4d。
抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织移入装有分化培养基的分化灌中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(30d左右，组培室培养条件为24-30℃，14h光/8h暗)，待苗长至5cm左右，放入生根培养基中壮苗。
转基因苗的锻炼和移栽：将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出(苗长至试管顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量无菌水(防止培养基长菌)，炼苗3d至7d左右，然后洗去琼脂，移栽到温室进行水培或土培生长、检测。
潮霉素快速检测转基因幼苗得到T0代植株：剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片(两端均留有切口)，平放于含潮霉素(80mg L-1)培养基上，30℃，16h/8h(光/暗)培养48h叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死(郑晔.水稻高效转基因体系的建立及其应用.2008)。通过潮霉素筛选得到阳性T0植株100个株系，在南京农业大学牌楼温网室进行对超表达材料的种植得到T0代种子。
OsMADS61超表达株系的分子鉴定：T0代种子发芽后得到T1代转基因苗，提取转基因T1代苗不同株系的根部的总RNA，反转录总cDNA，进行定量PCR鉴定(总RNA的提取，总cDNA的合成，定量PCR方法同“OsMADS61基因在水稻中表达特征”)，得到稳定遗传的OE1、OE2、OE3转基因株系，三个株系中OsMADS61表达量相对野生型均提高超100倍(图2)。
超表达株系的扩繁及生理测定：在南京农业大学牌楼温网室进行对超表达材料的扩繁，得到植株性状稳定遗传的T2代材料。表型统计结构表明：转基因材料(OE1、OE2、OE3)千粒重为28.9g，与野生型相比千粒重显著增加(图3)同时粒长显著增加(图4)；转基因材料(OE1、OE2、OE3)结实率显著提高(图5)。本发明公开的OsMADS61超表达材料(OE1、OE2、OE3)与野生型相比产量提高15％(图6)。
实施例4转基因水稻中蔗糖转运蛋白OsSWEET11的表达分析
在OsMADS61超表达植株(OE1、OE2、OE3)和野生型水稻Hwayoung开花时标记每个小穗的开花时间，按开花后0天、5天、10天、15天采集对应时期的小穗，迅速剥出颖果置于液氮中保存。利用Trizol手工法提取颖果中的RNA，随后利用RT-qPCR(Reverse Transcriptionquantitative PCR)测定OsSWEET11的表达量。本发明公开的OsMADS61超表达植株中OsSWEET11显著高于野生型(图7)。而蔗糖转运蛋白OsSWEET11在水稻灌浆中起重要作用，所以OsMADS61参与蔗糖运输，进而促进水稻灌浆、增加水稻千粒重、结实率和最终水稻产量。
OsSWEET11基因的序列号和引物设计如下表：
Figure BDA0003491727550000121
综上所述，本发明人提供的OsMADS61基因是首次在水稻中验证其生物学功能，发现它参与蔗糖转运，影响水稻千粒重和结实率。该基因在水稻中过量表达可以促进水稻灌浆、增加水稻千粒重、结实率和最终水稻产量。可利用本发明OsMADS61基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
本发明中应用的OsMADS61基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，该基因除了可应用于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等，更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 水稻转录因子OsMADS61及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> qOsActin-F(Artificial Sequence)
<400> 1
ttatggttgg gatgggaca 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> qOsActin-R(Artificial Sequence)
<400> 2
agcacggctt gaatagcg 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> qOsMADS61-F(Artificial Sequence)
<400> 3
ccattcctcc tcttcctctc tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> qOsMADS61-R(Artificial Sequence)
<400> 4
aacacaaatg acagagatcg gc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> OsMADS61-CDS-F(Artificial Sequence)
<400> 5
atggggaggg gcaagatagt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> OsMADS61-CDS-R(Artificial Sequence)
<400> 6
tcatggatgc aattggagcc 20
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> OsMADS61 OE-F(Artificial Sequence)
<400> 7
ctctagagga tccccgggta ccatggggag gggcaaga 38
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> OsMADS61 OE-R(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtctttgta gtccatacta gttggatgca attggagc 38
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> qOsSWEET11-F(Artificial Sequence)
<400> 9
gggatttctg gctagtttct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> qOsSWEET11-R(Artificial Sequence)
<400> 10
cgaggtagag gacgatgtag 20

Claims (10)

1.一种超量表达载体pUbi-MADS61的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）水稻种子总RNA的提取；
2）步骤1）的总RNA反转录得到总cDNA；
3）以步骤2）得到的总cDNA为模板，设计PCR引物，扩增得到产物OsMADS61基因的cDNA，然后将扩增产物连接载体导入感受态细胞中，获得的阳性菌提取得到质粒：
4）根据水稻基因OsMADS61的cDNA序列，设计PCR引物，扩增得到的产物与步骤3）得到的质粒连接导入感受态细胞中，获得的阳性菌提取得到质粒即为超量表达载体pUbi-MADS61。
2.根据权利要求1所述的超量表达载体pUbi-MADS61的构建方法，其特征在于，所述步骤3）中的PCR引物序列为：
OsMADS61-CDS-F：ATGGGGAGGGGCAAGATAGT
OsMADS61-CDS-R：TCATGGATGCAATTGGAGCC。
3.根据权利要求1所述的超量表达载体pUbi-MADS61的构建方法，其特征在于，所述步骤4）中的PCR引物序列为：
OsMADS61 OE-F：CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGGGAGGGGCAAGA
OsMADS61 OE-R：GGTCTTTGTAGTCCATACTAGTTGGATGCAATTGGAGC。
4.权利要求1~3任一项所述的构建方法得到的超量表达载体pUbi-OsMADS61。
5.水稻转录因子OsMADS61、权利要求4所述的超量表达载体pUbi-OsMADS61在提高OsSWEET11基因表达量或促进水稻灌浆或增加结实率、千粒重或最终水稻产量中的应用。
6.一种获得具有高产量植物的方法，其特征在于，所述方法包括使植物包含水稻转录因子OsMADS61或权利要求5所述的超量表达载体pUbi-OsMADS61。
7.根据权利要求6所述的获得具有高产量植物的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：将权利要求5所述的超量表达载体pUbi-OsMADS61转化至根癌农杆菌EHA105的感受态细胞，得到阳性菌落，然后将转有pUbi-OsMADS61质粒的农杆菌侵染预先准备好的水稻Hwayoung愈伤组织，然后转入含有抗生素培养基上进行第一轮筛选；2-3周后将仍然正常生长的愈伤组织转移至含有抗生素培养基上进行第二轮筛选；将新长出的阳性愈伤组织转入分化培养基中进行分化，一个月后出苗，将分化出的水稻幼苗转移至生根培养基中，生根培养7-10天，经过炼苗后获得完整的转基因水稻植株T0代；对所有转基因材料都进行了两次扩繁，得到了稳定遗传的T1代和T2代材料。
8.根据权利要求6或7所述的高产量植物的方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、烟草、水稻、玉米或小麦中的一种。
9.鉴定植物的方法，其中植物是包含权利要求6所述的方法获得的植物，其特征在于，所述方法包括测定所述植物是否包含水稻转录因子OsMADS61或权利要求5所述的超量表达载体pUbi-MADS61。
10.根据权利要求9所述的鉴定植物的方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、烟草、水稻、玉米或小麦中的一种。
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