CN115786361B

CN115786361B - 小麦TaCBF14B基因的新用途

Info

Publication number: CN115786361B
Application number: CN202211072778.4A
Authority: CN
Inventors: 郭卫卫; 齐彤; 张玉梅; 贺子涵; 刘文筱; 李夕梅; 王会芳
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-09-02
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2042-09-02
Also published as: CN115786361A

Abstract

本发明公开了小麦TaCBF14B基因的新用途，属于基因工程技术领域。在本发明中，小麦TaCBF14B基因的序列如SEQ ID NO:1所示。在耐旱基因筛选过程中，本发明发现，小麦TaCBF14B基因具有耐旱功能，将该基因导入目的植物中，可以显著提高其抗旱性。因此，本发明在提高植物抗旱性、进而提高植物生物产量方面具有重要意义。

Description

小麦TaCBF14B基因的新用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及小麦TaCBF14B基因的新用途。

背景技术

干旱影响作物的生命活动，直接导致植物体内养分无法正常运输。养分运输问题造成植物体内的营养失衡，进而导致作物植株矮小，生长发育迟缓，影响到粮食的质量和产量，产生粮食安全问题。近年来旱灾对我国作物种植产生了很大的影响，包括山东、河南、安徽、山西在内的粮食主产区经常受到旱灾的影响而造成大面积减产。尤其是河南省，2011年受灾面积高达1600万亩。旱灾面积大、持续时间久、程度重不仅影响了粮食安全，更是加重了政府财政支出。因此，培育耐旱作物、增强植物抗旱性，是缓解植物逆境影响的一个科学、合理并且有效的生物技术措施，能够带来较高的生态和经济效益，有助于农业的持续发展。面对旱灾频发的形势，为克服旱灾带来的影响，在改进栽培措施的同时，筛选耐旱基因，以提高植物抗旱性，显得尤为重要。

发明内容

在耐旱基因筛选过程中，本发明发现，小麦TaCBF14B基因具有耐旱功能；其中，所述小麦TaCBF14B基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

为此，本发明提出了如下技术方案：

小麦TaCBF14B基因在提高植物耐旱性能中的应用。

在上述应用中，可将小麦TaCBF14B基因制备成重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒，以应用于提高植物耐旱性能。

一种提高植物耐旱性能的方法，是将上述小麦TaCBF14B基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化菌株，获得携带有小麦TaCBF14B基因的重组菌株，然后将重组菌株侵染植物叶片，使植物携带有小麦TaCBF14B基因，并最终通过小麦TaCBF14B基因的表达，调控植物的耐旱性。

上述重组表达载体，除了包含有小麦TaCBF14B基因外，还包含有如下克隆载体，但不局限于如下载体：双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体；例如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等；

上述重组表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能；

使用上述小麦TaCBF14B基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、组成型启动子；或组织特异表达启动子，如种子特异表达的启动子；它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；

此外，使用上述小麦TaCBF14B基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；

上述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

上述用于侵染植物的菌株可选自根癌农杆菌GV3101、LBA4404以及EHA105等。

本发明用以提高耐旱性能的植物，可为单子叶植物或双子叶植物。在一个具体的实施方案中，所述植物为模式植物拟南芥。

本发明的有益效果为：

在耐旱基因筛选过程中，本发明发现，小麦TaCBF14B基因具有耐旱功能；将该基因导入目的植物中，可以显著提高其抗旱性。因此，本发明在提高植物抗旱性、进而提高植物生物产量方面具有重要意义。

附图说明

图1为pCE2 TA/Blunt-Zero载体中插入TaCBF14B基因的测序对比图；

图2为目的载体super1300(GFP-C)的结构示意图；

图3为super1300(GFP-C)载体中插入TaCBF14B基因的测序对比图；

图4为TaCBF14B超表达转基因株系图；

图5为TaCBF14B超表达转基因拟南芥株系的PCR鉴定电泳图；

图6为TaCBF14B超表达转基因株系萌发期脱落酸处理图；其中，A图为不同浓度脱落酸处理后各株系生长情况，脱落酸浓度从左到右依次为0μM、0.5μM、1μM；B图为不同浓度脱落酸处理后各株系萌发率，各处理组从左到右以此为WT、OE1、OE2、OE3；

图7为TaCBF14B超表达转基因株系苗期甘露醇处理图；其中，A图为正常条件下各株系根系生长情况及根长统计图；B图为200mM甘露醇处理下各株系根系生长情况及根长统计图；C图为250mM甘露醇处理下各株系根系生长情况及根长统计图；

图8为TaCBF14B超表达转基因株系成株期干旱胁迫处理图；其中，A图为12天干旱胁迫处理后各植株的生长情况；B图为23天干旱胁迫处理后复水存活情况及存活率统计图，左边为复水存活情况，右边为存活率统计；C图为处理后12天相对电导率统计图，左边为正常条件，右边为干旱胁迫；D图为处理后12天叶绿素含量统计图，左边为正常条件，右边为干旱胁迫；E图为处理后12天株高统计图，左边为正常条件，右边为干旱胁迫；F图为处理后23天地上部鲜重统计图，左边为正常条件，右边为干旱胁迫；G图为处理后23天地上部干重统计图，左边为正常条件，右边为干旱胁迫；

图9为TaCBF14B超表达转基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株中TaCBF14B基因的相对表达量结果。

具体实施方式

小麦是重要粮食作物，种植范围广，同时也是对外界恶劣环境适应能力极强的作物。本发明尝试从小麦中筛选耐旱基因。在筛选过程中，我们发现，小麦TaCBF14B基因具有耐旱功能。这是一个新的发现，因为，在前期研究中，小麦TaCBF14B基因只是被证明参与温度胁迫的响应(Soltész et al；2013)，但其是否参与到干旱胁迫调控过程中还尚未见报道。下面将提供小麦TaCBF14B基因对干旱胁迫响应的鉴定和验证过程。

本发明所用到的试剂、材料以及仪器，如下所示：

Trizol、HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)、CloneExpressⅡOne step Cloning Kit试剂盒(含CE DesignV1.04、5×CEⅡBuffer、ExnaseⅡ)、大肠杆菌Fast-T1感受态细胞以及5min^TMTA/Blunt-ZeroCloning Kit(含pCE2 TA/Blunt-Zero)由南京诺唯赞生物科技有限公司(Vayme)提供。野生型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥的野生型)、中国春(CS)小麦、super1300(GFP-C)、硫酸卡那霉素、利福平以及潮霉素由本发明所在实验室提供。根癌农杆菌GV3101感受态细胞由上海唯地生物技术有限公司提供。QuickCut^TM XbaI(含10X QuickCut Green Buffer)以及QuickCut^TM SmaI(含10X QuickCut Green Buffer)由宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara)提供。

小麦TaCBF14B的基因序列：

5'-ATGGACGCCGCCGACGCCGCCTCCCCGTGTGATGGCCACAGGACGGTGTGGTCGGAGCCGCCGAAGCGGCCGGCCGGCCGGACCAAGTTCAAGGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGCGGCGTGCGGCGACGGGGCCCCGCCGGCCGGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCTCGGGATGAGGGGCTCCAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCACCACCGCTGAGATGGCAGCGCGCGCGCACGACGCCGCCGTTCTCGCGCTCTCTGGGCGCGCCGCTTGTCTCAACTTCGCCGACTCCGCCTGGCGGATGCTCCCCGTCCTCGCCGGCCCGTTCAGCACCGCCAAGGAGATCAAGGACGCCGTCGCCGTCGCCGTCCTGGCGTTCCAAAGGCAGCACCGGGTCGCGTCCATGGCACCATTGTCCCCTGCGCGGACAACCGATGACGAGAAGGAAATCGATGGCTCGCCGGCGCCGAGCGCCCTGTTCATGTCCAGCGAGCTGTTGAATGAGCACTGGTTTGGCGGCATGGATGCCGGATCGTTCTACTCGGAGGGCCTGTTCATGGAGTCGCCGGACACCAGACCGTGGCGGGAAGACCTCGAGCTCTGTGGCGTCGAGACACCGCCATGGAGCTACTTGTTCGACTAA-3'(SEQ ID NO:1)

本发明所采用的其它试剂、材料以及仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

小麦TaCBF14B重组表达载体的构建，如下所示：

1、小麦TaCBF14B基因的克隆

取水培7天的中国春(CS)小麦，利用Trizol法提取叶片中的总RNA，纯化后用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录酶进行反转录得到cDNA。以该cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(25ul)：ddH₂O 8uL，2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5uL，上下游引物各1uL，cDNA模板2.5uL；PCR反应条件：95℃，3min；35个循环：95℃，15s，59℃，15s，72℃，30S；72℃延伸5min，最后4℃保存。

上下游引物如下所示：

引物L：5'-ATGGACGCCGCCGACGCC-3'(SEQ ID NO:2)；

引物R：5'-CTAATTGCCACGGGCTTCCT-3'(SEQ ID NO:3)。

将获得的PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，回收序列长度在645bp左右的片段，然后通过5min^TMTA/Blunt-Zero Cloning Kit连接到pCE2 TA/Blunt-Zero上，并转化大肠杆菌Fast-T1感受态细胞，进行测序。测序结果如图1所示，pCE2 TA/Blunt-Zero载体中插入了序列长度为645bp的DNA片段，该片段为小麦TaCBF14B基因的全长cDNA序列。

2、重组表达载体的构建

(1)目的基因的扩增

利用CE Design V1.04设计，将上述引物L和引物R的5'端分别加入XbaI和SmaI两个酶切位点，获得引物L1和引物R1。以上述步骤获得的含有pCE2 TA/Blunt-Zero重组载体的阳性大肠杆菌菌液为模板，进行PCR扩增。PCR选用诺唯赞2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，扩增体积为25uL，反应程序：95℃，3min；35个循环：95℃，15s，59℃，15s，72℃，30S；72℃延伸5min，最后4℃保存。回收序列长度在645bp左右的PCR产物，用于后续反应。

引物L1和引物R1如下所示：

引物L1：5'-CCAAATCGACTCTAGTCTAGAATGGACGCCGCCGACGCC-3'(SEQ ID NO:4)；

引物R1：5'-TATTTAAATGTCGACCCCGGGTTAGTCGAACAAGTAGCTCCATGG-3'(SEQ ID NO:5)。

(2)载体线性化

采用QuickCut^TM XbaI和QuickCut^TM SmaI两个限制性内切酶对super1300(GFP-C)进行线性化酶切，如图2所示。酶切体系：质粒1ug，10×QuickCut Green Buffer 2uL，QuickCut^TMXbaI1uL，QuickCut^TMSmaI 1uL，ddH₂O补充至20uL。反应条件：37℃温浴3h。

(3)目的基因与克隆载体连接

利用CloneExpressⅡOne step Cloning Kit试剂盒(Vayme)将目的DNA片段连入克隆载体，连接体系如下：线性化super1300(GFP-C)载体3uL，目的片段1uL，5×CEⅡBuffer2uL，ExnaseⅡ1uL，ddH₂O 3uL。用移液枪轻轻吹打混匀，短暂离心收集液体于管底，37℃反应30min。

(4)目的基因克隆的筛选及鉴定

1)取上述重组反应产物10uL转化大肠杆菌Fast-T1的感受态细胞，37℃倒置培养12-16h(培养基附加50ug/mL硫酸卡那霉素)；

2)挑取步骤1)获得的单克隆，37℃、180-200rpm摇菌培养(附加50ug/mL硫酸卡那霉素)；

3)吸取步骤2)菌液中的菌体1uL，利用引物L和R进行PCR检测；

4)将步骤3)PCR鉴定为阳性的菌液送生工生物(上海)股份有限公司进行测序，测序结果表明(图3)，获得含有所述目的基因的重组载体，即super1300(GFP-C)-TaCBF14B；所述重组载体super1300(GFP-C)-TaCBF14B为载体super1300(GFP-C)的XbaI和SmaI之间的片段被如下序列的DNA片段替换：XbaI重组位点序列TCTAGA、TaCBF14B和SmaI重组位点序列CCCGGG。将测序正确菌液提取质粒，保存于-20℃，用于后续农杆菌转化实验。

实施例2

小麦TaCBF14B基因转化拟南芥，步骤如下：

1、重组农杆菌的构建

将实施例1制备的重组表达载体super1300(GFP-C)-TaCBF14B转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，28℃于含50ug/mL硫酸卡那霉素和20ug/mL利福平的LB固体培养基中筛选培养；挑取阳性单克隆于28℃、180-200rpm摇菌培养(附加50ug/mL硫酸卡那霉素和20ug/mL利福平)；吸取菌液中的菌体1uL，采用引物L和R进行PCR检测；经PCR鉴定呈阳性的菌液，即为含有重组表达载体super1300(GFP-C)-TaCBF14B的重组根癌农杆菌，并将其命名为GV3101/super1300(GFP-C)-TaCBF14B。

2、转基因拟南芥的获得

(1)将哥伦比亚生态型拟南芥的野生型种子在4℃条件下春化72h，播种于MS培养基中，于22℃、15h光照/9h黑暗、湿度60％-70％的培养室中培养，生长到两片真叶时移栽到营养土与蛭石比例3:1混合的种植钵中。待植株开花后，剪去主枝顶端，促进侧枝发展。侵染前一天浇足量的水，一般选在上午九点左右进行转化，此时开花最为旺盛，利于侵染。

(2)活化农杆菌：将经测序确定的农杆菌菌液在超净工作台倒入提前灭菌的250mL锥形瓶，加入150mL含有50ug/mL硫酸卡那霉素和20ug/mL利福平的LB液体培养基，在28℃全温振荡器摇菌16-20h，至OD₆₀₀在0.8-1.0。分别用三支50mL离心管分装菌液，离心机5500g离心20min，倒掉上清液。

(3)配置重悬液：2.5g蔗糖溶于50mL蒸馏水，再加入10uL silmet-77。

(4)在活化的农杆菌菌液中加入重悬液，每次加10mL，边加边测OD₆₀₀直至达到0.6-0.8。

(5)蘸花法侵染拟南芥，用移液器枪头取上述混匀的重悬菌液滴在拟南芥花序，侵染后暗处理1d，光照时再浇水。

(6)一周后二次侵染。恢复光照和温度按正常方法培养植株至结实，收获成熟的T₀代种子。

(7)待获得侵染的拟南芥植株的种子后，清洗消毒并均匀撒在含有60uL/100mL潮霉素的MS培养基上，培养14d左右至有拟南芥幼苗长出真叶，且部分幼苗的真叶长势健康、根扎入培养基明显较长，则其为阳性苗，将阳性苗移到钵中进行培养。

拟南芥种子具体清洗方法及培养方式如下：

a.种子消毒：将拟南芥种子置于2mL离心管中，配制浓度为10％的次氯酸钠消毒液(用蒸馏水经高温高压灭菌后稀释次氯酸钠溶液)，取1mL左右加入离心管手摇2-3min，对拟南芥种子进行消毒；离心后倒掉上清的消毒液，用同上的灭菌水稀释乙醇至浓度为75％，加入离心管清洗2-3次；离心后再用灭菌水清洗2-3次。以上操作全程在超净工作台完成。

b.种子培养：将清洗后的转基因拟南芥种子避光置于4℃冰箱冷藏72h，用修剪过的大号移液枪头点播至含有潮霉素的MS培养基中，平放生长。将在培养基中正常生根(培养约一周)的幼苗移栽至营养土中培养。

按照同样的方法种植筛选T1代种子，移栽含有潮霉素抗性的T1代株系并单株收获T1代株系内各单株上所结T2代种子，随机取10个T2代株系种子按照同样的方法进行潮霉素抗性筛选，得到3个超表达转基因株系(OE1、OE2、OE3)如图4所示，T2代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转基因株系。单株收获T2代为纯合转基因株系的T3代种子，进行下述步骤4的表型鉴定和分析。

T0代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株；株系表示由上一代的同一植株自交所产生的种子或植株群体。

3、转基因拟南芥植株的PCR鉴定

取步骤2得到的3个超表达转基因株系植株叶片，利用Trizol法提取叶片中总RNA，纯化后用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录酶进行反转录得到cDNA。采用引物L和R进行PCR扩增，结果全部呈阳性。其中，部分植株的PCR产物电泳图如图5所示。

4、转基因拟南芥植株的表型鉴定

(1)TaCBF14B超表达转基因株系萌发期的表型鉴定

ABA胁迫处理：

制作含有ABA(0μM、0.5μM、1μM)的MS培养基(41.4g/L)，将清洗好的拟南芥野生型(WT)及三个转基因拟南芥种子点在板上培养7-10天观察发芽率。

ABA胁迫处理培养基：

将表1的材料加入锥形瓶充分搅拌混匀；用pH计调节混合溶液pH值范围至5.8-6.0；用封口膜密封，121℃、15min高温灭菌；将培养皿、封口膜等所需材料提前杀菌消毒再放入超净工作台；待培养基冷却至40-50℃时加入ABA(分别为0uM、0.5uM、1uM三种类型)，混匀后倒板；凝固后将培养基放至于4℃冰箱保存。

表1

组分	加入量
		MS固体干粉	41.4g
蒸馏水	1L

方板干旱胁迫处理：

将拟南芥野生型(WT)和三个转基因株系在圆形培养皿正常生长下培养5天移至方型培养皿中垂直培养，用浓度为0mM、200mM和250mM的甘露醇胁迫处理苗期的拟南芥10天左右并用尺子测量根长。

将获得的TaCBF14B转基因纯系种子(OE1、OE2、OE3)平铺在分别含有0.5μM以及1μM的ABA的MS培养基上进行处理并设置对照(CK)，通过观察幼苗的生长情况以及进行统计分析，发现在ABA胁迫下拟南芥超表达株系的发芽率比野生型明显降低，说明转基因株系种子萌发时对ABA具有更高的敏感性(图6)。

(2)TaCBF14B超表达转基因株系苗期的表型鉴定

方板干旱胁迫处理培养基：

将表2的材料加入锥形瓶充分搅拌混匀；用pH计调节混合溶液pH值范围至5.8-6.0；用封口膜密封，121℃、15min高温灭菌；将培养皿、封口膜等所需材料提前杀菌消毒再放入超净工作台；待培养基冷却至40-50℃时倒入方板；凝固后将培养基放至于4℃冰箱保存。

表2

组分	加入量
		MS固体干粉	41.4g
蒸馏水	1L
		甘露醇	(分别为0mM、200mM和250mM三种)

土培干旱胁迫处理：

将拟南芥野生型(WT)和三个转基因株系在圆形培养皿正常生长下培养5天后转移至混有营养土和蛭石(质量比3:1)的塑料钵中培养，在温室正常条件下培养15天左右，做正常、干旱(不浇水)处理，并在12后观察其植株的生长情况，并在处理23天后复水，观察将拟南芥野生型(WT)和三个转基因株系的存活率情况。

一定浓度的甘露醇能够使外界渗透压升高，导致细胞脱水，植物因此无法正常吸收水分，可以用来模拟干旱状态。将超表达TaCBF14B拟南芥转基因株系在正常条件下培养5天后转移至方板进行垂直培养，用200mM和250mM两种浓度的甘露醇对苗期拟南芥进行胁迫处理，模拟干旱环境，设置对照组，培养10天后对其根长进行统计分析。

通过对实验结果的观察可见，苗期在甘露醇胁迫下，OE1、OE2、OE3株系中植株根长均较野生型更长，表现出对干旱胁迫更高的耐受性，并且随浓度升高差异更加显著(图7)。

(3)TaCBF14B超表达转基因株系成株期的表型鉴定

在混有营养土和蛭石(质量比3:1)的塑料钵中正常条件下连续培养到15天左右时，对其进行干旱(不浇水)处理，处理后12天的生长状况如图8A所示。

对处理后12天的电导率、叶绿素含量、株高以及处理后23天的干重、鲜重进行测定与比较，并在干旱23天后对干旱处理的植株进行复水，观察其存活率。结果如图8E、F和G所示，野生型在干旱条件下干重、鲜重、株高均较正常条件下差异明显，转基因株系在干旱条件下的干重、鲜重、株高均较正常条件下差异不大；说明转基因株系对干旱条件具有较高的耐受性。

对干旱胁迫后的转基因株系进行复水处理，结果发现野生型存活率为0，而转基因株系OE1存活率为73％，OE2存活率为27％，OE3存活率为45％，转基因株系存活率显著高于野生型；说明转基因株系比野生型表现出更强的干旱耐受性(图8B)。

进一步分析发现，干旱胁迫与正常条件培养的植株相比电导率均有所增加，野生型在干旱胁迫下的电导率与正常条件下相比差异较大，但转基因株系在干旱胁迫前后差异较小；说明野生型在干旱胁迫下，细胞受到了破坏，细胞内电解质外渗，生命活动受到影响。转基因株系在干旱胁迫下细胞受到的伤害较小，细胞内的电解质外渗少，因此具有较强的耐旱性(图8C)。

通过分析处理12天后植株叶绿素含量可知，正常条件培养的植株与干旱胁迫处理的植株相比，干旱条件下野生型叶绿素含量下降幅度较大，而转基因株系叶绿素含量下降幅度不明显；说明转基因株系抗旱性较强(图8D)。

(4)T3代转基因拟南芥的实时荧光定量PCR检测

将步骤(1)中的T3代纯合转基因株系(OE1、OE2、OE3)植株根系和哥伦比亚生态型拟南芥的野生型(WT)根系拍照后，分别用Trizol法提取总RNA，纯化后用HiScriptⅢRTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录酶进行反转录得到cDNA。以TaActin为内参基因，利用qRT-PCR引物对TaCBF14B基因表达量进行实时定量PCR检测。

实时荧光定量PCR仪型号ABI QuantStudio3，使用ChamQTMSYBR Color qPCRMaster Mix试剂，小麦TaActin基因的表达水平作为内参，结果分析采用比较阈值法对实时定量PCR结果进行定量分析，设置荧光域值，确定在该荧光域值下的循环数Ct值。根据Ct值，计算C值。C＝2-^a，△Ct＝Ct目的基因-C内参基因，计算三个重复的C值的平均值作为目的基因的相对表达量。

反应体系如表3所示：

表3

组分	使用量
		2x ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	5uL
50x ROX Reference DyeⅡ	0.2uL
		Forward Primer(10uM)	0.2uL
Reverse Primer(10uM)	0.2uL
		稀释3倍后的第一链cDNA溶液	0.5uL
ddH₂0	3.9uL

qRT-PCR扩增程序采用三步法：

预变性：95℃反应3min；循环反应：95℃反应15s，59℃反应20s，共40个循环；溶解曲线：95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s。

此步骤中用于实时定量PCR的引物序列如下：

TaActin-L：5'-TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'(SEQ ID NO:6)

TaActin-R：5'-GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'(SEQ ID NO:7)

TaCBF14B qRT-L：5'-ATGGATGATGAGGCGCAGGA-3'(SEQ ID NO:8)

TaCBF14B qRT-R：5'-GGAGCCCCTCATCCCGAGCACGCG-3'(SEQ ID NO:9)

结果如图9所示，转基因拟南芥植株中外源基因TaCBF14B的表达量明显高于野生型植株，该结果与上述超表达转基因拟南芥的表型对比结果相一致。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.小麦TaCBF14B基因在提高拟南芥耐旱性能中的应用，其中，所述小麦TaCBF14B基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述小麦TaCBF14B基因的应用方式为过表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，可将小麦TaCBF14B基因制备成重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒，以应用于提高拟南芥耐旱性能。

3.一种提高拟南芥耐旱性能的方法，其特征在于，是将权利要求1中的小麦TaCBF14B基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化菌株，获得携带有小麦TaCBF14B基因的重组菌株，然后将重组菌株侵染拟南芥叶片，使植物携带有小麦TaCBF14B基因，并最终通过小麦TaCBF14B基因的表达，调控拟南芥的耐旱性。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌株选自根癌农杆菌GV3101、LBA4404以及EHA105中的一种。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体包含有如下克隆载体：双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体。