CN116410985A - 小麦TaNF-YB3D基因、其可变剪接形式及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了小麦TaNF‑YB3D基因、其可变剪接形式及应用，属于基因工程技术领域。本发明发掘了一种小麦TaNF‑YB3D基因的可变剪接形式，命名为小麦TaNF‑YB3D‑S基因。小麦TaNF‑YB3D‑S基因可用于调控盐胁迫下目的植物的耐受性，使植物形态表现为在盐胁迫下耐受性增强，并具体表现为萌发期种子存活率增加、苗期根长增加、侧根数目增加以及植株明显增高等。这表明，小麦TaNF‑YB3D‑S基因具有耐盐功能。因此，其可在植物受盐胁迫条件下的耐受性、根长以及株型改造等基因工程中得到应用，从而在提高植物生物产量方面具有重要意义。

Description

小麦TaNF-YB3D基因、其可变剪接形式及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及小麦TaNF-YB3D基因、其可变剪接形式及应用。
背景技术
土壤中盐碱含量过高会对植物造成危害。在轻度盐胁迫时，由于根系周围的盐离子浓度高，使得根外的水势下降，为根系吸水造成一定的障碍，进而降低营养物质的吸收和运输。例如，盐胁迫下过量的Na+会导致生物膜上Ca2+被Na+取代，从而破坏了生物膜的结构和功能；K+和Ca2+的吸收和运输因环境中Na+浓度过高而受到抑制，从而使植物表现为形态上的缺素症状。养分运输问题造成植物体内的营养失衡，进而导致作物植株矮小，生长发育迟缓，影响到粮食的质量和产量。因此，培育耐盐作物、增强植物耐盐性，是缓解植物逆境影响的一个科学、合理并且有效的生物技术措施，能够带来较高的生态和经济效益，有助于农业的持续发展。在这一过程中，筛选耐盐基因，以提高植物耐盐性，显得尤为重要。
发明内容
在小麦TaNF-YB3D基因的克隆研究中，我们发掘了一种小麦TaNF-YB3D基因的可变剪接形式，命名为小麦TaNF-YB3D-S基因。在耐盐筛选过程中，我们发现，小麦TaNF-YB3D-S基因可用于调控盐胁迫下目的植物的耐受性，使植物形态表现为在盐胁迫下耐受性增强，并具体表现为萌发期种子存活率增加、苗期根长增加、侧根数目增加以及植株明显增高等。这表明，小麦TaNF-YB3D-S基因具有耐盐功能。因此，其可在植物受盐胁迫条件下的耐受性、根长以及株型改造等基因工程中得到应用。其中，小麦TaNF-YB3D基因的序列如SEQ ID NO:1所示，小麦TaNF-YB3D-S基因的序列如SEQ ID NO:4所示。
为此，本发明提出了如下技术方案：
本发明提供了上述小麦TaNF-YB3D-S基因。
本发明还提供了含有上述小麦TaNF-YB3D-S基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
本发明还提供了上述小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因在提高植物耐盐性能中的应用。
本发明提供了一种提高植物耐盐性能的方法，是将上述小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化菌株，获得携带有小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因的重组菌株，然后将重组菌株侵染植物叶片，使植物携带有小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因，并最终通过小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因的表达，调控植物的耐盐性。通过该方法可最终获得盐胁迫下耐受程度大于目的植物野生型的转基因植物。
上述重组表达载体，除了包含有小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因外，还包含有如下克隆载体，但不局限于如下载体：双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体；例如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等；
上述重组表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能；
使用上述小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、组成型启动子；或组织特异表达启动子，如种子特异表达的启动子；或诱导型启动子；它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；
此外，使用上述小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；
上述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等选择性标记基因)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。如果从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
携带有本发明小麦TaNF-YB3D基因或TaNF-YB3D-S基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是小麦、玉米、水稻等单子叶植物，也可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、杨树、苜蓿等双子叶植物。
上述用于侵染植物的菌株可选自根癌农杆菌(例如GV3101、LBA4404以及EHA105)、发根农杆菌等。
本发明的有益效果为：
在小麦TaNF-YB3D基因的克隆研究中，本发明发掘了一种小麦TaNF-YB3D基因的可变剪接形式，命名为小麦TaNF-YB3D-S基因。在耐盐筛选过程中发现，小麦TaNF-YB3D-S基因可用于调控盐胁迫下目的植物的耐受性，使植物形态表现为在盐胁迫下耐受性增强，并具体表现为萌发期种子存活率增加、苗期根长增加、侧根数目增加以及植株明显增高等。这表明，小麦TaNF-YB3D-S基因具有耐盐功能。因此，其可在植物受盐胁迫条件下的耐受性、根长以及株型改造等基因工程中得到应用，进而在提高植物生物产量方面具有重要意义。
附图说明
图1为参考基因组序列TaNF-YB3D与克隆基因序列TaNF-YB3D-S的测序对比图；
图2为NCBI-Blast预测分析TaNF-YB3D的保守结构域位置图；
图3为参考基因组序列TaNF-YB3D与克隆基因序列TaNF-YB3D-S的氨基酸序列对比图；
图4为pCE2 TA/Blunt-Zero载体中插入TaNF-YB3D-S基因的测序对比图；
图5为目的载体super1300(GFP-C)的结构示意图；
图6为super1300(GFP-C)载体中插入TaNF-YB3D-S基因的测序对比图；
图7为TaNF-YB3D-S超表达转基因株系图；
图8为TaNF-YB3D-S超表达转基因拟南芥株系的PCR鉴定电泳图；
图9为TaNF-YB3D-S超表达转基因株系萌发期脱落酸处理图；其中，A图为不同浓度脱落酸处理后各株系生长情况，脱落酸浓度从左到右依次为0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L；B图为不同浓度脱落酸处理后各株系萌发率，各处理组从左到右依次为WT、OE1、OE2、OE3；
图10为TaNF-YB3D-S超表达转基因株系苗期盐胁迫处理图；其中，A图为正常条件下各株系根系生长情况及根长统计图；B图为75mmol/L氯化钠处理下各株系根系生长情况及根长统计图；C图为100mmol/L氯化钠处理下各株系根系生长情况及根长统计图；D图为125mmol/L氯化钠处理下各株系根系生长情况及根长统计图；
图11为TaNF-YB3D-S超表达转基因株系成株期盐胁迫处理图；其中，A图为5天盐胁迫处理后各植株的生长情况；B图为8天盐胁迫处理后各植株的生长情况；C图为12天盐胁迫处理后各植株的生长情况；
图12为TaNF-YB3D-S超表达转基因株系成株期盐胁迫结果分析；其中，A图、B图分别为正常处理和盐处理后12天的相对电导率统计图，C图、D图分别为正常处理后23天的地上部干重和鲜重统计图，E图、F图分别为盐处理后23天的地上部干重和鲜重统计图表，G图、H图分别为正常处理和盐处理下不同时间点的叶绿素含量统计图，I图为处理后5、8、12天的株高统计图；
图13为超表达转基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株中TaNF-YB3D-S基因的相对表达量结果。
具体实施方式
本发明所用到的试剂、材料以及仪器，如下所示：
Trizol、HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)、CloneExpressⅡOne step Cloning Kit试剂盒(含CE DesignV1.04、5×CEⅡBuffer、ExnaseⅡ)、大肠杆菌Fast-T1感受态细胞以及5minTMTA/Blunt-ZeroCloning Kit(含pCE2 TA/Blunt-Zero)由南京诺唯赞生物科技有限公司(Vayme)提供。野生型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥的野生型)、中国春(CS)小麦、super1300(GFP-C)、硫酸卡那霉素、利福平以及潮霉素由本发明所在实验室提供。根癌农杆菌GV3101感受态细胞由上海唯地生物技术有限公司提供。QuickCutTM XbaI(含10X QuickCut Green Buffer)以及QuickCutTM SmaI(含10X QuickCut Green Buffer)由宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara)提供。
小麦是重要粮食作物，种植范围广，同时也是对外界恶劣环境适应能力极强的作物。本发明尝试从小麦中筛选耐盐基因。
诸多资料表明，植物NF-Y家族在干旱等胁迫响应中起到重要的作用，例如，拟南芥AtNF-YB1及其同源基因玉米ZmNF-YB2超表达增加了植物的抗旱性(Nelson et al.,2007)；最近的一组研究报道表明，在拟南芥中，NF-YA5超表达及缺失功能的突变体响应干旱胁迫(Li et al.,2008)，超表达植株的抗旱性降低，导致花青素减少，气孔导度变小；但这种详细的调控机制并不十分清楚。另有研究发现，NF-Y还参与调控光周期调节的开花途径，例如，有研究表明，拟南芥AtNF-YB2(HAP3b)可以激活FT，促进植物早花(Cai et al.,2007；Chen et al.,2007)；Kumimoto等(2008)的研究揭示了在拟南芥中长日照条件下NF-YB2和NF-YB3参与光周期诱导开花中的新功能。虽然NF-Y家族基因参与调节植物的许多生长发育过程，例如胚胎形成，节间发育，开花时间和逆境胁迫响应等，但是仍有许多基因尚未被研究，且对应的功能也没有被揭示出来。
本发明在对小麦TaNF-YB3D基因进行克隆研究中，发现了一种可变剪接形式，命名为TaNF-YB3D-S基因，该基因最终被本发明证明具有耐盐功能。
小麦TaNF-YB3D参考基因组序列(由NCBI网站查得基因序列，1016bp)，如下：
Figure SMS_1
下面将提供小麦TaNF-YB3D-S基因对盐胁迫响应的鉴定和验证过程。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。本发明所采用的其它试剂、材料以及仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
实施例1
小麦TaNF-YB3D基因可变剪接形式的发掘，步骤如下：
根据小麦TaNF-YB3D基因设计上下游引物，如下所示：
引物L：5'-ATGCCGGACTCGGACAA-3'(SEQ ID NO:2)；
引物R：5'-TCACCCCTCTTTCCGTCCG-3'(SEQ ID NO:3)。
取水培48h的经250mmol/L NaCl处理的两叶一心时期的中国春小麦叶片，利用Trizol法提取叶片中的总RNA，纯化后用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录酶进行反转录得到cDNA。以该cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系(25μL)：ddH2O8μL，2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)12.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板2.5μL；PCR反应条件：95℃，3min；35个循环：95℃，15s，59℃，15s，72℃，30s；72℃延伸5min，最后4℃保存。
PCR扩增产物回收后测序得到的序列如下：
Figure SMS_2
通过DNAMAN比对得知，该克隆序列与参考基因组序列不同，其可能为TaNF-YB3D基因的一种新的可变剪接形式(图1)，我们把它命名为TaNF-YB3D-S基因，为了进一步确定其功能，我们通过NCBI-Blast预测分析TaNF-YB3D的保守结构域(图2)，发现在75～270bp左右为TaNF-YB3D的保守结构域，我们截取了原序列和克隆序列在60～300bp左右的片段进行了比对，结果发现，克隆序列除有三个snp位点外，其余完全一致；我们又将原序列和克隆序列的氨基酸序列进行了比对，结果发现二者完全相同(图3)，因此我们确认，新克隆的TaNF-YB3D-S基因属于NF-Y家族，且为一种新的可变剪接形式。
将获得的PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，回收序列长度在600bp左右的片段，然后通过5minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit连接到pCE2 TA/Blunt-Zero上，并转化大肠杆菌Fast-T1感受态细胞，进行测序。测序结果如图4所示，pCE2 TA/Blunt-Zero载体中插入了序列长度为600bp的DNA片段，该片段为小麦TaNF-YB3D-S基因的全长cDNA序列。
实施例2
小麦TaNF-YB3D-S重组表达载体的构建，步骤如下：
(1)目的基因的扩增
利用CE Design V1.04设计，将上述引物L和引物R的5'端分别加入SmaI和SacI两个酶切位点，获得引物L1和引物R1。以上述步骤获得的含有pCE2 TA/Blunt-Zero重组载体的阳性大肠杆菌菌液为模板，进行PCR扩增。PCR选用诺唯赞2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，扩增体积为25μL，反应程序：95℃，3min；35个循环：95℃，15s，59℃，15s，72℃，30s；72℃延伸5min，最后4℃保存。回收序列长度在1539bp左右的PCR产物，用于后续反应。
引物L1和引物R1如下所示：
引物L1：5'-ctctagagtctagagcccgggATGCCGGACTCGGACAACG-3'(SEQ ID NO:5)；
引物R1：5'-cgatcggggaaattcgagctcTCACCCCTCTTTCCGTCCG-3'(SEQ ID NO:6)。
(2)载体线性化
采用QuickCutTMSmaI和QuickCutTMSacI两个限制性内切酶对super1300(GFP-C)进行线性化酶切，如图5所示。酶切体系：质粒1μg，10×QuickCut Green Buffer 2μL，QuickCutTMSmaI1μL，QuickCutTMSacI 1μL，ddH2O补充至20μL。反应条件：37℃温浴3h。
(3)目的基因与克隆载体连接
利用CloneExpressⅡOne step Cloning Kit试剂盒(Vayme)将目的DNA片段连入克隆载体，连接体系如下：线性化super1300(GFP-C)载体3μL，目的片段1μL，5×CEⅡBuffer2μL，ExnaseⅡ1μL，ddH2O 3μL。用移液枪轻轻吹打混匀，短暂离心收集液体于管底，37℃反应30min。
(4)目的基因克隆的筛选及鉴定
1)取上述重组反应产物10μL转化大肠杆菌Fast-T1的感受态细胞，37℃倒置培养12～16h(培养基附加50μg/mL硫酸卡那霉素)；
2)挑取步骤1)获得的单克隆，37℃、180～200rpm摇菌培养(附加50μg/mL硫酸卡那霉素)；
3)吸取步骤2)菌液中的菌体1μL，利用引物L和R进行PCR检测；
4)将步骤3)PCR鉴定为阳性的菌液送生工生物(上海)股份有限公司进行测序，测序结果表明(图6)，获得含有所述目的基因的重组载体，即super1300(GFP-C)-TaNF-YB3D-S；所述重组载体super1300(GFP-C)-TaNF-YB3D-S为载体super1300(GFP-C)的SmaI和SacI之间的片段被如下序列的DNA片段替换：SmaI重组位点序列CCCGGG、TaNF-YB3D和SacI重组位点序列TCTAGA。将测序正确菌液提取质粒，保存于-20℃，用于后续农杆菌转化实验。
实施例3
小麦TaNF-YB3D-S基因转化拟南芥，步骤如下：
1、重组农杆菌的构建
将实施例2制备的重组表达载体super1300(GFP-C)-TaNF-YB3D-S转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，28℃于含有50μg/mL硫酸卡那霉素和20μg/mL利福平的LB固体培养基中筛选培养；挑取阳性单克隆于28℃、180～200rpm摇菌培养(附加50μg/mL硫酸卡那霉素和20μg/mL利福平)；吸取菌液中的菌体1μL，采用引物L和R进行PCR检测；经PCR鉴定呈阳性的菌液，即为含有重组表达载体super1300(GFP-C)-TaNF-YB3D-S的重组根癌农杆菌，并将其命名为GV3101/super1300(GFP-C)-TaNF-YB3D-S。
2、转基因拟南芥的获得
(1)将哥伦比亚生态型拟南芥的野生型种子在4℃条件下春化72h，播种于MS培养基中，于22℃、15h光照/9h黑暗、湿度60～70％的培养室中培养，生长到两片真叶时移栽到营养土与蛭石比例3:1混合的种植钵中。待植株开花后，剪去主枝顶端，促进侧枝发展。侵染前一天浇足量的水，一般选在上午九点左右进行转化，此时开花最为旺盛，利于侵染。
(2)活化农杆菌：将经测序确定的农杆菌菌液在超净工作台倒入提前灭菌的250mL锥形瓶，加入150mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素和20μg/mL利福平的LB液体培养基，在28℃全温振荡器摇菌16～20h，至OD600在0.8～1.0。分别用三支50mL离心管分装菌液，离心机5500g离心20min，倒掉上清液。
(3)配置重悬液：2.5g蔗糖溶于50mL蒸馏水，再加入10μL silmet-77。
(4)在活化的农杆菌菌液中加入重悬液，每次加10mL，边加边测OD600直至达到0.6～0.8。
(5)蘸花法侵染拟南芥，用移液器枪头取上述混匀的重悬菌液滴在拟南芥花序，侵染后暗处理1d，光照时再浇水。
(6)一周后二次侵染。恢复光照和温度按正常方法培养植株至结实，收获成熟的T0代种子。
(7)待获得侵染的拟南芥植株的种子后，清洗消毒并均匀撒在含有60μL/100mL潮霉素的MS培养基上，培养14d左右至有拟南芥幼苗长出真叶，且部分幼苗的真叶长势健康、根扎入培养基明显较长，则其为阳性苗，将阳性苗移到钵中进行培养。
拟南芥种子具体清洗方法及培养方式如下：
a.种子消毒：将拟南芥种子置于2mL离心管中，配制浓度为10％的次氯酸钠消毒液(用蒸馏水经高温高压灭菌后稀释次氯酸钠溶液)，取1mL左右加入离心管手摇2～3min，对拟南芥种子进行消毒；离心后倒掉上清的消毒液，用同上的灭菌水稀释乙醇至浓度为75％，加入离心管清洗2～3次；离心后再用灭菌水清洗2～3次。以上操作全程在超净工作台完成。
b.种子培养：将清洗后的转基因拟南芥种子避光置于4℃冰箱冷藏72h，用修剪过的大号移液枪头点播至含有潮霉素的MS培养基中，平放生长。将在培养基中正常生根(培养约一周)的幼苗移栽至营养土中培养。
按照同样的方法种植筛选T1代种子，移栽含有潮霉素抗性的T1代株系并单株收获T1代株系内各单株上所结T2代种子，随机取10个T2代株系种子按照同样的方法进行潮霉素抗性筛选，得到3个超表达转基因株系(OE1、OE2、OE3)如图7所示，T2代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转基因株系。单株收获T2代为纯合转基因株系的T3代种子，进行下述步骤4的表型鉴定和分析。
T0代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株；株系表示由上一代的同一植株自交所产生的种子或植株群体。
3、转基因拟南芥植株的PCR鉴定
取步骤2得到的3个超表达转基因株系植株叶片，利用Trizol法提取叶片中总RNA，纯化后用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录酶进行反转录得到cDNA。采用引物L和R进行PCR扩增，结果全部呈阳性。其中，部分植株的PCR产物电泳图如图8所示。
4、转基因拟南芥植株的表型鉴定
(1)TaNF-YB3D-S超表达转基因株系萌发期的表型鉴定
ABA胁迫处理：
制作含有ABA(0μMol/L、0.5μMol/L、1μMol/L)的MS培养基(41.4g/L)，将清洗好的拟南芥野生型(WT)及三个转基因拟南芥种子点在板上培养7～10天观察发芽率。
ABA胁迫处理培养基：
将表1的材料加入锥形瓶充分搅拌混匀；用pH计调节混合溶液pH值范围至5.8～6.0；用封口膜密封，121℃、15min高温灭菌；将培养皿、封口膜等所需材料提前杀菌消毒再放入超净工作台；待培养基冷却至40～50℃时加入ABA(分别为0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L三种类型)，混匀后倒板；凝固后将培养基放至于4℃冰箱保存。
表1培养基成分
组分 加入量
MS固体干粉 41.4g
蒸馏水 1L
萌发率统计分析：
将获得的TaNF-YB3D-S转基因纯系种子(OE1、OE2、OE3)平铺在分别含有0.5μmol/L以及1μmol/L的ABA的MS培养基上进行处理并设置对照(CK)，通过观察幼苗的生长情况以及进行统计分析，发现在ABA胁迫下拟南芥超表达株系的发芽率比野生型明显降低，说明转基因株系种子萌发时对ABA具有更高的敏感性，结果如表2和图9所示：
表2转基因拟南芥植株响应ABA胁迫种子萌发率统计结果
Figure SMS_3
(2)TaNF-YB3D-S超表达转基因株系苗期的表型鉴定
培养基配制：
将表3的材料加入锥形瓶充分搅拌混匀；用pH计调节混合溶液pH值范围至5.8～6.0；用封口膜密封，121℃、15min高温灭菌；将培养皿、封口膜等所需材料提前杀菌消毒再放入超净工作台；待培养基冷却至40～50℃时倒入方板；凝固后将培养基放至于4℃冰箱保存。
表3培养基成分
组分 加入量
MS固体干粉 41.4g
蒸馏水 1L
氯化钠 分别为75mmol/L、100mmol/L和125mmol/L三种
一定浓度的氯化钠能够使外界渗透压升高，导致细胞脱水，植物因此无法正常吸收水分，可以用来模拟盐胁迫状态。将超表达TaNF-YB3D-S拟南芥转基因株系在正常条件下培养5天后转移至方板进行垂直培养，用75mmol/L、100mmol/L和125mmol/L三种浓度的氯化钠对苗期拟南芥进行胁迫处理，模拟盐胁迫环境，设置对照组，培养10天后对其根长进行统计分析。
通过对实验结果的观察可见，在盐胁迫下，OE1、OE2、OE3株系中植株苗期根长均较野生型更长，表现出对盐胁迫更高的耐受性，并且随浓度升高差异更加显著，结果如表4和图10所示：
表4转基因拟南芥植株正常和胁迫条件下根长统计结果
Figure SMS_4
(3)TaNF-YB3D-S超表达转基因株系成株期的表型鉴定
土培盐胁迫处理：
将拟南芥野生型(WT)和三个转基因株系在圆形培养皿正常生长下培养5天后转移至混有营养土和蛭石(质量比3:1)的塑料钵中培养，在温室正常条件下培养15天左右，分别进行正常和盐胁迫(200mmol/L)处理，并在5、8、12天后观察其植株的生长情况，如图11所示。
对处理后12天的电导率、叶绿素含量、株高以及处理后23天的干重、鲜重进行测定与比较。结果如表5以及图12所示。
表5转基因拟南芥植株正常和胁迫条件下各指标统计结果
Figure SMS_5
/>
Figure SMS_6
由表5可知：
野生型在盐胁迫条件下干重、鲜重、株高均较正常条件下差异明显，转基因株系在盐胁迫条件下的干重、鲜重、株高均较正常条件下差异不大；说明转基因株系对盐胁迫条件具有较高的耐受性。
进一步分析发现，盐胁迫与正常条件培养的植株相比电导率均有所增加，野生型在盐胁迫下的电导率与正常条件下相比差异较大，但转基因株系在盐胁迫前后差异较小；说明野生型在盐胁迫下，细胞受到了破坏，细胞内电解质外渗，生命活动受到影响。转基因株系在盐胁迫下细胞受到的伤害较小，细胞内的电解质外渗少，因此具有较强的耐盐性。
通过分析处理后5、8、12天植株叶绿素含量可知，正常条件培养的植株与盐胁迫处理的植株相比，盐胁迫条件下野生型叶绿素含量下降幅度较大，而转基因株系叶绿素含量下降幅度不明显，这说明转基因株系耐盐性较强。
(4)T3代转基因拟南芥的实时荧光定量PCR检测
将步骤(1)中的T3代纯合转基因株系(OE1、OE2、OE3)植株根系和哥伦比亚生态型拟南芥的野生型(WT)根系拍照后，分别用Trizol法提取总RNA，纯化后用HiScriptⅢRTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录酶进行反转录得到cDNA。以TaActin为内参基因，利用qRT-PCR引物对TaNF-YB3D-S基因进行实时定量PCR检测。
实时荧光定量PCR仪型号ABI QuantStudio3，使用ChamQTMSYBR Color qPCRMaster Mix试剂，小麦TaActin基因的表达水平作为内参，结果分析采用比较阈值法对实时定量PCR结果进行定量分析，设置荧光域值，确定在该荧光域值下的循环数Ct值。根据Ct值，计算C值。C＝2-^a，△Ct＝Ct目的基因-C内参基因，计算三个重复的C值的平均值作为目的基因的相对表达量。
反应体系如表6所示：
表6反应体系
组分 使用量
2x ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 5μL
50x ROX Reference DyeⅡ 0.2μL
Forward Primer(10μM) 0.2μL
Reverse Primer(10μM) 0.2μL
稀释3倍后的第一链cDNA溶液 0.5μL
ddH20 3.9μL
qRT-PCR扩增程序采用三步法：
预变性：95℃反应3min；循环反应：95℃反应15s，59℃反应20s，共40个循环；溶解曲线：95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s。
此步骤中用于实时定量PCR的引物序列如下：
Actin-L：5'-TATGCCAGCGGTCGAACAAC-3'(SEQ ID NO:7)
Actin-R：5'-GGAACAGCACCTCAGGGCAC-3'(SEQ ID NO:8)
qRT-L：5'-ATGGATGATGAGGCGCAGGA-3'(SEQ ID NO:9)
qRT-R：5'-TCAGTTGGGGTTAAGGCTA-3'(SEQ ID NO:10)
结果如图13所示，转基因拟南芥植株中外源基因TaNF-YB3D-S的表达量明显高于野生型植株，该结果与上述超表达转基因拟南芥的表型对比结果相一致。
上述实验证明，将含有SEQ ID NO:4所示DNA序列(即所述小麦TaNF-YB3D-S基因)的重组表达载体super1300(GFP-C)-TaNF-YB3D-S转化拟南芥得到的T3代纯合转基因植株，其表型与相同条件下的野生型拟南芥植株相比，表现出对盐胁迫更高的耐受性，并且随浓度升高差异更加显著；这说明，小麦TaNF-YB3D-S基因能够显著提高植物的耐盐性能，由于该基因是小麦TaNF-YB3D基因的可变剪接形式，与TaNF-YB3D基因所表达的氨基酸序列完全一致，因此，本领域技术人员可知，TaNF-YB3D基因也实际具有耐盐功能。
综上所述，本发明通过研究TaNF-YB3D-S在小麦盐胁迫下的响应机制，对TaNF-YB3D-S进行功能验证，对培育抗逆作物品种具有重要理论意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.小麦TaNF-YB3D-S基因，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.含有权利要求1所述小麦TaNF-YB3D-S基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
3.小麦TaNF-YB3D基因或权利要求1所述小麦TaNF-YB3D-S基因在提高植物耐盐性能中的应用；其中，小麦TaNF-YB3D基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种提高植物耐盐性能的方法，其特征在于，是将权利要求3中所述的小麦TaNF-YB3D基因或权利要求1所述的小麦TaNF-YB3D-S基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化菌株，获得携带有小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因的重组菌株，然后将重组菌株侵染植物叶片，使植物携带有小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因，并最终通过小麦TaNF-YB3D基因或小麦TaNF-YB3D-S基因的表达，调控植物的耐盐性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌株选自根癌农杆菌或发根农杆菌。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导或农杆菌介导进行重组表达载体的转化。
8.根据权利要求3所述的应用，或者权利要求4～7任一项所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
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