CN110964091A

CN110964091A - 小麦抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12及其编码基因和应用

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Publication number: CN110964091A
Application number: CN202010007319.2A
Authority: CN
Inventors: 高世庆; 赵昌平; 公杰; 刘永杰; 赵保存; 张肖; 廖祥政; 张荃; 张风廷; 张淑娟; 陈兆波; 王永波
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-01-04
Filing date: 2020-01-04
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2040-01-04
Also published as: CN110964091B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaNF‑YB12及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱杂种优势相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

小麦抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及小麦抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12及其编码基因和应用。

背景技术

小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，克隆抗逆相关基因为培育作物抗逆新种质提供候选抗逆基因资源。

NF-Y转录因子家族(nuclear factor Y,NF-Y)作为转录因子家族中的一员，是近几年来新发现的一类转录因子家族，NF-Y转录因子不只存在于植物中，还广泛存在于酵母和哺乳动物等真核生物中。NF-Y转录因子由三个不同的亚基组成，分别是NF-YA、NF-YB和NF-YC，除此之外，研究还发现在酵母等少数真菌中存在第四类亚基HAPNF-Y转录因子在行使其功能时，NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基之间会特异性结合形成异源三聚体，并与其它调控应答基因的启动子区域相互作用，从而调控下游靶基因的表达。酵母和哺乳动物中的NF-Y基因，一般每种亚基只由一个基因编码，但在植物中每个亚基很大程度上扩展由几个或更多基因编码。这样的家族扩增，在很大程度上提供了NF-YA/NF-YB/NF-YC更多的异源三聚体组合机会，并大量增加了核因子Y功能复杂的潜力。

研究表明，NF-Y基因广泛参与植物体内逆境胁迫响应。AtNF-YA1基因过量表达在拟南芥萌发前期对高盐胁迫和脱落酸(ABA)敏感，另一方面，NF-YA1-RNAi植株对高盐胁迫不敏感，表现出较低的盐胁迫水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱杂种优势相关蛋TaNF-YB12的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12的应用。

本发明所提供的抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12，来源于小麦，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的植物抗旱杂种优势相关蛋TaNF-YB12由271个氨基酸残基组成，是转录因子。自SEQ ID NO.1的氨基末端第20-30位氨基酸残基是DNA结合域，自SEQ ID NO.1的第121-140位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。

SEQ ID NO.1

MTKIIKEMLPPDVRVARDTQDLLVECCVEFINLLSSESNDVCSRDDKKTIAPEHVIRALQDLGFKEYVEEVYAAYEQHKLETLDSPKATKFTGIEMTEEEAVAEQQRMFAEARARMNNGAAKPKEPALEPQNQPQQPPQPHLQLHPQAQQPPQPQPQLHYPQSQQPLQPFTQAPPQQPLHPQLQQYTQAPPQQPLQPPLQLYPQAQPEQPLQPQSSGSTTGTCVISAAAPSATGTTAAATSAPAIPAISTAAPSATPADASAAAATSTPAT

为了使蛋白TaNF-YB12便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子TaNF-YB12可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

根据本发明的TaNF-YB12编码基因具有如SEQ ID NO.2所示cDNA序列。

SEQ ID NO.2

ATGACCAAGATTATCAAGGAGATGCTACCGCCTGATGTTCGAGTAGCAAGAGATACACAGGATCTTCTTGTTGAATGCTGTGTAGAGTTCATCAATCTTCTTTCTTCGGAATCCAATGACGTGTGCAGCCGGGACGACAAGAAAACTATTGCCCCTGAACATGTTATTAGGGCTTTGCAGGATCTTGGCTTCAAGGAGTATGTTGAAGAAGTTTATGCAGCCTACGAACAGCACAAGCTTGAAACTCTGGACTCTCCAAAAGCAACCAAGTTCACTGGTATAGAGATGACTGAAGAAGAAGCTGTTGCTGAACAGCAGAGAATGTTTGCTGAAGCCCGAGCAAGGATGAACAATGGAGCTGCCAAACCAAAGGAGCCTGCATTAGAACCACAGAATCAACCCCAACAGCCCCCACAACCTCATCTGCAGCTGCATCCCCAAGCACAGCAGCCTCCACAACCTCAACCGCAACTGCATTATCCTCAATCACAGCAGCCCCTGCAACCGTTTACTCAGGCTCCACCACAGCAACCCCTGCATCCTCAACTGCAACAGTATACTCAGGCTCCACCACAGCAACCCCTACAACCTCCACTGCAGCTGTATCCTCAGGCTCAACCTGAGCAACCGCTGCAGCCTCAATCCTCAGGATCAACCACAGGAACCTGTGTAATCTCAGCTGCAGCTCCATCTGCAACCGGCACCACTGCTGCTGCAACCTCCGCCCCAGCAATCCCCGCAATCTCAACTGCAGCTCCATCAGCAACCCCAGCCGACGCTAGTGCCGCCGCCGCAACCTCAACCCCAGCCACCTGA

含有TaNF-YB12基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有TaNF-YB12基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaNF-YB12构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有TaNF-YB12基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaNF-YB12基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、小麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以抗旱、耐盐性较强的京麦8杂交种为实验材料，得到了抗逆相关的TaNF-YB12蛋白及其编码基因，并将其导入小麦中，显著提高了转基因小麦的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1显示胁迫条件下TaNF-YB12基因的表达模式分析(n＝3)。1727：二系杂交小麦品种；04Y花27：杂交小麦1727的父本；BS1745：杂交小麦1727的母本。

图2显示TaNF-YB12基因亚细胞融合表达载体的构建。

图3显示TaNF-YB12基因亚细胞定位分析。

图4显示TaNF-YB12转基因小麦筛盒抗旱产量鉴定。WT为野生型小麦京冬18；HT1、HT2、HT3为不同转基因小麦株系。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：TaNF-YB12基因的表达模式分析

四种胁迫处理后的1727杂交小麦中TaNF-YB12基因在15％PEG处理12h时表达量达到峰值，为0h的3.34倍；在250mM NaCl胁迫3h时TaNF-YB12基因表达量最高，为0h的1.36倍；经40℃高温处理12h时TaNF-YB12基因表达量最高，为0h的5.42倍；经200μM ABA处理时，TaNF-YB12基因在处理6h时表达量最高，为0h的2.04倍(图1)。四种胁迫处理后的父本04Y花27中TaNF-YB12基因在15％PEG处理24h时表达量最高，为0h的2.77倍；TaNF-YB12基因在250mM NaCl胁迫24h表达量最高，为0h的1.17倍；TaNF-YB12基因经40℃高温处理6h表达量最高，为0h的1.71倍；经200μM ABA处理时，TaNF-YB12基因在处理1h时表达量最高，为0h的2.14倍(图1)。四种胁迫处理后的母本BS1745中TaNF-YB12基因在15％PEG处理12h时表达量最高，为0h的2.14倍；TaNF-YB12基因在250mM NaCl胁迫12h表达量最高，为0h的2.0倍；TaNF-YB12基因经40℃高温处理24h时表达量最高，为0h的1.86倍；经200μM ABA处理时，TaNF-YB12基因在处理3h时达到表达量的最高峰，为0h的4.02倍(图1)。

以上结果表明，1727杂交小麦中TaNF-YB12基因受到PEG和高温的强诱导表达以及ABA的微弱诱导表达，并且在PEG和高温胁迫处理下，1727杂交小麦中TaNF-YB12基因的表达量要高于父本和母本中TaNF-YB12基因的表达量。初步表明TaNF-YB12基因可能参与1727杂交小麦的抗旱杂种优势调控网络应答。

实施例2：小麦抗旱杂种优势相关TaNF-YB12基因的cDNA克隆

对生长10天左右的京麦1727幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得TaNF-YB12基因的全长序列816bp。

用Trizol提取小麦幼苗的总RNA，用superscript II(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaNF-YB12基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-ATGACCAAGATTATCAAGGAG-3’，

P2：5’-TCAGGTGGCTGGGGTTGAGGTT-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到约为800bp左右的条带，与预期结果相符(图2中的A图)。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaNF-YB12基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至813位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示TaNF-YB12基因的重组载体命名为pTE-TaNF-YB12。

将TaNF-YB12基因的序列进行比对，在小麦中未发现同源蛋白基因，证明TaNF-YB12基因是一个新的基因。

进一步用引物P1和P2在小麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。

实施例3：TaNF-YB12基因亚细胞融合表达载体构建

PCR扩增TaNF-YB12基因(图2中的B图)，胶回收目的片段，用HindIII和BamHI进行双酶切GFP表达载体，In-Fusion连接线性化GFP载体和目的片段，连接产物转化Top 10感受态，菌落PCR鉴定。结果显示，能够扩增出长度为816bp的TaNF-YB12的基因序列，表明鉴定正确，将重组载体命名为GFP-TaNF-YB12。

实施例4：TaNF-YB12基因亚细胞分析

为了确认TaNF-Y蛋白的亚细胞定位，使用PEG转化法将对照组35S::GFP和实验组35S::GFP-TaNF-YB12载体质粒分别转化到同等批次制备的小麦原生质体，然后取适量原生质体于载玻片，放于激光扫描共聚焦显微镜下观察GFP荧光。结果发现，对于转入35S::GFP-TaNF-YB12质粒的原生质体，在细胞核、细胞质和细胞膜中都可以同时检测到GFP荧光。尽管TaNF-YB12属于NF-Y转录因子家族，而且含有DNA结合域，但是TaNF-YB12失去了核定位的专一性，这可能是说明TaNF-YB12蛋白参与的生物学的功能更加广泛有密切关系。

实施例5：TaNF-YB12基因过表达增强小麦的抗旱性

1、重组表达载体的构建

1)Ubi-TaNF-YB12重组表达载体的构建

以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI221的Ubi启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体pUbi::TaNF-YB12。

引物序列如下：

TaNF-YB12[SmaI]5’-TCCCCCGGGGATGACCAAGATTATCAAGGAG-3’

TaNF-YB12[SpeI]5’-GGACTAGT TCAGGTGGCTGGGGTTGAGGTT-3’

2、转基因小麦获得和功能鉴定

1)转基因小麦的获得

将上述构建的重组表达载体pUbi::TaNF-YB12分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用pUbi::TaNF-YB12的根癌农杆菌EHA105转化小麦，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物):5’-GTGTGCAGCCGGGACGACAAGAAAA-3’，

P4(下游引物):5’-CTGCAGCTGAGATTACACAGGTTCC-3’。

对Ubi::TaNF-YB12转基因小麦进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得600bp左右条带，结果获得转Ubi::TaNF-YB12小麦4个稳定株系(图4中上图)。

同时将pBI221空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得8个株系的转空载体小麦(筛选获得的转基因小麦用T₂代表示)。

2)转基因小麦耐旱性鉴定

对TaNF-YB12转基因株系16HD215、16HD434、16HD679、16HD738转基因株系材料进行温室旱棚小区产量鉴定，其中，京冬18为受体对照。结果表明：在控制浇水情况下，对照京冬18叶片早衰发黄，而转基因株系的叶片持绿性较好。产量比较发现，转基因株系16HD215、16HD434、16HD679、16HD738比对照京冬18产量增加，其中16HD434比对照增产5.81％，16HD738比对照增产7.1％，粒重增加显著(图4中下图)。上述结果表明，TaNF-YB12过表达增强了转基因小麦的抗旱性，产量也比对照有一定幅度的增产。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 小麦抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 271

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivuml.)

<400> 1

Met Thr Lys Ile Ile Lys Glu Met Leu Pro Pro Asp Val Arg Val Ala

1 5 10 15

Arg Asp Thr Gln Asp Leu Leu Val Glu Cys Cys Val Glu Phe Ile Asn

20 25 30

Leu Leu Ser Ser Glu Ser Asn Asp Val Cys Ser Arg Asp Asp Lys Lys

35 40 45

Thr Ile Ala Pro Glu His Val Ile Arg Ala Leu Gln Asp Leu Gly Phe

50 55 60

Lys Glu Tyr Val Glu Glu Val Tyr Ala Ala Tyr Glu Gln His Lys Leu

65 70 75 80

Glu Thr Leu Asp Ser Pro Lys Ala Thr Lys Phe Thr Gly Ile Glu Met

85 90 95

Thr Glu Glu Glu Ala Val Ala Glu Gln Gln Arg Met Phe Ala Glu Ala

100 105 110

Arg Ala Arg Met Asn Asn Gly Ala Ala Lys Pro Lys Glu Pro Ala Leu

115 120 125

Glu Pro Gln Asn Gln Pro Gln Gln Pro Pro Gln Pro His Leu Gln Leu

130 135 140

His Pro Gln Ala Gln Gln Pro Pro Gln Pro Gln Pro Gln Leu His Tyr

145 150 155 160

Pro Gln Ser Gln Gln Pro Leu Gln Pro Phe Thr Gln Ala Pro Pro Gln

165 170 175

Gln Pro Leu His Pro Gln Leu Gln Gln Tyr Thr Gln Ala Pro Pro Gln

180 185 190

Gln Pro Leu Gln Pro Pro Leu Gln Leu Tyr Pro Gln Ala Gln Pro Glu

195 200 205

Gln Pro Leu Gln Pro Gln Ser Ser Gly Ser Thr Thr Gly Thr Cys Val

210 215 220

Ile Ser Ala Ala Ala Pro Ser Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Ala Thr

225 230 235 240

Ser Ala Pro Ala Ile Pro Ala Ile Ser Thr Ala Ala Pro Ser Ala Thr

245 250 255

Pro Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ser Thr Pro Ala Thr

260 265 270

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivuml.)

<400> 2

atgaccaaga ttatcaagga gatgctaccg cctgatgttc gagtagcaag agatacacag 60

gatcttcttg ttgaatgctg tgtagagttc atcaatcttc tttcttcgga atccaatgac 120

gtgtgcagcc gggacgacaa gaaaactatt gcccctgaac atgttattag ggctttgcag 180

gatcttggct tcaaggagta tgttgaagaa gtttatgcag cctacgaaca gcacaagctt 240

gaaactctgg actctccaaa agcaaccaag ttcactggta tagagatgac tgaagaagaa 300

gctgttgctg aacagcagag aatgtttgct gaagcccgag caaggatgaa caatggagct 360

gccaaaccaa aggagcctgc attagaacca cagaatcaac cccaacagcc cccacaacct 420

catctgcagc tgcatcccca agcacagcag cctccacaac ctcaaccgca actgcattat 480

cctcaatcac agcagcccct gcaaccgttt actcaggctc caccacagca acccctgcat 540

cctcaactgc aacagtatac tcaggctcca ccacagcaac ccctacaacc tccactgcag 600

ctgtatcctc aggctcaacc tgagcaaccg ctgcagcctc aatcctcagg atcaaccaca 660

ggaacctgtg taatctcagc tgcagctcca tctgcaaccg gcaccactgc tgctgcaacc 720

tccgccccag caatccccgc aatctcaact gcagctccat cagcaacccc agccgacgct 780

agtgccgccg ccgcaacctc aaccccagcc acctga 816

Claims

1.一种植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种植物抗旱杂种优势相关基因，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12。

3.如权利要求2所述的植物抗旱杂种优势相关基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.2。

4.包含权利要求2或3所述的植植物抗旱杂种优势相关基因的重组载体。

5.包含权利要求2或3所述的植物抗旱杂种优势相关基因重组的菌株。

6.权利要求1所述植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12的应用。

7.权利要求2或3所述植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB12的应用。

8.权利要求1所述植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12在提高植物抗旱性方面的应用。

9.权利要求1所述植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB12在提高植物产量方面的应用。