CN108341859A

CN108341859A - 植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白及其基因和应用

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Publication number: CN108341859A
Application number: CN201810447174.0A
Authority: CN
Inventors: 唐益苗; 高世庆; 赵昌平; 郭春曼; 徐磊; 房兆峰; 柳珊; 孙辉; 王永波; 王娜
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: CN108341859B

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白及其基因和应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将其基因导入到小麦中，显著提高小麦抗旱性和产量。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白和产量及其编码基因对改良、增强植物抗逆性，提高产量、加速抗逆高产分子育种进程，以及有效节省水资源和全球粮食安全具有十分重要的理论和实际意义。

Description

植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白及其基因和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白及其基因和应用。

背景技术

目前，常规育种技术提高作物单产已经处于瓶颈阶段,要进一步提高单产水平,对新品种也提出了更高的要求,目前利用常规育种技术和转基因技术结合，成为现代高产育种主要手段之一。

小麦穗长是决定小麦产量的主要因素之一，也是决定产量的主要农艺性状，。小麦适当的形成大穗是理想株型的关键。获得具有大穗的小麦品种是我国小麦育种主要目标和目前市场急需开发的产品。

NF-Y(nuclear factor-y)是一类普遍存在于真核生物中的复合转录因子，由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基组成。目前，越来越多的研究表明，个别单独亚基在多种生物进程中发挥着重要的作用。例如,干旱胁迫、蓝光信号转导、干旱胁迫、光周期开花、ABA传输以及光合作用和根的伸长。

因此，利用产量相关的NF-YB类转录因子基因改良抗逆性和提高作物产量具有非常重要理论和实践意义。利用柳枝稷种质资源，挖掘、筛选出优良产量和抗逆性相关基因提高小麦产量，为培育抗逆境高产转基因新品种提供重要的抗逆基因资源，对全球粮食安全方面均具有重要实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白PvNF-YB8。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白PvNF-YB8的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白PvNF-YB8及其基因的应用。

本发明所提供的抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白PvNF-YB8，来源于柳枝稷，氨基酸为255个，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MRKKLGTRFPAARIKKIMQADEDVGMIALAVPVLVSRALELFLQDLIDRTYEITLQSGAKTLNSFHLKQCVKRYSSFDFLTEVVNKVPDLGGADSCGDERGLPRRRKSNGSDPENDESRSSKMVIRSANISPRGRGRGRGRGRGRPPTKRKEVGYVQFEDESGMFAEQGEPLPGDETVPESNHSNENITQSAEPPVEAPAPAAAPGASKVEEAYTDHQSDWPMPDAAIGNIGVGPSGFGHLTVQVDEDEDYDNED

据本发明的PvNF-YB8基因编码上述蛋白，可具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，PvNF-YB8开放阅读框(ORF)长度为768bp。

SEQ ID NO.2：

ATGCGGAAGAAGCTCGGCACCCGGTTCCCCGCGGCTCGGATAAAAAAGATAATGCAAGCAGATGAGGACGTTGGCATGATTGCACTAGCCGTGCCTGTTTTAGTTTCAAGGGCTCTTGAATTGTTTTTGCAAGATTTGATTGATCGGACCTATGAAATTACTCTTCAGAGCGGTGCAAAGACTTTGAATTCCTTCCACCTGAAGCAATGTGTGAAAAGGTACAGTTCTTTTGATTTCCTAACTGAAGTTGTCAACAAGGTACCAGACCTTGGTGGTGCAGACTCTTGTGGGGATGAAAGAGGGTTACCTAGAAGAAGAAAGTCAAATGGCAGTGACCCAGAGAATGATGAATCAAGATCCAGCAAAATGGTCATAAGAAGTGCGAACATCAGCCCTAGAGGACGTGGGAGAGGTCGAGGCAGGGGGCGAGGGAGGCCACCAACCAAGAGAAAGGAAGTTGGTTATGTACAATTTGAGGATGAGAGCGGCATGTTTGCTGAACAAGGTGAACCTTTACCAGGAGACGAGACAGTTCCAGAGAGCAACCATAGCAATGAAAACATAACCCAAAGTGCAGAACCTCCAGTAGAGGCTCCCGCACCAGCAGCTGCGCCAGGTGCATCTAAGGTGGAAGAAGCGTATACTGACCATCAGTCAGATTGGCCAATGCCAGATGCTGCCATTGGAAACATTGGTGTCGGTCCATCTGGTTTTGGGCATCTGACGGTGCAGGTTGATGAGGATGAGGACTACGACAACGAGGATTAG

另外，干旱、高盐、冷和ABA胁迫处理表达实验表明PvNF-YB8基因主要受干旱、高盐、低温和脱落酸等多种胁迫因子的诱导，可能参与多种逆境胁迫信号转导，其中对高盐的胁迫反应较显著。同时，构建该基因的过量表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法将PvNF-YB8转入拟南芥，PEG胁迫、干旱和高盐处理实验表明转PvNF-YB8基因拟南芥具有抗旱性和耐盐性，证明了PvNF-YB8基因在拟南芥中成功表达，且提高了拟南芥的抗旱和耐盐能力，可以作为作物抗旱和耐盐育种的优质候选基因。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱、耐盐和提高小麦产量植物的方法。

本发明所提供的培育抗旱耐盐植物和提高小麦产量的方法，是将上述任一种含有PvNF-YB8基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物和提高小麦产量转基因株系。

所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性和提高小麦产量，如对干旱或盐胁迫的耐逆性，提高产量如提高小麦的穗长。本发明以抗旱、耐盐性较强，光合能力强的的能源草柳枝稷为实验材料，得到了抗旱、耐盐性基因和产量相关基因PvNF-YB8，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱、耐盐性，导入到小麦中，显著提高小麦抗旱性和产量。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白和产量及其编码基因对改良、增强植物抗逆性，提高产量、加速抗逆高产分子育种进程，以及有效节省水资源和全球粮食安全具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1显示PvNF-YB8基因在干旱、盐胁、低温和脱落酸迫处理下的表达特征，其中，A.为PvNF-YB8基因在低温胁迫处理下的表达特征；B.为PvNF-YB8基因在干旱胁迫处理下的表达特征；C.为PvNF-YB8基因在ABA胁迫处理下的表达特征；D为PvNF-YB8基因在盐胁迫处理下的表达特征。

图2显示转PvNF-YB8基因拟南芥耐旱性的鉴定，其中，A.野生型拟南芥在MS培养基上生长情况(对照)，B.转基因拟南芥在7％PEG的MS培养基上生长情况，C.转基因拟南芥在150μM NaCl的MS培养基上生长情况。

图3.显示PvNF-YB8转基因拟南芥耐旱性的鉴定，其中，.A.野生型拟南芥正常生长情况(对照)，B.转基因拟南芥在干旱胁迫12天正常生长情况，C.转基因拟南芥在在干旱胁迫12天，复水后第3d后生长情况。

图4显示转基因小麦产量比较试验，其中，A.转基因小麦和对照(WT,JING18)的穗长照片；B.转基因小麦田间生长情况比较；C.转基因小麦比对照(WT：JINGDONG18)增产达27.5％。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1、PvNF-YB8基因的克隆及序列基序分析

将25℃光照培养2周左右的柳枝稷植株进行干旱、高盐(200mM NaCl)胁迫处理，分别在0h、l h、2h、5h、10h、24h后取样，迅速置于液氮冷冻，-80℃保存备用。根据RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)完成植物叶片组织的总RNA提取，之后以提取的总RNA为模板，以AP序列为引物，用反转录酶(M-MLV)进行反转录，得到用于后续实验的cDNA模板。设计一对引物：

PvNF-YB8[F]：ATGCGGAAGAAGCTCGGCACCCGGT

PvNF-YB8[R]：CTAATCCTCGTTGTCGTAGTCCTCA

本发明得到一个基因PvNF-YB8，PvNF-YB8开放阅读框(ORF)长度765bp，编码255个氨基酸，与Panicum hallii同源性仅仅为97％，证明为新基因。

实施例2逆境胁迫处理下柳枝稷PvNF-YB8基因的表达特征

将柳枝稷种子种在盆中，生长3周后取幼苗进行如下胁迫处理：(1)盐胁迫处理是在培养液中加入NaCl，至终浓度为300mmol L–1，分别处理1、2、5、10和24h；(2)干旱胁迫处理是在培养液中加入PEG，至质量分数为20％，分别放置上述时间段；(3)ABA处理是在培养液中加入ABA，至终浓度为50μmol L–1，分别处理上述5个时间段；(4)对于冷处理，是将幼苗置于4℃冰箱内，分别处理上述时间。每次胁迫处理后的材料用锡箔纸迅速包好置液氮中速冻，–80℃冰箱保存备用。分别将干旱处理、盐处理后0、1、2、5、10、24小时的样品提取总RNA，以PvNF-YB8DNA为探针(序列表中的序列1)，进行荧光定量分析。半定量分析结果见图1，A为低温的样本；B为干旱处理的样本；C为ABA处理的样本；C为NaCl处理的样本。将上述各种胁迫处理材料的RNA反转录为cDNA，作为模板，采用Real-time RT-PCR的方法检测了PvNF-YB8基因的表达特性。结果表明，PvNF-YA8基因在ABA胁迫处理下，在1h处表达量最高，为对照的5倍左右，之后呈下降趋势；在冷胁迫处理下，10h处表达量最高；在干旱和高盐胁迫处理下，分别在5h和10h处表达量最高。综上所述PvNF-YA8基因受干旱、低温、高盐和ABA等胁迫因子的诱导。

实施例3PvNF-YB8转基因拟南芥株系耐旱性鉴定

将T3代转35S-PvNF-YB8基因拟南芥种子分别在植株及T3代转空载体对照植株的4周龄苗，转基因拟南芥植株进行干旱胁迫处理14天后恢复浇水3天，观察表型并拍照。结果显示，选取L5和L6两个转PvNF-YA8基因拟南芥株系，进一步检测转基因拟南芥植株对干旱胁迫的耐性。结果显示，在干旱处理第14d的时候，部分野生型拟南芥死亡，转基因拟南芥的莲座叶叶片颜色加深；复水3天后转基因拟南芥绝大部分恢复，而野生型拟南芥大量死亡(图2)。由此表明PvNF-YA8基因提高了拟南芥的耐旱性。

实施例4PvNF-YB8转基因小麦株系耐旱性和产量比较试验

将PvNF-YB8构建到过量表达pCAMBIA3300载体中，利用农杆菌介导法，将该基因转化到京冬18中，目前已经获得T2代转基因株系(OE-18:OE-2，OE-3)，经过分子检测，获得阳性转基因植株，转PvNF-YB8基因株型小麦OE-2，OE-3等品系，3次重复，小区面积为0.02亩，结果显示，选取OE-2，OE-3两个转PvNF-YA8基因小麦株系，进一步检测转基因小麦植株对干旱胁迫的耐性。结果显示，在干旱处理第30d的时候，部分野生型小麦死亡；复水3天后转基因小麦绝大部分恢复，而野生型小麦大量死亡，在干旱条件下，田间试验结果显示野生型小麦表现提前枯死，转基因小麦表现绿色，由此表明PvNF-YA8基因提高了小麦的耐旱性(图3)。

进一步进行产量比较试验发现：转基因植株提高小麦穗长，小麦穗粒数增加，粗杆转基因增产27.5％以上(图4)。因此，PvNF-YA8作为在作物育种以高产抗逆候选基因。本发明的PvNF-YA8基因相关蛋白及其编码基因对作物育种以及提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及世界粮食安全具有十分重要的理论和实际意义。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白及其基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 255

<212> PRT

<213> Triticum aestivuml.

<400> 1

Met Arg Lys Lys Leu Gly Thr Arg Phe Pro Ala Ala Arg Ile Lys Lys

1 5 10 15

Ile Met Gln Ala Asp Glu Asp Val Gly Met Ile Ala Leu Ala Val Pro

20 25 30

Val Leu Val Ser Arg Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gln Asp Leu Ile Asp

35 40 45

Arg Thr Tyr Glu Ile Thr Leu Gln Ser Gly Ala Lys Thr Leu Asn Ser

50 55 60

Phe His Leu Lys Gln Cys Val Lys Arg Tyr Ser Ser Phe Asp Phe Leu

65 70 75 80

Thr Glu Val Val Asn Lys Val Pro Asp Leu Gly Gly Ala Asp Ser Cys

85 90 95

Gly Asp Glu Arg Gly Leu Pro Arg Arg Arg Lys Ser Asn Gly Ser Asp

100 105 110

Pro Glu Asn Asp Glu Ser Arg Ser Ser Lys Met Val Ile Arg Ser Ala

115 120 125

Asn Ile Ser Pro Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

130 135 140

Arg Pro Pro Thr Lys Arg Lys Glu Val Gly Tyr Val Gln Phe Glu Asp

145 150 155 160

Glu Ser Gly Met Phe Ala Glu Gln Gly Glu Pro Leu Pro Gly Asp Glu

165 170 175

Thr Val Pro Glu Ser Asn His Ser Asn Glu Asn Ile Thr Gln Ser Ala

180 185 190

Glu Pro Pro Val Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ser

195 200 205

Lys Val Glu Glu Ala Tyr Thr Asp His Gln Ser Asp Trp Pro Met Pro

210 215 220

Asp Ala Ala Ile Gly Asn Ile Gly Val Gly Pro Ser Gly Phe Gly His

225 230 235 240

Leu Thr Val Gln Val Asp Glu Asp Glu Asp Tyr Asp Asn Glu Asp

245 250 255

<210> 2

<211> 768

<212> DNA

<213> Triticum aestivuml.

<400> 2

atgcggaaga agctcggcac ccggttcccc gcggctcgga taaaaaagat aatgcaagca 60

gatgaggacg ttggcatgat tgcactagcc gtgcctgttt tagtttcaag ggctcttgaa 120

ttgtttttgc aagatttgat tgatcggacc tatgaaatta ctcttcagag cggtgcaaag 180

actttgaatt ccttccacct gaagcaatgt gtgaaaaggt acagttcttt tgatttccta 240

actgaagttg tcaacaaggt accagacctt ggtggtgcag actcttgtgg ggatgaaaga 300

gggttaccta gaagaagaaa gtcaaatggc agtgacccag agaatgatga atcaagatcc 360

agcaaaatgg tcataagaag tgcgaacatc agccctagag gacgtgggag aggtcgaggc 420

agggggcgag ggaggccacc aaccaagaga aaggaagttg gttatgtaca atttgaggat 480

gagagcggca tgtttgctga acaaggtgaa cctttaccag gagacgagac agttccagag 540

agcaaccata gcaatgaaaa cataacccaa agtgcagaac ctccagtaga ggctcccgca 600

ccagcagctg cgccaggtgc atctaaggtg gaagaagcgt atactgacca tcagtcagat 660

tggccaatgc cagatgctgc cattggaaac attggtgtcg gtccatctgg ttttgggcat 720

ctgacggtgc aggttgatga ggatgaggac tacgacaacg aggattag 768

Claims

1.植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关基因，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白。

3.根据权利要求2所述的植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关基因的重组载体。

5.包含权利要求2所述的植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关基因的重组细胞。

6.一种提高小麦抗旱、耐盐特性和提高小麦产量的方法，其特征在于，所述方法包括在小麦中转入并表达权利要求2所述的植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关基因的步骤。

7.权利要求1所述的植物抗旱、耐盐和提高小麦产量相关蛋白的应用。