CN109666681B

CN109666681B - 植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109666681B
Application number: CN201811317851.3A
Authority: CN
Inventors: 高世庆; 赵昌平; 张风廷; 赵宝存; 杨涛
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2018-11-07
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2038-11-07
Also published as: CN109666681A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱、耐盐相关蛋白EeCIPK26及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因能够改良、增强拟南芥抗逆性、提高产量、加速抗逆分子育种进程、有效节省水资源。

Description

植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26及其编码基因和应用。

背景技术

小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。

蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超级家族，根据基因序列的相似性和基因结构的不同，分为SnRK1，SnRK2和SnRK3三个亚家族。SnRK3是植物特有的一类蛋白激酶，又被称为类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(calcineurin B-like calcium sesor-interacting protein kinases，CIPK)。CIPK是一类Ser/Thr蛋白激酶，其包括N端激酶区、C端调控区，还包括一个由21个氨基酸组成的FISL/NAF元件。

目前，在拟南芥和水稻中已分别发现25、30个CIPK家族成员。其中，N端激酶区氨基酸序列一致性在51％-90％之间。而在C端调控区这两者之间的氨基酸序列一致性在24％-58％之间，表现出高度的可变性。

水稻中克隆出的OsCIPK基因均参与了各种不同的非生物胁迫的转录水平反应。水稻中20个OsCIPK基因至少被干旱、高盐、冷、PEG和ABA处理胁迫所诱导，并且大部分基因都被干旱或者高盐胁迫诱导，同时也受ABA诱导，而不受冷胁迫诱导。OsCIPK3、OsCIPK12和OsCIPK15基因过表达分析显示,它们提高了水稻对冷、干旱和高盐胁迫等方面的抗逆性，转OsCIPK12和OsCIPK15基因的植株被证实在处于胁迫状态下的脯氨酸和可溶性糖的积累比对照明显提高。

拟南芥中的AtCIPK14基因的表达受糖代谢的诱导,但不受甘露醇的诱导，说明该基因不受渗透胁迫的诱导。

孙涛等对小麦CIPK全基因家族进行了鉴定，共发现79个TaCIPK基因，归属为29个基因簇，并最终从这些基因簇中克隆到20个代表性的基因，系统分析了CIPK基因的组织特异性、逆境响应表达谱；分析了TaCIPK24在转基因拟南芥中对高盐胁迫响应中的作用。利用半定量RT-PCR技术分析了17个TaCIPK基因在ABA、GA、MeJA、ACC、低温、PEG、H₂O₂、NaCl和高温处理后小麦根和叶中表达模式，结果表明,不同的TaCIPK基因可以不同程度地对激素信号和非生物逆境胁迫进行响应。功能鉴定发现：通过测量了盐处理后转基因拟南芥植株中Na⁺和K⁺含量，K⁺含量在转基因和对照组中没有明显差异，而转基因植株明显比对照积累更少的Na⁺，TaCIPK24可能是通过激活拟南芥的SOS途径,促进排出更多的Na⁺从而减少过量Na⁺对拟南芥植株造成的损害，从而增强拟南芥转基因植株对高盐胁迫的耐受能力。进一步测定过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活力的结果显示，转基因植株可能还激活了过氧化物清除系统,从而降低高盐胁迫造成的氧化损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26。

本发明的再一目的在于提供编码上述植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26的基因。

本发明的再一目的在于提供包含植物抗旱、耐盐基因EeCIPK26的重组载体。

本发明的再一目的在于提供包含植物抗旱、耐盐基因EeCIPK26的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供植物抗旱、耐盐基因EeCIPK26的应用。

本发明的再一目的在于提供提高植物抗旱耐盐性的方法。

本发明所提供的抗旱耐盐蛋白EeCIPK26，来源于长穗偃麦草，其氨基酸序列如SEQID No.1所示：

本发明的蛋白激酶由481个氨基酸残基组成，是SnRK类蛋白激酶。自SEQ ID No.1的氨基末端第40-64位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQ ID No.1的第172-201位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。

本发明蛋白EeCIPK26的编码基因具有如SEQ ID No.2所示cDNA序列：

根据本发明具体实施方式的重组表达载体，包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。

使用EeCIPK26基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外还可使用增强子构建表达载体，如翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等。

本发明还提供含有EeCIPK26基因的重组菌株，为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

根据本发明具体实施方式的培育耐逆植物的方法是将含有EeCIPK26基因导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SnRK蛋白激酶EeCIPK26基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、长穗偃麦草、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以长穗偃麦草为实验材料，得到了抗旱、耐盐相关的EeCIPK26基因，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1显示T1代转基因拟南芥PCR检测结果，M：Trans2K Plus DNAmarker；1：阴性对照；2-13为转基因拟南芥株系；

图2显示EeCIPK26转基因拟南芥耐旱性鉴定情况，WT为野生型拟南芥；L1、L2转基因拟南芥株系；

图3为EeCIPK26转基因拟南芥耐盐性鉴定情况，WT为野生型拟南芥；L1、L2、L3、L4、L5为不同转基因拟南芥株系；

图4显示转EeCIPK26基因小麦材料筛盒抗旱鉴定情况；

图5显示转EeCIPK26基因小麦耐盐性鉴定情况。

具体实施方式

实施例1长穗偃麦草抗旱耐盐相关EeCIPK26基因的cDNA克隆

对生长30天左右的长穗偃麦草幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取长穗偃麦草总RNA。应用5’RACE试剂盒和3’RACE试剂盒获得EeCIPK26基因的全长序列，序列全长1446bp。

用Trizol提取长穗偃麦草幼苗的总RNA，用superscript II反转录酶反转录获得cDNA。设计引物P1和P2，以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-ATGGAGGATAGGAGGACGAT-3’，

P2：5’-TTACTCCTGTGGCTGCTGTGATGGCA-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.5kb左右的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的EeCIPK26基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至1446位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示EeCIPK26基因的重组载体命名为pTE-EeCIPK26。

EeCIPK26基因的序列在Genbank上进行比对，在长穗偃麦草中未发现同源蛋白基因，证明EeCIPK26基因是一个新的基因。

用引物P1和P2在长穗偃麦草基因组进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。

实施例2验证EeCIPK26基因增强植物的抗旱、耐盐性

1.重组表达载体的构建

以长穗偃麦草的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体p35S::EeCIPK26。

引物序列如下：

EeCIPK26[SmaI]5’-TCCCCCGGGGATGGAGGATAGGAGGACGAT-3’

EeCIPK26[SpeI]5’-GGACTAGT TTACTCCTGTGGCTGCTGTGATGGCA-3’

2、转基因拟南芥获得和功能鉴定

1)获得转基因拟南芥

将上述构建的重组表达载体p35S::EeCIPK26用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用p35S::EeCIPK26的根癌农杆菌EHA105转化拟南芥，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的引物为P3和P4：

P3(上游引物):5’-ATAACCAAGGGGAAGTTAAG-3’，

P4(下游引物):5’-TTGTGAACCTTGTCTCTTGA-3’。

对35S::EeCIPK26转基因拟南芥进行PCR鉴定，如图1所示，阳性转基因植株经PCR扩增可获得500bp左右条带，结果获得转35S::EeCIPK26拟南芥21株。

同时将pBI121空载体导入拟南芥，方法同上，作为对照，获得12个株系的转空载体拟南芥(筛选获得的转基因拟南芥用T3代表示)。

2)鉴定转基因拟南芥抗旱性

对转EeCIPK26基因表型干旱胁迫15天，复水，复水后第5天进行照相观察。

在干旱处理第10天时，野生型拟南芥和转基因拟南芥全部萎蔫。复水后第5天发现，如图2所示，野生型拟南芥涨势弱，叶片发黄，部分死亡，存活率为6％，转基因拟南芥L1、L2部分植株恢复了正常状态，存活率分别是70％，60％，存活率明显大于野生型拟南芥，表明转EeCIPK26基因显著提高了L1、L2转基因拟南芥株系的抗旱性。

3)鉴定转基因拟南芥耐盐性

将生长状况一致的转基因拟南芥和野生型同时浇250mM盐水进行盐胁迫处理。盐胁迫第20天后，复水，复水后第5天对转EeCIPK26基因表型进行照相观察。

如图3所示，野生型拟南芥出现大量死亡的现象，存活率仅为5％，L1、L2、L5的存活率较高，分别为60％，55％，65％。因此，EeCIPK26基因的过表达提高了L1、L2、L5转基因株系的耐盐性。

4)转基因小麦耐旱性鉴定

将Ubi::EeCIPK26转基因株系与对照植株播种筛盒，每个转基因株系播种10粒种子。在转基因株系及对照生长到三叶一心期进行干旱胁迫处理35天左右，复水处理10d后进行统计存活率。

如图4所示，第4、5行为对照株京冬18，其存活率仅为8％，在BK26-1(8/10，65％)、BK26-2(5/10，52％)、BK26-3(4/10，43％)、BK26-6(1/10，11％)、BK26-7(4/10，30％)、BK26-8(3/10，20％)转基因株系中，BK26-1、BK26-2、BK26-3、BK26-7转基因株系材料在胁迫处理过程中较对照京冬18相对较高，恢复速度较快，表现出对干旱胁迫较好的耐性。

5)转基因小麦耐盐性鉴定

通过田间取不同EeCIPK26转基因株系叶片，离体浸泡于200mM NaCl溶液中，25℃光照条件下胁迫处理7天，进行叶绿素含量测定。

如图5所示，对照叶片叶绿素含量明显减少，叶片发黄；而不同EeCIPK26转基因株系叶片叶绿素含量相对较高，其中，GT-1、GT-2、GT-4转基因株系叶绿素含量较高，叶绿素降解不明显，从而表现出对盐胁迫的耐性。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 植物抗旱、耐盐蛋白EeCIPK26及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 481

<212> PRT

<213> 长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)

<400> 1

Met Glu Asp Arg Arg Thr Ile Leu Met Asp Arg Tyr Glu Ile Gly Arg

1 5 10 15

His Leu Gly Gln Gly Asn Phe Ala Lys Val Tyr Tyr Gly Arg Asn Leu

20 25 30

Ala Ser Gly Gln Ala Val Ala Ile Lys Met Ile Asp Lys Glu Lys Val

35 40 45

Ser Arg Val Gly Leu Met Val Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Ile Met

50 55 60

Arg Leu Val Arg His Pro Asn Val Leu Lys Leu Phe Glu Val Met Ala

65 70 75 80

Ser Lys Ser Lys Ile Tyr Phe Val Leu Glu Tyr Ala Lys Gly Gly Glu

85 90 95

Leu Phe Asn Lys Ile Thr Lys Gly Lys Leu Ser Glu Asp Ala Ala Arg

100 105 110

Lys Tyr Phe His Gln Leu Ile Ser Ala Val Asp Tyr Cys His Ser Arg

115 120 125

Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu

130 135 140

Asn Glu Asn Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Ala Glu

145 150 155 160

Ser Thr Arg Gln Asp Gly Leu Leu His Thr Thr Cys Gly Thr Pro Ala

165 170 175

Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Lys

180 185 190

Ala Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe Val Leu Val Ala Gly

195 200 205

Phe Leu Pro Phe His Asp Thr Asn Leu Ile Glu Met Tyr Arg Lys Ile

210 215 220

Ser Arg Ala Asp Tyr Arg Cys Pro Arg Pro Phe Ser Val Glu Leu Lys

225 230 235 240

Asp Leu Leu Tyr Lys Ile Leu Asp Pro Asp Pro Ser Thr Arg Ala Ser

245 250 255

Val Ser Arg Ile Lys Arg Ser Ala Trp Tyr Arg Lys Pro Val Glu Val

260 265 270

Asn Gly Leu Arg Ile Lys Gln Glu Ser Arg Asp Lys Val His Lys Gly

275 280 285

Glu Pro Thr Thr Ser Glu Ser Thr Glu Gly Ser Asn Ser Glu Val Asn

290 295 300

Gln Glu Ala Ser Ser Ser Leu Thr Asn Leu Asn Ala Phe Asp Ile Ile

305 310 315 320

Ser Leu Ser Thr Gly Phe Asp Leu Ser Asn Leu Phe Glu Glu Lys Tyr

325 330 335

Gly Arg Arg Glu Val Arg Phe Thr Thr Arg Gln Pro Ala Glu Ala Ile

340 345 350

Phe Ala Lys Leu Asn Glu Val Ala Lys Lys Leu Lys Leu Lys Ile Lys

355 360 365

Lys Lys Glu Asn Gly Val Leu Lys Leu Ala Ala Pro Lys Glu Gly Met

370 375 380

Lys Gly Ile Leu Glu Phe Asp Ala Glu Val Phe Glu Phe Ala Pro Ser

385 390 395 400

Leu His Leu Val Glu Leu Lys Lys Thr Asn Gly Asp Thr Ile Glu Tyr

405 410 415

Lys Gln Leu Met Lys Asp Glu Ile Arg Pro Ala Leu Lys Asp Val Val

420 425 430

Trp Ala Trp Gln Gly Glu Ser His Pro Phe Pro Glu Lys Phe Ile Arg

435 440 445

Gly Glu Gln Gln Gln Ser Pro Leu Pro Ser Gln Gln Gln Gln Ser Pro

450 455 460

Leu Pro Ser Gln Gln Gln Gln Ser Pro Leu Pro Ser Gln Gln Pro Gln

465 470 475 480

Glu

<210> 2

<211> 1446

<212> DNA

<213> 长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)

<400> 2

atggaggata ggaggacgat tttgatggac cgttatgaaa tcgggaggca cttgggccaa 60

gggaactttg ccaaggtata ttatggtcgg aatctcgcaa gtggacaggc tgttgcgata 120

aagatgatcg ataaggagaa ggtgtcgagg gttgggctaa tggtgcagat aaagagggag 180

atctcaataa tgagattggt aaggcatccc aacgtcttga aacttttcga ggtaatggct 240

agcaagagca agatttactt tgttttggag tatgccaaag gtggagagct tttcaacaaa 300

ataaccaagg ggaagttaag tgaggatgct gcaaggaaat acttccatca gctcatcagt 360

gccgtggact actgccatag ccgaggtgtt tatcatcgcg acttgaagcc ggagaaccta 420

ctcctggatg agaatgaaaa ccttaaagtc tctgatttcg ggctaagtgc cctggccgag 480

tccacgagac aagatggcct cctccatacc acctgtggaa ctccagctta tgttgcccct 540

gaagtgctta gcaggagagg ctatgatggt gcgaaggctg acatatggtc ctgtggagta 600

attctatttg tgctggtggc tggtttcctt cctttccatg acacaaatct tatagagatg 660

tataggaaga tctccagggc tgactataga tgccctcgcc ctttttcagt tgagctgaag 720

gatctacttt acaagattct tgatccagat ccaagcacta gagcttctgt ttcaaggata 780

aagagaagcg cttggtacag gaaacccgtc gaggtaaatg gactgaggat taaacaagaa 840

tcaagagaca aggttcacaa aggtgaaccc acaacctctg aatcaacaga aggcagcaat 900

tcagaggtta accaagaagc gtcatcaagc ctcacaaact tgaatgcctt tgacataatt 960

tctctctcaa ctggatttga cctatccaat ttgttcgaag agaagtatgg ccggagggag 1020

gtcagattta ccactaggca gccagcagag gctatatttg ccaagctgaa tgaagtggcc 1080

aagaaattga agctcaaaat aaagaagaaa gaaaacggtg tcttgaaatt ggcagcacca 1140

aaggaaggaa tgaagggcat tcttgagttt gacgcagagg tttttgagtt tgcgccttct 1200

ttgcatttag ttgaattaaa gaagaccaat ggagacacta tagagtataa acaactgatg 1260

aaagatgaga taaggcccgc acttaaggat gtggtttggg cgtggcaagg cgagtcgcac 1320

ccgttccctg agaaatttat ccgaggagag cagcagcagt cacctttgcc atcgcagcag 1380

cagcagtcac ctttgccatc gcagcagcag caatcacctt tgccatcaca gcagccacag 1440

gagtaa 1446

Claims

1.植物抗旱、耐盐相关基因EeCIPK26，其特征在于，其编码植物抗旱、耐盐相关蛋白EeCIPK26，所述植物抗旱、耐盐相关蛋白EeCIPK26的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因EeCIPK26，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.植物抗旱、耐盐相关蛋白EeCIPK26，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.包含权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因EeCIPK26的重组表达载体。

5.包含权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因EeCIPK26的重组菌株。

6.权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因EeCIPK26用于提高植物抗旱、耐盐性的应用，其中，所述植物为小麦或拟南芥。

7.提高植物抗旱、耐盐性的方法，其特征在于，所述方法中包括向植物中转入权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因EeCIPK26的步骤，其中，所述植物为小麦或拟南芥。