CN113278056B

CN113278056B - 一种耐盐cin转录因子基因与应用

Info

Publication number: CN113278056B
Application number: CN202110465484.7A
Authority: CN
Inventors: 阴祖军; 叶武威; 陈修贵; 陆许可; 王帅; 王德龙; 赵兰杰
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113278056A

Abstract

本发明提供了一种CIN类TCP转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该CIN类TCP转录因子或编码基因可用于作物抗旱或耐盐品种育种。本发明提供的CIN类TCP转录因子来源于棉花(Gossypium spp)，转化拟南芥后能够表现出耐盐性，即能在高盐环境下正常生长，而野生型拟南芥无法正常生长。该基因为植物抗旱或耐盐改造提供了新的可能。

Description

一种耐盐CIN转录因子基因与应用

技术领域

本发明属于分子生物学与植物抗逆育种领域，具体涉及一种源于棉花的耐盐CIN转录因子基因与应用。

背景技术

棉花是重要的纤维和油料作物之一，是天然纤维和棉籽油的重要来源，是化工、国防工业的重要原材料。棉花具有较强耐盐性，被认为是盐碱地改良的先锋作物之一。

TEOSINTE BRANCHED 1, CYCLOIDEA and PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP)基因家族是高等植物特有的一类转录因子，参与细胞生长和增殖的调控，在植物生长发育的多个方面发挥着不同的功能。TCP基因家族分为CIN，PCF以及CYC/TB1亚家族。近两年的研究表明，TCP基因家族参与棉花各个阶段的生长发育，如参与棉花纤维发育、分枝发育等与经济产量相关的性状，而CIN类TCP蛋白能够调控棉酚腺体分化，EIN3类TCP蛋白可能正调控植物对盐胁迫的应答。

通过基因工程手段导入外源基因或内源相关基因的过表达可以提高植物耐盐性。因此，发现新的抗逆耐盐基因对作物抗逆耐盐改造具有重要意义。

发明内容

为了进一步丰富耐盐基因种类，本发明提供一种棉花CIN转录因子基因，该基因转入拟南芥后能够提高其耐盐性能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种CIN类TCP转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

一种上述CIN类TCP转录因子的编码基因。

优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

一种包含上述基因的重组载体、工程菌和细胞系。如包含上述基因的质粒、噬菌体、病毒或其他重组载体；包含上述基因的大肠杆菌、农杆菌、酵母菌或植物细胞系。

上述CIN类TCP转录因子或编码基因在作物抗逆育种中的应用。

所述抗逆是指抗旱或耐盐。

本发明具有以下优点：

本发明提供的CIN类TCP转录因子来源于棉花(Gossypiumspp)，转化拟南芥后能够表现出耐盐性，即能在高盐环境下正常生长，而野生型拟南芥无法正常生长。该基因为植物抗旱或耐盐改造提供了新的可能。

附图说明

图1为pBI121-35S::GhCIN质粒图谱；

图2为转GhCIN基因拟南芥PCR产物凝胶电泳图；

图3为转GhCIN基因和野生型拟南芥在含盐平板上的生长状况。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 GhCIN基因的获得

陆地棉TM-1种植于中国农业科学院棉花研究所试验地，按一般大田管理，取根、茎、叶、花瓣、胚珠等不同部位和发育时期的纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。棉花总RNA提取采用Aidlab biotechnologies 公司试剂盒，RNA反转录为cDNA采用TransGen Biotech反转录试剂盒，操作均按照说明书进行。

以上述cDNA为模板，以下表所述核苷酸序列为上下游引物进行PCR扩增：

扩增体系如下：

扩增反应如下：

将上述PCR扩增产物进行测序，获得的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，命名为GhCIN基因。

实施例2 含GhCIN基因的重组表达载体

将实施例1获得的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的PCR扩增产物利用In-Fusion连接技术连接入植物表达载体pBI121中，将上述PCR扩增产物和pBI121线性化载体按照下表所示体系配置：

50℃温育15 min，之后置于冰上，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆，测序验证序列的正确性。所得质粒为在pBI121载体的BamHI/SacI酶切位点中插入GhCIN外源基因片段，结果正确，将该质粒命名为pBI121-35S::GhCIN，其图谱如图1所示。

实施例3 含GhCIN基因的重组根癌农杆菌

利用冻融法将实施例2获得的pBI121-35S:GhCIN质粒转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：

取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；每100 µL感受态加入1 µg质粒，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5 min，液氮5 min，37℃水浴5 min，冰浴5 min；加入700 µL无抗生素的LB液体培养基，于28℃震荡培养2-3 h；6000 rpm离心1 min，留取100 µL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布与含有卡那（50 µg/mL）、利福平（25 µg/mL）双抗LB平板上，倒置于28℃培养箱培养48-72 h，抗性菌落可见。挑取单菌落在1mL的含有双抗的LB培养基培养16 h左右，直至浑浊；将菌落进行PCR和酶切鉴定，筛选出阳性农杆菌株。提取阳性重组菌的质粒送测序，将测序正确的含有质粒pBI121-35S::GhCIN的重组菌命名为LBA4404/pBI121-35S::GhCIN，-20℃保存备用。

实施例4 GhCIN基因的功能验证

1.转化拟南芥及转化鉴定

采用花序浸染法将实施例3中获得的重组根癌农杆菌LBA4404/ pBI121-35S::GhCIN转化拟南芥，具体步骤如下：将-20℃保存的农杆菌菌液20 µL接种到1mL LB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液1 mL加入到50 mL LB液体培养基28℃、180rpm振荡培养；待菌液呈橘黄色，OD₆₀₀值约为1.2-1.6时，5000 rpm离心菌液收集菌体；用含1/2 MS盐，5%蔗糖，pH=5.8的转化介质悬浮菌体，调整OD₆₀₀至0.8，然后加silwet-L-77（0.02%）OD至0.8开始浸染；将拟南芥花序置于转化介质中50 s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养24 h后置于正常条件下培养，5天后按照上述方法重新浸染一次，待成熟后，收获转基因T₀代种子。

转GhCIN基因拟南芥植株中GhCIN基因的检测，具体过程如下：将收获的种子晾干后，对种子进行消毒：酒精1 min、50%次氯酸钠10 min、灭菌水清洗5次，点于含卡那霉素的1/2MS上，4℃春化3天，后在（16 h白天/8 h黑暗，21°C）培养10-15天左右会观察到阳性、阴性植株区别，能够正常生长的可能为阳性株，移栽能够正常生长的拟南芥到培养室，生长至7-8片叶子时采集叶片用TransDirect Plant Tissue PCR Kit进行PCR，以LBA4404/pBI121-35S::GhCIN重组农杆菌菌液作为阳性对照，以ddH₂O为空白对照，野生型拟南芥DNA为阴性对照，所用引物序列为：

扩增体系如下：

扩增反应如下：

分别取扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测结果见图2，其中，1为2000bp MARKER，2为阳性对照，3为阴性对照，4为空白对照（ddH₂O），5-12为拟南芥阳性株。可见，选取的生长正常的转基因植株和阳性对照组中均可以检测到正确条带，而空白对照和野生型拟南芥阴性对照组中均未检测到相应的DNA分子片段，说明GhCIN基因已整合到上述拟南芥基因组中。

2.转GhCIN基因拟南芥植株的耐盐性鉴定

无菌条件下，把转GhCIN基因拟南芥T1代种子和野生型拟南芥（WT）种子杀菌后点播到含有100 mM NaCl 的MS固体培养基上，在4℃无光条件下春化2-3d，后置于培养箱中萌发培养2周左右，观察转GhCIN基因拟南芥和野生型拟南芥生长状况，结果如图3所示：在盐胁迫环境下，转GhCIN基因拟南芥和野生型拟南芥表型存在显著差异。转基因拟南芥表现出耐盐性，即能在高盐环境下正常生长，而野生型拟南芥无法正常生长或不长。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 一种耐盐CIN转录因子基因与应用

<130> 20201208

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> Gossypium spp

<400> 1

Met Glu Ile Asp Glu Ile Gln Thr Gln Gln Gly Ser Lys Phe Ser Arg

1 5 10 15

Val Gly Asn Gly Arg Ser Glu Ser Ser Arg Met Gly Gln Lys Gly Ser

20 25 30

Asp Asn Tyr Tyr Pro Asp Asp Glu Glu Gly Arg Glu Val Met Lys Arg

35 40 45

Ala Ser Ala Asn Gly Gly Gly Gly Asp Ala Leu Ala Asp Thr Ala Ala

50 55 60

Ala Asn Arg Leu Arg Gly Trp His His Ser Ser Arg Ile Ile Arg Val

65 70 75 80

Ser Arg Ala Ser Gly Gly Lys Asp Arg His Ser Lys Val Trp Thr Ser

85 90 95

Lys Gly Leu Arg Asp Arg Arg Val Arg Leu Ser Val Thr Thr Ala Ile

100 105 110

Gln Phe Tyr Asp Leu Gln Asp Arg Leu Gly Tyr Asp Gln Pro Ser Lys

115 120 125

Ala Ile Glu Trp Leu Ile Lys Ala Ala Ala Asp Ala Ile Ala Glu Leu

130 135 140

Pro Ser Leu Asn Thr Ser Phe Pro Asp Thr Pro Arg Gln Leu Ser Asp

145 150 155 160

Asp Gly Thr Glu Gln Gly Phe Asp Ser Ala Glu Val Glu Leu Asp Gly

165 170 175

Asp Pro Asn Asn Tyr Gln Gln Asn Gln Ser Gln Gln His Leu Ser Leu

180 185 190

Ser Lys Ser Ala Cys Ser Ser Thr Ser Glu Ile Ser Lys Asn Ser Gly

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Arg Ser Glu Asn Arg Val Lys Ala Arg Glu Arg Ala

210 215 220

Arg Gly Arg Val Ala Lys Glu Lys Gly Lys Glu Gln Lys Thr Asp Ile

225 230 235 240

Ala His Gln Gln Asn Val Asn Pro Ile Ser Gln Asn Ser Ser Phe Thr

245 250 255

Glu Leu Leu Thr Cys Gly Ile Gly Ser Val Ser Asn Lys His Thr Ser

260 265 270

Pro Ser Pro Thr Ala Ser Ala Arg Gln Asn Pro Arg Gln Trp Pro Val

275 280 285

Thr Gln Met Asp Tyr Phe Thr Met Gly Leu Leu Gly Pro Ser Ser Ser

290 295 300

Arg Asn Gln Ser Ser Gly Phe Pro Gly Gln Met Gln Gln Pro Gln Pro

305 310 315 320

Ile Leu Met Pro Pro Phe Thr Val Ser Gly Glu Ser Asn Gln Lys Leu

325 330 335

Gln His Phe Ser Phe Val Pro Asn Thr Asp His Met Ile Pro Val Ala

340 345 350

Thr Ala Gln Pro Val Leu Gly Ser Asp Tyr Asn Leu Asn Phe Ala Ile

355 360 365

Ser Ser Gly Ile Ala Gly Phe Asn Arg Gly Thr Leu Gln Ser Asn Ser

370 375 380

Pro Pro Phe Leu Pro His His Leu Gln Arg Phe Ser Phe Ile Glu Gly

385 390 395 400

Ser Pro Pro Val Glu Asn His His His His

405 410

<210> 2

<211> 1233

<212> DNA

<213> Gossypium spp

<400> 2

atggagatag atgagattca gacacaacaa ggttctaagt tctcaagagt tggtaatggg 60

agaagtgagt cgagcaggat gggtcagaaa ggtagtgaca actactaccc tgatgatgaa 120

gaaggtagag aggtcatgaa aagggctagt gcaaatggag gtggaggtga tgctctagct 180

gacaccgctg ctgctaatcg gcttcgaggc tggcaccatt cttcgagaat tattagggtt 240

tctcgagcct cgggtgggaa agatcggcac agcaaggttt ggacttcaaa agggttgagg 300

gataggaggg taaggttatc tgtcaccaca gctatacagt tttatgatct acaagaccgg 360

ttgggctatg atcagcctag taaagcaata gagtggctga ttaaagcagc tgctgatgca 420

attgcggagc ttccttcact taacacttca tttcctgata ccccaaggca attgagtgat 480

gatggaactg aacaagggtt tgactcggct gaagtagagt tagatggcga tccgaataat 540

taccaacaaa accaaagtca gcagcacctt tccttgtcca aatcagcttg cagtagcacg 600

tccgagatta gcaagaactc gggtttatcc ctttccaggt ctgagaaccg tgtaaaggcc 660

cgggaacggg caaggggaag agtagcaaaa gaaaagggga aagagcaaaa gactgacatt 720

gcacatcaac aaaatgtgaa ccccatttct caaaactctt ccttcactga gttactaacc 780

tgtggcattg gcagtgttag caacaaacac actagtccta gtcctacagc ttcagctcgt 840

caaaacccca ggcagtggcc tgtcactcaa atggattact ttacaatggg gctccttgga 900

ccttcttctt cgagaaacca atcttcaggg tttccaggac aaatgcaaca gccacaaccg 960

atactgatgc caccatttac tgtgtcgggt gaaagcaatc aaaagttgca gcatttttct 1020

tttgttccca acacggacca tatgatcccg gtggcaacag cacaaccggt gctagggagt 1080

gactacaacc tcaacttcgc aatctcttcc ggcattgctg gtttcaacag ggggaccctt 1140

cagtccaatt ctcctccttt tttgcctcat cacctccaga ggttttcttt tatagaggga 1200

tcaccaccag tggagaacca tcaccaccat tag 1233

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> In-GhCINF

<400> 3

gactctagag gatccatgga gatagatgag attcagac 38

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> In-GhCINR

<400> 4

ctaatggtgg tgatggttct gagctcgaat ttccc 35

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GhCINF

<400> 5

aagggtttga ctcggctgaa gtag 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GhCINR

<400> 6

cagtaaatgg tggcatcagt atcg 24

Claims

1.一种CIN类TCP转录因子在作物抗逆育种中的应用，其特征在于，所述CIN类TCP转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述抗逆是指耐盐。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CIN类TCP转录因子的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。