CN106749584B

CN106749584B - 一种与植物耐碱性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106749584B
Application number: CN201710196239.4A
Authority: CN
Inventors: 朱延明; 于洋; 丁晓东; 李强; 陈超; 段香波; 曹蕾
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN106749584A

Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用。本发明的蛋白质GsERF71，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：将该基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥在萌发期和成苗期对碱胁迫的耐性，说明该GsERF71蛋白可以为培育具有耐碱性的转基因植物的研究奠定基础。

Description

一种与植物耐碱性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用。

背景技术

我国盐碱地面积多达15亿亩，东北地区达5500余万亩，仅黑龙江省就高达2800余万亩。因此，盐碱逆境是制约我国农业生产的重大问题。如果能够开发利用这些广袤的盐碱地资源，对保证我国农业持续高效发展和粮食安全，具有重大的战略意义和现实意义，可创造巨大的经济效益、社会效益和生态效益。我国的盐碱地主要是碱性土壤，面积最大、造成的危害也最为严重，包括东北、华北、西北内陆等地区，其危害是在Na⁺引发离子毒害的基础上，还增加了由碳酸盐或碳酸氢盐等碱性盐引起的高pH值伤害及碳酸根离子和碳酸氢根离子本身造成的毒害。碱胁迫造成的混合性伤害能够直接作用于植物根系，改变细胞结构和膜稳定性，干扰跨膜电位的形成，造成根细胞功能及代谢紊乱。高pH环境会使土壤中多种金属离子Ca²⁺、Mg²⁺和Fe²⁺等离子发生沉淀，直接影响植物根系对于这些离子的吸收及利用，从而扰乱植物细胞内部的离子平衡，同时对植物的生长和光合作用产生不利影响。高pH值胁迫还能够导致植物根中生长素不正常的累积，造成主根的生长和伸长受到抑制。已有报道表明多种经济作物受到了由HCO₃ ^-引起的碱胁迫的严重伤害。综上所述，碱胁迫相比盐胁迫的作用机制更为复杂，对植物的生长发育，尤其是对直接接触土壤的植物根系造成的危害更大。因此，如何提高植物的耐盐碱性已成为现今科学研究的重点内容。目前，全世界提高盐碱地利用率的主要方法之一就是利用耐盐碱植物基因资源，挖掘出关键的耐盐碱基因，进而培育出具有较高耐盐碱能力的作物新品种。

相较于栽培大豆，野生大豆具备较强的抗逆性和对外界环境的适应性。野生大豆为一年生草本植物，在世界范围内的生长具有地域性特点，而在中国分布较为广泛。由于中国不同地区环境异质性差异较大，因此形成了适合在不同生态条件下生存的野生大豆群体。野生大豆基因资源应用结果显示，野生大豆不但能增加大豆的遗传多样性，应用于栽培大豆的育种程序，随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，野生大豆作为大量耐逆基因挖掘的供体还可以更加广泛地应用于作物育种过程中，发挥其更加重要的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物抗逆性相关蛋白。

本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为GsERF71，为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由300个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质GsERF71，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质GsERF71可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质GsERF71的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与GsERF71蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与GsERF71蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GsERF71蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GsERF71蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GsERF71蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由903个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsERF71的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GsERF71的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsERF71且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GsERF71的核酸分子的表达盒(GsERF71基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsERF71的DNA，该DNA不但可包括启动GsERF71转录的启动子，还可包括终止GsERF71转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GsERF71基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了GsERF71蛋白质或上述相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

上述应用中，所述调控为提高。

本发明还提供了GsERF71蛋白质或上述相关生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗碱胁迫。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中GsERF71蛋白质的活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中GsERF71蛋白质的活性的方法为在受体植物中过表达GsERF71蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将GsERF71蛋白质的编码基因导入受体植物；所述GsERF71蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，GsERF71蛋白的编码基因(即序列1所示的核苷酸)通过含有GsERF71蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71导入农杆菌LBA4404中。所述重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71为将序列1所示的DNA分子插入pCAMBIA2300载体的SmaI和XbaI酶切位点之间，且保持pCAMBIA 2300载体的其他序列不变得到的载体。所述重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71表达GsERF71蛋白。

上述方法中，所述抗逆性为抗碱胁迫；所述抗碱胁迫具体为抗NaHCO₃胁迫。

上述方法中，所述抗NaHCO₃胁迫具体体现为在不同浓度NaHCO₃胁迫的条件下：(1)转基因植物的展叶率高于受体植物；和/或，(2)转基因植物的根长长于受体植物；和/或，(3)转基因植物的叶绿素含量高于受体植物；和/或，(4)转基因植物的丙二醛含量低于受体植物；和/或，(5)转基因植物的碱胁迫相关基因的表达量高于受体植物；和/或，所述碱胁迫相关基因具体为H⁺-ATPase基因和/或COR47基因和/或KIN1基因和/或RD29A基因；和/或，所述NaHCO₃浓度为6mM、8mM、50mM和100mM。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsERF71基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明发现了一个野生大豆AP2/ERF转录因子家族基因GsERF71，该基因不仅能够响应碱胁迫应答还能提高植物的耐碱功能。对其进行组织定位分析，发现其在下胚轴及根尖中的表达量明显高于其他组织。将其瞬时表达于洋葱表皮细胞，发现其主要表达在细胞核中，进一步研究发现该蛋白具有自激活活性并且能够与DRE或GCC顺式作用元件特异性结合。本发明的实验证明，将该基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥在萌发期、幼苗期和成苗期对碱胁迫的耐性，说明该蛋白可以为培育具有耐碱性的转基因植物的研究奠定基础。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为野生大豆根和叶中GsERF71基因在50mM NaHCO₃(pH 8.5)和200mM NaCl处理下的表达模式。

图2为野生大豆不同组织中GsERF71基因的相对表达量。

图3为GsERF71基因的亚细胞定位分析。

图4为酵母细胞中GsERF71蛋白的转录激活活性分析。(A)为酵母载体pGBKT7-GsERF71构建的示意图；(B)为通过检测报告基因LacZ活性确定GsERF71蛋白转录激活活性；(C)为GsERF71蛋白不同缺失片段示意图；(D)为通过检测报告基因HIS活性确定GsERF71转录激活区；(E)为定量检测报告基因β－半乳糖苷酶的活性。

图5为在酵母细胞中GsERF71蛋白与DRE或GCC顺式作用元件的结合特性分析。a为用于酵母单杂交分析的DRE元件/突变，GCC box/突变序列示意图；b为酵母单杂交检测GsERF71与DRE元件或GCC box的结合特性。

图6为转GsERF71基因拟南芥植株分子鉴定。其中，#30和#32均为T₃代转GsERF71基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。

图7为转GsERF71基因拟南芥植株在6mM NaHCO₃和8mM NaHCO₃处理下的萌发期表型及展叶率统计分析。其中，#30和#32均为T₃代转GsERF71基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。a为野生型及超量表达拟南芥萌发期在碱胁迫下的表型；b为野生型及超量表达拟南芥幼苗在对照和处理条件下的生长情况；c为野生型及超量表达植株在正常情况下及6mM、8mMNaHCO₃处理下展叶率统计。

图8为转GsERF71基因拟南芥植株在6mM NaHCO₃处理下的幼苗期表型及根长统计分析。其中，#30和#32均为T₃代转GsERF71基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。a为野生型及GsERF71基因超表达拟南芥幼苗期在碱胁迫处理下的表型；b为野生型及GsERF71超量表达植株在碱胁迫处理下根长统计分析。

图9为转GsERF71基因拟南芥植株在100mM NaHCO₃处理下的成苗期表型分析。其中，#30和#32均为T₃代转GsERF71基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。a为野生型及超表达植株在碱胁迫处理16天后的表型分析；b为野生型及超表达植株在碱胁迫处理16天后叶绿素含量测定；c为野生型及超表达植株在碱胁迫处理16天后丙二醛含量测定。

图10为碱胁迫条件下野生型拟南芥及转基因拟南芥中胁迫响应Marker基因的表达量分析。其中，#30和#32均为T₃代转GsERF71基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值。

下述实施例中的野生大豆G07256在文献“Mingzhe Sun,Xiaoli Sun,Yang Zhao,Hua Cai,Chaoyue Zhao,Wei Ji,Huizi DuanMu,Yang Yu,Yanming Zhu.Ectopicexpression of GsPPCK3 and SCMRP in Medicago sativa enhances plant alkalinestress tolerance and methionine content.PLOS ONE 2014,9(2):e89578”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的pCAMBIA2300载体在文献“Ailin Liu,Yang Yu,Xiangbo Duan,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Yanming Zhu.GsSKP21,a Glycine soja Sphase kinaseassociated protein,mediates the regulation of plant alkaline tolerance andABA sensitivity.Plant Mol Biol(2015)87:111–124”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的农杆菌LBA4404在文献“Ailin Liu,Yang Yu,Xiangbo Duan,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Yanming Zhu.GsSKP21,a Glycine soja Sphase kinaseassociated protein,mediates the regulation of plant alkaline tolerance andABA sensitivity.Plant Mol Biol(2015)87:111–124”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109在“孙晓丽；段小红；才华；李勇；柏锡；纪巍；季佐军；朱延明。利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质。中国生物化学与分子生物学报，2010，26(11)1050-1058”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的pGBKT7载体在文献“Xiao Luo,Na Cui,Yanming Zhu,Lei Cao,Hong Zhai,Hua Cai,Wei Ji,Xuedong Wang,Dan Zhu,Yong Li,Xi Bai Over-expressionof GsZFP1,an ABA-responsive C2H2-type zinc finger protein lacking a QALGGHmotif,reduces ABA sensitivity and decreases stomata size.Journal of PlantPhysiology 169(12)；1192-1202”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的pBSK-35S-eGFP载体在文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,XiaodongDing,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,anovel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salttolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans5αChemically Competent cell是全式金公司公司的产品。

实施例1、大豆转录因子GsERF71基因的克隆

1、植物材料的处理

挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H₂SO₄中处理10min以去除泥膜，倒净浓H₂SO₄，用无菌水冲洗3-4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3d催芽，待芽长到约1-2cm时，将其转移到盛有霍格兰培养液的钵中，用太空棉固定，使芽浸入培养液中，并将其放置于人工气候箱中培养。待幼苗长至3周龄，取其根部3cm放入EP管中，置于-80℃保存。

2、RNA提取

采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)提取上述3周龄野生大豆幼苗的根的总RNA。

3、cDNA的获得

以上述总RNA为模板，反转录得到cDNA。

4、PCR扩增

以上述cDNA为模板，采用Primer-S和Primer-AS引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

Primer-KS：5’-ATGTGTGGCGGTGCCAT-3’(序列3)；

Primer-KAS：5’-CTAATCGAAACTCCAGAGAT-3’(序列4)。

PCR扩增体系(50μl)：cDNA 4μl，10×PS buffer(Mg²⁺)10μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Primer-KS 1μl，Primer-KAS 1μl，Prime Star DNA Polymerase(TaKaRa)0.5μl，ddH₂O29.5μl。

PCR扩增条件：98℃8min；98℃10s，60℃10s，72℃1min10s，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。

将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量略小于1Kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)回收PCR扩增产物，将其与pEASY-Blunt Zero载体(TRANSGEN BIOTECH)连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-Blunt Zero-GsERF71，并将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后送交测序。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为903bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并将序列1所示的基因命名为GsERF71基因，GsERF71基因编码序列表中序列2所示的蛋白质，将序列2所示的氨基酸序列命名为GsERF71蛋白。

实施例2、大豆转录因子GsERF71基因的表达特性分析

一、野生大豆根和叶中的GsERF71基因在碱胁迫处理下不同时间的表达模式分析

1、植物材料的处理

挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H₂SO₄中处理10min以去除泥膜，倒净浓H₂SO₄，用无菌水冲洗3-4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3d催芽，待芽长到约1-2cm时，移出，用霍格兰液体培养基进行水培。待野生大豆幼苗长至3周龄，分别在50mM NaHCO₃(pH8.5)和200mM NaCl条件下对野生大豆幼苗进行碱胁迫和盐胁迫处理，分别在0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h各个时间点选取3株野生大豆，剪取其根尖3cm和新的三出复叶作为待测组织样品，迅速放于液氮中冷冻，然后置于-80℃保存。并以未处理样品作为对照。

2、总RNA的提取和cDNA的获得

采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)分别提取上述步骤1获得的不同时间处理后的待测组织样品的总RNA；以获得总RNA为模板，反转录获得cDNA。

3、Real-time PCR

以上述cDNA为模板，采用Primer-qS和Primer-qAS引物，通过Real-time PCR对GsERF71基因进行表达量检测。引物序列如下所示：

Primer-qS：5’-GGAACGGTTATTTGGGTGGC-3’；

Primer-qAS：5’-TCGTGGATTGTCCATCATAGTACG-3’。

Real-time PCR反应的条件：95℃2min→[95℃15s→60℃30s]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。

Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以野生大豆GsGAPDH基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。内参基因引物序列如下所示：

GsGAPDH S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；

GsGAPDH AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。

结果如图1所示：在50mM NaHCO₃胁迫处理条件下GsERF71表达呈现先下调后上调再下降趋于平稳的趋势，在根中胁迫处理1h时达到最高值，约为未处理样品中GsERF71表达量的7倍，而在叶中胁迫处理6h时达到最高值，约为未处理样品中GsERF71表达量的4倍。在200mM NaCl胁迫处理条件下GsERF71的转录水平在野生大豆中也呈现先上升后下降的趋势，在根和叶中均在胁迫1h后达到最高值并逐渐恢复至正常表达水平。说明GsERF71基因的表达受碱胁迫和盐的诱导并参与植物响应盐、碱胁迫的信号传导通路。

二、野生大豆不同组织中GsERF71基因的相对表达量

1、植物材料的处理

挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H₂SO₄中处理10min以去除泥膜，倒净浓H₂SO₄，用无菌水冲洗3-4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3d催芽，待芽长到约1-2cm时，将其转移到盛有30％草炭土、70％普通土的育苗盆中于温室进行培养。待幼苗长至成熟期，迅速取野生大豆不同组织(包括幼叶、老叶、茎、花、种荚、下胚轴、根尖)，液氮冷冻后分别置于-80℃保存。

2、总RNA的提取和cDNA的获得

采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)分别提取上述野生大豆不同组织(包括幼叶、老叶、茎、花、种荚、下胚轴、根尖)的总RNA；以总RNA为模板，反转录获得cDNA。

3、Real-time PCR

Primer-qS：5’-GGAACGGTTATTTGGGTGGC-3’；

Primer-qAS：5’-TCGTGGATTGTCCATCATAGTACG-3’。

GsGAPDH S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；

GsGAPDH AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。

结果如图2所示：GsERF71基因主要在野生大豆的营养组织中有所表达，且在下胚轴及根尖中表达量相对较高，约为新叶中的100-200倍。表明GsERF71基因主要参与野生大豆生长发育过程，尤其是根的生长发育或根部的营养物质及离子吸收转运过程。

实施例3、基因枪轰击介导的GsERF71基因瞬时表达与目的蛋白的亚细胞定位分析

1、亚细胞定位载体的构建

以野生大豆总cDNA为模板，采用GsERF71-YS和GsERF71-YAS引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsERF71基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列，其左侧为保护碱基)：

GsERF71-YS：5'-CCGCTCGAGATGTGTGGCGGTGCCATCATC-3'；

GsERF71-YAS：5'-GCTCTAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCAACC-3'。

PCR扩增体系：20μL 5×PrimeSTAR^TM HS PCR缓冲液，8μL dNTP mix(A、G、T、C、各2.5mM)，2μL上下游引物(10μM)，1μL稀释100倍(含目的基因的质粒)的通用模板，1μL高保真酶[PrimeSTAR DNA Polymerase(TaKaRa)]，无菌ddH₂O补足体积(总体积100μL)。

PCR反应条件：98℃8min；98℃10s，62℃10s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。

用XhoI和XbaI限制性内切酶对上述PCR扩增产物和pBSK-35S-eGFP载体进行双酶切，连接，得到含GsERF71基因的亚细胞定位载体。对含GsERF71基因的亚细胞定位载体进行测序验证表明：含GsERF71基因的亚细胞定位载体为将pBSK-35S-eGFP载体的BamH I和SpeI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF71基因，且保持pBSK-35S-eGFP载体的其他序列不变得到的载体。

2、基因枪轰击介导的GsERF71基因瞬时表达

采用基因枪法将上述含GsERF71基因的亚细胞定位载体轰击洋葱表皮细胞(具体方法参见美国Bio-Rad伯乐Helios基因枪系统说明书)，以pBSK-35S-eGFP空载体为阳性对照，剪取轰击过含GsERF71基因的亚细胞定位载体和空载体的洋葱表皮细胞，装片，利用激光共聚焦显微镜下观察。

结果如图3所示：GFP阳性对照在细胞内的整个区域都有表达，整个细胞均能够检测到绿色荧光信号，而GsERF71都主要定位在细胞核中。

实施例4、野生大豆转录因子GsERF71蛋白的转录激活活性分析

1、GsERF71基因的获得

以pEASY-GsERF71质粒为模板，采用GsERF71-BD S和GsERF71-BD AS引物进行PCR扩增，得到大小为903bp的PCR扩增产物，即为GsERF71基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsERF71-BD S：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；

GsERF71-BD AS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCAACC-3'。

2、重组载体pGBKT7-GsERF71的构建

用限制性内切酶BamH Ⅰ和Pst I分别对pGBKT7载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGBKT7-GsERF71重组载体，重组载体的结构图如图4A所示，对pGBKT7-GsERF71重组载体进行测序验证。

测序结果表明：pGBKT7-GsERF71重组载体为将pGBKT7载体的BamH Ⅰ和Pst I酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF71基因，且保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体。pGBKT7-GsERF71重组载体表达GsERF71蛋白。

3、表达目的蛋白GsERF71的酵母菌的获得

将pGBKT7-GsERF71重组载体转化酵母菌AH109，得到含质粒pGBKT7-GsERF71的酵母菌AH109，酵母感受态细胞的制备(LiAc法)及小量LiAc/PEG法转化酵母感受态细胞的具体步骤参见《分子克隆实验指南》第三版及Clontech Yeast Protocols Handbook。

4、报告基因β-半乳糖苷酶活性检测

将含质粒pGBKT7-GsERF71的酵母菌AH109用接种环在SD/-Trp固体培养基上划线，以转录因子pGBKT7-AtDREB为阳性对照，以pGBKT7空载体为阴性对照，30℃培养3天后，将菌体影印到滤纸上，进行β-半乳糖苷酶活性检测。

GsERF71蛋白转录激活活性分析结果如图4B所示：阴性对照不能使底物变蓝，阳性对照和含pGBKT7-GsERF71的基因酵母菌AH109都能使底物变蓝，说明报告基因β-半乳糖苷酶表达，GsERF71基因所表达蛋白具有自激活功能，这与其家族中大部分成员都具备转录激活活性是一致的。

5、GsERF71蛋白不同缺失片段的酵母表达载体构建

本研究还分别设计了四对引物对GsERF71蛋白的不同区域进行扩增，构建了含有GsERF71蛋白不同片段的重组载体。具体构建方法如下：

(1)以pEASY-GsERF71质粒为模板，分别采用如下四对引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，即为GsERF71蛋白的不同区域的编码基因(如图4C所示)。引物设计如下：

GsERF71-BD(1-74)S：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；

GsERF71-BD(1-74)AS：5'-AAAACTGCAGAGATTCTTCCTCTGCCTCTTCACC-3'；

GsERF71-BD(1-131)S：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；

GsERF71-BD(1-131)AS：5'-AAAACTGCAGCGGGGAAATTCACCTTAGCCTTTTT-3'；

GsERF71-BD(74-300)S：5'-CGCGGATCCGTTACAGAGGGATTCGGCAGCG-3'；

GsERF71-BD(74-300)AS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCA-3'；

GsERF71-BD(131-300)S：5'-CGCGGATCCGTAACGAGGACGACGAATATTCC-3'；

GsERF71-BD(131-300)AS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCA-3'；

GsERF71-BD(71-141)S：5'-CGCGGATCCGTAGGAAGAATCTCTACAGAGGGATTC-3'；

GsERF71-BD(71-141)AS：5'-AAAACTGCAGCTTGAATGGAATATTCGTCGTCC-3'。

(2)用限制性内切酶BamHⅠ和Pst I分别对pGBKT7载体和上述各个PCR扩增产物进行双酶切，连接，分别得到如下含有GsERF71蛋白不同片段的重组载体：pGBKT7-GsERF71(1-74)重组载体、pGBKT7-GsERF71(1-131)重组载体、pGBKT7-GsERF71(74-300)重组载体、pGBKT7-GsERF71(131-300)重组载体、pGBKT7-GsERF71(71-141)重组载体。

pGBKT7-GsERF71(1-74)重组载体表达序列2第1-74位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(1-131)重组载体表达序列2第1-131位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(74-300)重组载体表达序列2第74-300位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(131-300)重组载体表达序列2第131-300位氨基酸所示的蛋白；pGBKT7-GsERF71(71-141)重组载体表达序列2第71-141位氨基酸所示的蛋白。

6、GsERF71蛋白转录激活区域分析

采用上述步骤3中的方法，分别将获得含有GsERF71蛋白不同片段的重组载体导入酵母菌AH09中，通过检测报告基因HIS和LacZ的活性进一步分析GsERF71的转录激活区。将含有GsERF71蛋白不同片段的重组载体的酵母菌AH109以点点的方式接种在SD/-Trp/-His固体培养基上，以转录因子pGBKT7-AtDREB为阳性对照，以pGBKT7空载体为阴性对照，30℃培养3天检测报告基因HIS的活性。

结果如图4D所示：阴性对照不能在双缺的培养基上生长，阳性对照和含pGBKT7-GsERF71以及pGBKT7-GsERF71(74-300)和pGBKT7-GsERF71(131-300)重组载体的酵母菌都能在双缺的培养基上生长，加入30mM 3AT也没有抑制其生长，说明在这些菌种中报告基因HIS表达。采用ONPG法定量检测报告基因β-半乳糖苷酶活性，结果如图4E所示。综上，GsERF71蛋白第131-300位氨基酸含有GsERF71蛋白发挥转录激活功能必不可少的区域。

实施例5、GsERF71与DRE或GCC元件的结合特异性分析

1、DRE或GCC元件载体和突变载体的构建

1)DRE或GCC元件载体构建

A、DRE元件载体构建

人工设计合成DRE顺式作用元件，序列如下：

DRE sense：5'-AATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATGAGCT-3'；

DRE anti-sense：5'-CATGTCGGTAATGTCGGTAATGTCGGTAG-3'；

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(DRE sense：5'-AATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATGAGCT-3')和反义链寡核苷酸(DRE anti-sense：5'-CATGTCGGTAATGTCGGTAATGTCGGTAG-3')配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到DRE顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体(Clontech,Version No.PR732190)上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5’端为EcoR I，3’端为Sac I。然后将1μL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoR I和Sac I酶切后的pHIS2载体和DRE顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入1μL T4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定并测序获得含有DRE顺式作用元件的载体pHIS2.1-DRE。

B、DRE元件载体构建

人工设计合成GCC顺式作用元件的序列设计如下：

GCC sense：5'-AATTCTAGCCGCCGAGCCGCCGAGCCGCCGAGCT-3'；

GCC anti-sense：5'-CGGCGGCTCGGCGGCTCGGCGGCTAG-3'。

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(GCC sense：5'-AATTCTAGCCGCCGAGCCGCCGAGCCGCCGAGCT-3')和反义链寡核苷酸(GCC anti-sense：5'-CGGCGGCTCGGCGGCTCGGCGGCTAG-3')配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到GCC顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5’端为EcoR I，3’端为Sac I。然后将1μL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoRI和Sac I酶切后的pHIS2载体和GCC顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入1μLT4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定并测序获得含有GCC顺式作用元件的载体pHIS2.1-GCC。

2)DRE或GCC元件突变体载体的构建

C、DRE元件突变载体构建

以DRE顺式元件ACTCCG为基础，设计突变元件，即将TACCGACAT中的第3位和第4位C突变为A。同样，根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5’端为EcoR I，3’端为Sac I。人工设计合成的突变DRE顺式作用元件，序列如下：

mDRE sense：5'-AATTCTATTGACATTATTGACATTATTGACATGAGCT-3'；

mDRE anti-sense：5'-CATGTCAATAATGTCAATAATGTCAATAG-3'。

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(mDRE sense：5'-AATTCTATTGACATTATTGACATTATTGACATGAGCT-3')和反义链寡核苷酸(mDRE anti-sense：5'-CATGTCAATAATGTCAATAATGTCAATAG-3')配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到mDRE顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5’端为EcoR I，3’端为Sac I。然后将1μL T4DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoRI和Sac I酶切后的pHIS2载体和mDRE顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入1μLT4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定并测序获得含有DRE顺式作用元件的载体pHIS2.1-mDRE。

D、GCC元件突变载体构建

将GCC元件保守序列AGCCGCC的第二位G突变为A，突变体的序列设计如下：

mGCC sense：5'-AATTCTAACCGCCGAACCGCCGAACCGCCGAGCT-3'；

mGCC anti-sense：5'-CGGCGGTTCGGCGGTTCGGCGGTTAG-3'。

用双蒸水分别将人工合成的靶序列正义链寡核苷酸(mGCC sense：5'-AATTCTAACCGCCGAACCGCCGAACCGCCGAGCT-3')和反义链寡核苷酸(mGCC anti-sense：5'-CGGCGGTTCGGCGGTTCGGCGGTTAG-3')配制成10μM的溶液，分别吸取5μL的靶序列正义链寡核苷酸和反义链寡核苷酸溶液在200μL离心管中，吹打混匀，94℃变性5min，然后缓慢冷却至室温，得到mGCC顺式作用元件片段。

根据pHIS2.1载体上多克隆酶切位点，在串联三联体两端加入酶切位点，5’端为EcoR I，3’端为Sac I。然后将1μL T4 DNA Ligase Buffer加入一个灭菌的EP管中，加入EcoR I和Sac I酶切后的pHIS2载体和mGCC顺式作用元件片段，使摩尔比为1:3，室温下加入1μL T4DNA连接酶，最后加水补足体积至10μL。轻弹外壁混匀，短暂快速离心，16℃孵育过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定并测序获得含有GCC顺式作用元件的载体pHIS2.1-mGCC。

2、pGADT7-GsERF71酵母表达载体的构建

以pEASY-GsERF71质粒为模板，采用GsERF71-AD S和GsERF71-AD AS引物进行PCR扩增，得到903bp的PCR扩增产物，即为GsERF71基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：

GsERF71-AD S：5'-CGCGGATCCATATGTGTGGCGGTGCCATCAT-3'；

GsERF71-AD AS：5'-AAAACTGCAGAATCGAAACTCCAGAGATCCCCAACC-3'。

用限制性内切酶BamHⅠ和Pst I分别对pGADT7载体(Clontech，VersionNo.PR732196)和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGADT7-GsERF71重组载体，并对重组载体进行测序验证。

3、空载体pGADT7/pHIS2.1的3-AT浓度的选择

采用LiAc法制备酵母感受态细胞，并用小量LiAc/PEG法将空载体pGADT7和pHIS2.1共转化酵母感受态，得到重组酵母pGADT7/pHIS2.1，将转化子分别接种到含不同浓度的3-AT浓度的SD/-Leu/-Trp/-His的平板培养基上30℃培养2-3天。发现重组酵母在含有0mM、10mM、30mM 3-AT的SD/-Trp/-His固体培养基上可以生长出一些菌落，而在50mM 3-AT的SD/-Trp/-His固体培养基上只能长出几个菌落，在70mM 3-AT的SD/-Trp/-His固体培养基上则不能生长。由于过高的3-AT会抑制或杀死刚转化的酵母细胞，因此，将50mM的3-AT浓度作为抑制酵母HIS渗漏表达的最适浓度。

4、GsERF71在酵母细胞内与DRE或GCC元件的结合特异性分析

将重组载体pGADT7-GsERF71分别与含有不同顺式作用元件的载体pHIS2.1-DRE、pHIS2.1-mDRE、pHIS2.1-GCC或pHIS2.1-mGCC及空载体pHIS2.1共转化酵母菌株AH109，分别得到重组酵母GsERF71/DRE、GsERF71/mDRE、GsERF71/GCC、GsERF71/mGCC和GsERF71/pHIS2.1。分别将重组酵母pGADT7/pHIS2.1、GsERF71/pHIS2.1、GsERF71/DRE、GsERF71/mDRE、GsERF71/GCC和GsERF71/mGCC在含50mM 3-AT的SD/-Leu/-Trp/-His平板上划线，30℃培养3-7d。

结果如图5b所示，只有含有GsERF71蛋白和正常的DRE或GCC元件的重组酵母能够正常生长，而其余重组酵母生长都受到明显抑制。该结果表明GsERF71在酵母体内能够特异性结合DRE或GCC元件，从而激活报告基因HIS的表达。

实施例6、转GsERF71拟南芥植株的获得及在其碱胁迫下的表型分析

一、转GsERF71拟南芥植株的获得

1、GsERF71基因的获得

以实施例1中的步骤4得到的pEASY-Blunt Zero-GsERF71为模板，采用引物Primer-ES和Primer-EAS进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsERF71基因。引物序列如下：

Primer-ES：5’-TTACCCGGGATGTGTGGCGGTGCCAT-3’；

Primer-EAS：5’-CCGTCTAGACTAATCGAAACTCCAGAGAT-3’。

PCR扩增体系(10μl)：模板1μl，buffer 1μl，dNTP Mixture(2.5mM)0.4μl，Primer-UA0.5μl，Primer-UAS 0.5μl，PfuCx DNA Polymerase(TaKaRa)0.2μl，ddH₂O 6.4μl。

PCR扩增条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。

2、植物表达载体的获得

用限制性内切酶SmaI和XbaI对pCAMBIA 2300载体和上述PCR扩增产物进行酶切，连接，得到重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71。并对其进行测序验证。

测序结果表明：重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71为将pCAMBIA 2300载体的SmaI和XbaI酶切位点之间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF71基因，且保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体。重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71表达序列2所示的GsERF71蛋白质。

3、转化

采用冻融法将重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71转化至根癌农杆菌LBA4404中，经PCR鉴定得到阳性转化子(含有序列表中序列1所示的GsERF71基因的转化子)，用于侵染拟南芥植株。

4、转GsERF71拟南芥的获得

将含有重组载体pCAMBIA 2300-GsERF71的农杆菌通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)，将侵染过的拟南芥进行培养，得到T₀代转GsERF71拟南芥种子。将T₀代转GsERF71拟南芥种子表面消毒后，播种于含25mg/L固杀草(glufosinate-ammonium，Sigma，45520)的1/2MS培养基上筛选，得到T₁代转GsERF71拟南芥幼苗。如此重复，直至得到T₃代转GsERF71拟南芥纯合体株系。

提取T₃代转GsERF71拟南芥幼苗的总RNA进行RT-PCR鉴定。具体步骤如下：

提取T₃代转GsERF71拟南芥幼苗的总RNA，反转录得到cDNA；以cDNA为模板，分别采用Primer-qS和Primer-qAS引物对和Actin S和Actin AS引物对，通过RT-PCR对GsERF71基因进行表达量检测，得到PCR扩增产物。引物序列如下所示：

Primer-qS：5'-GGAACGGTTATTTGGGTGGC-3'；

Primer-qAS：5'-TCGTGGATTGTCCATCATAGTACG-3'；

Actin S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；

Actin AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。

PCR扩增体系：5μL 2×Easy Taq DNA Polymerase，0.8μL上下游引物(10μM)，1μL稀释100倍的cDNA，无菌ddH₂O补足体积(总体积10μL)。

PCR扩增条件：

GsERF71：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×30→72℃10min→4℃终止反应；

Actin 2：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×28→72℃10min→4℃终止反应。

将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图6所示：野生型拟南芥植株的RT-PCR无扩增产物，而T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32均可以扩增出目的条带，表明外源基因GsERF71基因不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。选取T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32用于下一步的表型分析。

三、转GsERF71拟南芥植株在碱胁迫下的表型分析

1、转GsERF71拟南芥在碱处理下的萌发期表型及存活率

选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)、T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32种子，用5％次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，一部分播种于正常培养基，观察表型并统计存活率；一部分播种于含有6mM NaHCO₃的1/2MS固体培养基和含有8mM NaHCO₃的1/2MS固体培养基上，每天观察表型并统计存活率，七天后统计展叶率。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系播种90粒种子。

结果如图7所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，control)，转GsERF71拟南芥与野生型拟南芥种子的萌发状态无显著差异，说明导入的GsERF71基因并未对拟南芥萌发期的生长、发育造成影响；在6mM NaHCO₃和8mM NaHCO₃胁迫下，转GsERF71拟南芥与野生型拟南芥的萌发都受到抑制，在种子萌发速率的统计结果中无显著差异，但T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32的展叶率明显高于野生型拟南芥，转GsERF71拟南芥生长受抑制的程度明显比野生型小。

2、转GsERF71拟南芥在碱处理下的幼苗期表型及根长统计

选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)、T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32种子，用5％次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，播种于1/2MS固体培养基上。1周后，挑选长势一致的转GsERF71拟南芥和野生型拟南芥幼苗水平摆放于6mM NaHCO₃胁迫培养基的平皿中，竖直生长，12d后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势及根长，所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系15株。

结果如图8所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，control)，T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32与野生型拟南芥的生长发育并没有显著差异，表明导入的GsERF71基因并未在幼苗期对拟南芥的生长、发育造成影响；在NaHCO₃胁迫处理条件下，转GsERF71拟南芥与野生型拟南芥的生长都受到了抑制，但在6mMNaHCO₃处理下，野生型生长抑制更明显，转GsERF71拟南芥的根长显著长于野生型。因此超量表达GsERF71基因提高了拟南芥在幼苗期对碱胁迫的耐性。

3、转GsERF71拟南芥在100mM NaHCO₃处理下的成苗期表型

选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)、T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32种子，4℃春化3d后，播种于营养钵中(营养土，君子兰土，蛭石按1：1：1混合)，置于温室中培养(22℃，光照16h/d)。3周后，对于碱处理的苗每2-3d浇灌一次100mM NaHCO₃溶液。16d后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势，并测定处理组和非处理组叶绿素及丙二醛含量(检测方法参见文献“植物生理实验/郝再彬等主编哈尔滨工业大学出版社，2004.9”)。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系40株。

100mM NaHCO₃处理下转GsERF71拟南芥与野生型拟南芥的长势情况如图9a所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，处理前)，T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32与野生型拟南芥的成苗生长发育情况并没有显著差异，表明导入的GsERF71基因并未在成苗期对拟南芥的生长、发育造成影响；对于浇灌100mM NaHCO₃溶液的成苗，野生型大部分叶片发黄、卷曲最终死亡，但转GsERF71拟南芥叶片发生轻度萎蔫，基本都完全存活并开始生殖生长，且转GsERF71拟南芥的存活率明显高于野生型。

100mM NaHCO₃处理下转GsERF71拟南芥与野生型拟南芥的叶绿素含量及丙二醛含量测定结果如图9b和9c所示：由图9可见，在浇灌100mM NaHCO₃溶液情况下，野生型叶片失绿程度要大于转基因拟南芥，通过测定叶绿素含量可知，在胁迫处理下野生型与转基因植株叶绿素含量都有所下降，但野生型的降低幅度明显比转基因株系要大，说明野生型植株的光合系统受到的伤害程度更大；丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物之一，其含量可以反映植物遭受伤害的程度，如图9所示，碱胁迫处理后，野生型与转基因植株的MDA含量均有所上升，说明所有植株均受到不同程度碱胁迫的伤害，但是与野生型相比，转GsERF71的拟南芥MDA含量上升的幅度显著低于野生型，说明其膜脂氧化程度较低，受到胁迫的伤害较轻。成苗期碱胁迫实验说明GsERF71基因可以正向调节拟南芥的耐碱性。

4、转GsERF71拟南芥植株中胁迫相关Marker基因的表达模式分析

1)植物材料的处理

选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32种子，用5％次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，播种于1/2MS固体培养基上。10天后，挑选长势一致的T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30、T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32和野生型拟南芥幼苗进行50mM NaHCO₃胁迫处理，分别在处理0h、6h、12h时间点取材作为待测样品，每个株系每个时间点取三株植株作为三次生物学重复。迅速放于液氮中冷冻，然后置于-80℃保存。

2)总RNA的提取和cDNA的获得

采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)分别提取上述步骤获得的不同时间处理后的待测组织样品的总RNA；以获得总RNA为模板，反转录获得cDNA。

3)Real-time PCR

以上述cDNA为模板，通过Real-time PCR分析了胁迫信号通路中可能起关键作用的marker基因包括碱胁迫相关基因H⁺-Ppase、NADP-ME、H⁺-ATPase和非生物胁迫应答基因COR47、KIN1、RD29A在野生型植株及转GsERF71拟南芥植株中的表达量。引物序列如下所示：

NADP-ME S：5'-TGGTCTGATCTACCCGCCATT-3'；

NADP-ME AS：5'-CGCCAATCCGAGGTCATAGG-3'；

H⁺-Ppase S：5'-ATGACGATGATGAAGAAGAAGAAGAT-3'；

H⁺-Ppase AS：5'-TTTTTTAACCACCTACGGTAAACG-3'；

H⁺-ATPase S：5'-GGCAGCCCTCTACCTACAAGTC-3'；

H⁺-ATPase AS：5'-AGCAATCATAAAAGCACCCAAT-3'；

COR47S：5'-GGAGTACAAGAACAACGTTCCCGA-3'；

COR47AS：5'-TGTCGTCGCTGGTGATTCCTCT-3'；

RD29A S：5'-ATGATGACGAGCTAGAACCTGAA-3'；

RD29A AS：5'-GTAATCGGAAGACACGACAGG-3'；

KIN1S：5'-AACAAGAATGCCTTCCAAGC-3'；

KIN1AS：5'-CGCATCCGATACACTCTTTCC-3'。

Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以拟南芥Actin基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。内参基因引物序列如下所示：

Actin S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；

Actin AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。

结果如图10所示：在T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#30和T₃代转GsERF71拟南芥纯合株系#32中H⁺-ATPase基因、COR47基因、KIN1基因和RD29A基因都能被碱胁迫显著诱导表达，然而在野生型中表达量则显著低于超量表达植株。以上结果表明GsERF71基因的超量表达能够促进胁迫应答基因的表达，从而抵抗碱胁迫。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用

<160>4

<210>1

<211>903bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgtgtggcg gtgccatcat cgctgacttc ataccccgcc gtgtaggccg ccgcctcacg 60

gcctccgagc tctggccaaa ctccttcggc aaagacgatg actttgactt ggattactcc 120

cacatggcta cccaacaacc ctccactctc aaaaggtccc aacctcccaa agttagcgag 180

caggttgaga ataagccggt gaagaggcag aggaagaatc tctacagagg gattcggcag 240

cgtccgtggg gcaaatgggc cgcggagatt cgcgatccta gaaaaggggt tcgtgtctgg 300

ttgggcacct ttaacaccgc agaagaagcc gcgagagcct acgatcgtga agctcgaaaa 360

atccgaggca aaaaggctaa ggtgaatttc cccaacgagg acgacgaata ttccattcaa 420

gctcgtaatc caattctacc ccttcctttc gctccacaac accctcccct gtaccagcaa 480

cagtaccgtt gcgatctcaa caatgcccct aaaaatctca actttgagtt cggttacgac 540

ctgaaccacg cggaggcgtt tccatcccgc gtggacgccg tcaacgctga ctcggtggtt 600

gtctccgttg atgaaaattc ggggtcagcg tcgggttcag agggtgctta ttcgacaacg 660

gagttcatgg ggtccgttca gaacgggaac ggttatttgg gtggtacggt aatggagaag 720

aaggagaaag agacagaggt tattgaagct gaagaagaaa agaacgaagt gctggagctt 780

tctgaggagc tgatggcgta cgaaaattac atgaagtttt atcagattcc gtactatgat 840

ggacaatcca cgacgaataa tgttcaggaa agcttggttg gggatctctg gagtttcgat 900

tag 903

<210>2

<211>300

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ala Asp Phe Ile Pro Arg Arg Val Gly

1 5 10 15

Arg Arg Leu Thr Ala Ser Glu Leu Trp Pro Asn Ser Phe Gly Lys Asp

20 25 30

Asp Asp Phe Asp Leu Asp Tyr Ser His Met Ala Thr Gln Gln Pro Ser

35 40 45

Thr Leu Lys Arg Ser Gln Pro Pro Lys Val Ser Glu Gln Val Glu Asn

50 55 60

Lys Pro Val Lys Arg Gln Arg Lys Asn Leu Tyr Arg Gly Ile Arg Gln

65 70 75 80

Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Arg Lys Gly

85 90 95

Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg

100 105 110

Ala Tyr Asp Arg Glu Ala Arg Lys Ile Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val

115 120 125

Asn Phe Pro Asn Glu Asp Asp Glu Tyr Ser Ile Gln Ala Arg Asn Pro

130 135 140

Ile Leu Pro Leu Pro Phe Ala Pro Gln His Pro Pro Leu Tyr Gln Gln

145 150 155 160

Gln Tyr Arg Cys Asp Leu Asn Asn Ala Pro Lys Asn Leu Asn Phe Glu

165 170 175

Phe Gly Tyr Asp Leu Asn His Ala Glu Ala Phe Pro Ser Arg Val Asp

180 185 190

Ala Val Asn Ala Asp Ser Val Val Val Ser Val Asp Glu Asn Ser Gly

195 200 205

Ser Ala Ser Gly Ser Glu Gly Ala Tyr Ser Thr Thr Glu Phe Met Gly

210 215 220

Ser Val Gln Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Gly Gly Thr Val Met Glu Lys

225 230 235 240

Lys Glu Lys Glu Thr Glu Val Ile Glu Ala Glu Glu Glu Lys Asn Glu

245 250 255

Val Leu Glu Leu Ser Glu Glu Leu Met Ala Tyr Glu Asn Tyr Met Lys

260 265 270

Phe Tyr Gln Ile Pro Tyr Tyr Asp Gly Gln Ser Thr Thr Asn Asn Val

275 280 285

Gln Glu Ser Leu Val Gly Asp Leu Trp Ser Phe Asp

　　290 295 300

<210>3

<211>17bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atgtgtggcg gtgccat 17

<210>4

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ctaatcgaaa ctccagagat 20

Claims

1.如下任一相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用；所述抗逆性为抗碱胁迫；

1）蛋白质，氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）编码1）所述的蛋白质的核酸分子；

3）含有2）所述核酸分子的表达盒；

4）含有2）所述核酸分子的重组载体；

5）含有3）所述表达盒的重组载体；

6）含有2）所述核酸分子的重组微生物；

7）含有3）所述表达盒的重组微生物；

8）含有4）所述重组载体的重组微生物；

9）含有5）所述重组载体的重组微生物。

2.如下任一相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用；所述抗逆性为抗碱胁迫；

1）蛋白质，氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）编码1）所述的蛋白质的核酸分子；

3）含有2）所述核酸分子的表达盒；

4）含有2）所述核酸分子的重组载体；

5）含有3）所述表达盒的重组载体；

6）含有2）所述核酸分子的重组微生物；

7）含有3）所述表达盒的重组微生物；

8）含有4）所述重组载体的重组微生物；

9）含有5）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：2）所述核酸分子的编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子。

4.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的蛋白质的活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；所述抗逆性为抗碱胁迫。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物体现在如下（1）-（5）中任一种：

（1）在碱胁迫条件下，转基因植物的展叶率高于受体植物；

（2）在碱胁迫条件下，转基因植物的根长长于受体植物；

（3）在碱胁迫条件下，转基因植物的叶绿素含量高于受体植物；

（4）在碱胁迫条件下，转基因植物的丙二醛含量低于受体植物；

（5）在碱胁迫条件下，转基因植物的碱胁迫相关基因的表达量高于受体植物；所述碱胁迫相关基因具体为H⁺-ATPase基因和/或COR47基因和/或KIN1基因和/或RD29A基因。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

所述提高受体植物中权利要求1中所述的蛋白质的活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的蛋白质。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。