CN114480324B - 一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1及其相关生物材料与应用 - Google Patents

一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1及其相关生物材料与应用 Download PDF

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Abstract

一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1及其相关生物材料与应用，属于生物技术领域。为了提高植物抗逆性，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GsMYST1蛋白或在GsMYST1蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质，通过实验证明，GsMYST1基因能应答盐胁迫反应，并且GsMYST1和GsSnRK1存在物理关联，GsSnRK1可以在Ser44位点磷酸化GsMYST1。在大豆毛根中共表达GsSnRK1和GsMYST1，发现GsSnRK1(wt)和GsMYST1(wt)的组合能显著增强大豆对盐胁迫的抗性，揭示了GsMYST1的新功能及其对植物耐盐性的调控机制。

Description

一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及一种可提高植物耐盐性的蛋白质及其相关生物材料与应用，属于生物技术领域。
背景技术
盐胁迫是影响世界很多地区农作物产量的环境胁迫因子之一。大豆(Glycinemax)作为我国广泛种植的重要农作物，在长期的人工选育过程中，丧失了很多抗盐基因，使得大豆对土壤中的盐胁迫较为敏感，而野生大豆(Glycine soja)作为栽培大豆的近缘种具有很强的环境适应性，是重要的种质资源。
近年来，通过基因工程挖掘耐盐的关键调控基因，通过基因工程技术分子育种改良作物耐盐性，进而提高作物产量已成为可能。然而，其实现的重要前提是挖掘耐盐关键调控基因。
发明内容
本发明为解决如何提高植物耐盐性的问题，提供了一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1，所述蛋白GsMYST1为下述a)和b)中的任意一种蛋白：
a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
b)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。
为了使a)中的蛋白便于纯化，可在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的氨基末端或羧基末端连接上HA标签或Myc标签。
本发明还提供了与GsMYST1蛋白相关的生物材料，包括编码所述蛋白GsMYST1的核酸分子。
进一步地限定，所述生物材料还包括来自下述A1)至A3)中的任意一种：
A1)含有所述核酸分子的表达盒；
A2)含有所述核酸分子的重组载体；
A3)含有所述核酸分子的重组微生物。
进一步地限定，所述的生物材料还包括来自下述A4)至A6)中的任意一种：
A4)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物。
进一步地限定，所述的生物材料还包括含有A4)所述重组载体的重组微生物。
进一步地限定，所述核酸分子为下述1)或2)所示的基因：
1)其核苷酸序列是如SEQ ID NO.2所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有75％以上的同一性且编码所述蛋白GsMYST1的cDNA分子或基因组DNA分子。
进一步地限定，所述核酸分子还包括与所述1)或2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白GsMYST1的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsMYST1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsMYST1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsMYST1蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述生物材料中，A1)所述的含有编码GsMYST1蛋白的核酸分子的表达盒(GsMYST1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsMYST1蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsMYST1转录的启动子，还可包括终止GsMYST1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(“LAP”，Chao等人(1999)PlantPhysiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7_硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5187267)；四环素诱导型启动子(美国专利5057422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(中国专利200710099169.7)，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：0dell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene，56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet，262:141；Proudfoot(1991)Cell，64:671；Sanfacon等人Genes Dev.，5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell，2:1261；Munroe等人(1990)Gene，91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.l7:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述GsMYST1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还提供了上述蛋白GsMYST1或上述生物材料在提高植物耐盐性中的应用，所述应用包括在植物中过表达蛋白GsMYST1或共表达蛋白GsMYST1和GsSnRK1蛋白。
本发明还提供了一种培育具有耐盐性的转基因大豆毛状根的方法，所述方法将上述蛋白GsMYST1的编码基因导入大豆毛状根，或将上述蛋白GsMYST1的编码基因和GsSnRK1蛋白的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白GsMYST1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地限定，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。
在本发明的一种实施方式中，GsMYST1蛋白的编码基因即如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列通过含有GsMYST1蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1导入农杆菌K599中。所述重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1为将核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的分子插入pPBEL-BiFC载体的PmlI位点之间，且保持pPBEL-BiFC载体的其他序列不变得到的载体。所述重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1表达GsSnRK1蛋白和GsMYST1蛋白，pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1表达GsSnRK1(K49M)蛋白和GsMYST1蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述转基因大豆毛状根可理解为将所述GsMYST1基因转化目的植物子叶得到的转基因毛状根。也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
扩增编码上述GsMYST1蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明有益效果：
本发明发现了一种与植物盐胁迫相关的组蛋白乙酰转移酶GsMYST1，其对NaCl和ABA敏感，并且通过qRT-PCR和GUS染色分析表明GsMYST1基因在野生大豆根中显性表达，且GsMYST1受NaCl胁迫诱导后表达量增加更多，能应答盐胁迫反应。通过酵母二元杂交验证、拟南芥原生质体验证、免疫共沉淀和BiFC测定证实了GsMYST1和GsSnRK1的物理关联。此外，确定了GsSnRK1可以在Ser44位点磷酸化GsMYST1。使用pan-H4ac抗体生化检测了大豆毛状根中GsMYST1的乙酰转移酶活性，盐胁迫可以激活GsSnRK1，随后GsSnRK1对GsMYST1的磷酸化是其乙酰转移酶活性所必需的。在大豆毛根中共表达GsSnRK1和GsMYST1，发现GsSnRK1(wt)和GsMYST1(wt)的组合能显著增强大豆对盐胁迫的抗性，揭示了GsMYST1的新功能及其对植物耐盐性的调控机制。然后，我们对多种转基因大豆植株在盐胁迫下的表型及生理指标进行分析，结果显示在盐胁迫作用下，单独过表达GsSnRK1及GsMYST1的转基因嵌合体大豆植株生长状态良好，共表达GsSnRK1(wt)和GsMYST1(wt)的转基因嵌合体大豆植株生长状态更优于单独过表达GsSnRK1及GsMYST1的转基因嵌合体大豆植株。这为GsMYST1的新功能及其对植物耐盐胁迫的调控机制提供了新的线索。
附图说明
图1为通过盐与ABA处理后，qRT-PCR和GUS染色分析GsMYST1基因在野生大豆根中的表达情况的结果图；图中A为GsMYST1基因在3周龄野生大豆植株中各部位的表达量，图中B为通过不同浓度的NaCl溶液处理后GsMYST1基因的表达量，图中C为通过不同浓度的ABA溶液处理后GsMYST1基因的表达量；图中D和E为通过GUS染色测定GsMYST1在GsMYST1pro:GUS转基因拟南芥根中的表达量；
图2为MYST家族蛋白氨基酸序列的多重比对结果图；
图3为MYST家族组蛋白乙酰转移酶进化树分析结果图；
图4为通过酵母二元杂交证实了GsMYST1和GsSnRK1的物理关联结果图；
图5为通过BiFC和Co-IP证实了GsMYST1和GsSnRK1的互作关系的结果图；图中A为在拟南芥原生质体中瞬时转染GsSnRK1与GsMYST1蛋白在植物体内的共定位结果，图中B为Co-IP分析GsSnRK1和GsMYST1在植物细胞中的相互作用结果；
图6为GsMYST1蛋白的体外磷酸化分析结果图；图中A为利用Phos-tag技术进行GsMYST1的体外磷酸化分析结果，B为利用pPKD抗体进行GsMYST1的体外磷酸化分析结果，其中S44A为GsMYST1(S44A)，K49M为GsSnRK1(K49M)；
图7为转基因大豆毛状根的分析结果图；图中A为转基因大豆毛状根的荧光观察结果，a和b为pCAMBIA3301-35Spro:GFP的转基因大豆毛状根；c和d，e和f为pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP的转基因大豆毛状根，g和h为K599空菌诱导的毛状根；B为过表达及RNAi转基因毛转根的qRT-PCR鉴定结果，C为利用Westernblot在蛋白水平鉴定转基因毛状根的结果；
图8为组蛋白乙酰转移酶GsMYST1在植物体内的生物化学功能分析结果图；
图9为在大豆毛状根中GsSnRK1磷酸化GsMYST1的分析结果图；
图10为150mM NaCl处理后转基因嵌合体大豆的表型图；
图11为150mM NaCl处理后转基因嵌合体大豆的生理指标分析。图中A、C、E、G为10d后对照组的生理指标；B、D、F、H为150mM NaCl处理10d后的生理指标。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的野生大豆G07256种子在文献“Yang Yu,Ailin Liu,XiangboDuan,Sunting Wang,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Dan Zhu,Chao Chen,Lei Cao,JialeiXiao,Qiang Li,Zaib_un Nisa，Yanming Zhu,Xiaodong Ding.GsERF6,an ethylene-responsive factor from Glycine soja,mediates the regulation of plantbicarbonate tolerance in Arabidopsis.Planta2016 244(3):681-698”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的发根农杆菌K599在文献“李慧卿，陈超，陈冉冉，宋雪薇，李佶娜，朱延明，丁晓东。利用CRISPR/Cas9双基因敲除系统初步解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA 及碱胁迫的响应。遗传。2018,40(6):496-507”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109在“孙晓丽，段小红，才华，李勇，柏锡，纪巍，季佐军，朱延明。利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质。中国生物化学与分子生物学报，2010,26(11)1050-1058”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pET-32b、pGADT7及pGBKT7载体在文献“Yang Yu,Xiangbo Duan,Xiaodong Ding,Chao Chen,Dan Zhu,Kuide Yin,Lei Cao,Xuewei Song,Pinghui Zhu,Qiang Li,Zaib_un Nisa,Jiyang Yu,Jianying Du,Yu Song,Huiqing Li,Beidong Liu,Yanming Zhu.A novel AP2/ERF family transcription factor from Glycine soja,GsERF71,is a DNA binding protein that positively regulates alkaline stresstolerance in Arabidopsis.Plant Mol Biol(2017)94:509–530”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pPBEL-BiFC载体在文献“Song Yu,Zhang Hang,You Hongguang,Liu Yuanming,Chen Chao,Feng Xu,Yu Xingyu,Wu Shengyang,Wang Libo,Zhong Shihua,Li Qiang,Zhu Yanming,Ding Xiaodong.Identification of novel interactors andpotential phosphorylation substrates of GsSnRK1 from wild soybean(Glycinesoja).Plant,cell&environment2019,42(1):145-157”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中用到的融合蛋白原核表达重组载体pGEX-4T-1-GsSnRK1.1、pET32b-Myc-GsSnRK1.1、pET32b-Flag-GsGRIK1及重组蛋白在文献“刘圆明,尤宏光,卢浩然,丁晓东.野生大豆GsPP2CA和GsPKA对GsSnRK1.1蛋白活性的调控.西北植物学报,2020,40(08):1277-1286.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell是全式金公司的产品。
下述实施例中的酿酒酵母感受态Y2HGold Chemically Competent Cell是上海唯地生物技术有限公司的产品。
下述实施例中涉及到的引物对应的核苷酸序列见表1。
表1引物对应的核苷酸序列
Figure BDA0003468840700000041
实施例1：大豆组蛋白乙酰转移酶GsMYST1基因的克隆及其表达模式分析
一、植物材料的处理
选取饱满的野生大豆(Glycine soja)G07256种子，经浓HgSO4处理10min，灭菌水冲洗3-4次后置于的湿滤纸上，在4℃下黑暗处理进行春化3d。在人工气候室中，用1/4Hoagland营养液培养野生大豆幼苗，培养3周，获得3周龄的幼苗。生长条件为：24℃，相对湿度60％，光照周期为16h光照，8h黑暗。
二、RNA提取
参见Plant RNA Kit(OMEGA)说明书提取野生大豆幼苗的总RNA。将提取的总RNA立即进行反转录或置于-80℃保存。
三、cDNA的获得
以上述步骤二获得的总RNA为模板，采用TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录得到cDNA。
四、PCR扩增
以步骤三获得的cDNA为模板，采用GsMYST1-Clone-F(SEQ ID NO.3)和GsMYST1-Clone-R(SEQ ID NO.4)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量略大于1kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)回收PCR扩增产物，将其与pEASY-Blunt SimpleCloning Kit载体(TRANSGEN BIOTECH)连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-BluntSimple-GsMYST1，并将其转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为1305bp的扩增产物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，将其命名为GsMYST1基因，ORF为SEQ ID NO.2的第1-1305位，GsMYST1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：MGSLEAPTAAENGSAPAAGNGKSPSVNGAEAALEPDASKRRRSAVLPLEVGTRVMCRWRDNKYHPVKVIERRKVPNVIPNDYEYYVHYTEFNRRLDEWVKLDQLDLNSVEAVVDEKVEEKGATGLKMTRHQKRKIDETHVEGHEELDAASLREHEEFTKVKNIATIELGRYEIETWYFSPFPPEYNDCLKLYFCEFCLNFMKRKEQLQRHMRKCDLKHPPGDEIYRSGTLSMFEVDGKKNKVYGQNLCYLAKLFLDHKTLYYDVDLFLFYVLCECDDRGCHMVGYFSKEKHSEESYNLACILTLPPYQRKGYGKFLIAFSYELSKKEGKVGTPERPLSDLGLLSYRGYWTRVLLDILKKHKGNISIKELSDMTAIKAEDILTTLQSLELIQYRKGQHVICADPKVLDRHLKAAGRGGLEVDVSKLIWTPYKEQS
SEQ ID NO.2：ATGGGTTCACTCGAGGCCCCAACCGCCGCGGAAAACGGTTCCGCTCCCGCCGCCGGCAACGGAAAATCCCCCTCCGTCAACGGCGCGGAGGCGGCGCTGGAGCCCGACGCATCGAAGCGGCGGAGATCGGCCGTGCTCCCACTGGAGGTGGGCACGCGCGTCATGTGCCGGTGGAGGGACAACAAGTACCACCCCGTCAAAGTCATCGAACGCCGCAAGGTTCCCAACGTCATCCCCAACGATTACGAGTACTACGTCCATTACACTGAGTTCAATAGGAGGCTTGATGAGTGGGTGAAGCTTGACCAGTTGGATCTTAATTCAGTGGAGGCTGTTGTTGATGAGAAAGTGGAGGAGAAGGGTGCAACAGGTTTGAAGATGACTCGCCACCAAAAGAGGAAGATTGATGAGACACATGTAGAGGGACATGAGGAGCTTGATGCTGCCAGTTTGCGAGAACATGAGGAATTTACCAAAGTGAAAAATATAGCTACTATTGAGCTTGGAAGATATGAGATTGAGACATGGTACTTCTCCCCATTCCCACCAGAATACAATGACTGTTTGAAGCTGTACTTTTGTGAGTTTTGCCTCAATTTCATGAAACGCAAAGAACAGCTTCAGAGGCATATGAGGAAATGTGATCTTAAGCATCCCCCTGGTGATGAGATATACAGAAGTGGTACACTGTCAATGTTTGAGGTCGATGGCAAAAAGAACAAGGTTTATGGGCAGAATCTTTGTTATTTGGCCAAGTTATTTCTTGATCACAAGACCCTCTATTATGATGTAGACCTGTTTCTGTTCTATGTTTTATGTGAATGTGATGATCGAGGTTGTCACATGGTTGGCTATTTCTCCAAGGAAAAACATTCTGAGGAATCTTACAATTTGGCATGTATCCTCACCCTACCACCTTACCAAAGGAAAGGCTATGGCAAATTTCTAATTGCATTCTCATATGAGCTGTCCAAAAAAGAGGGCAAAGTTGGCACACCTGAAAGACCTCTTTCTGACCTTGGACTGCTAAGCTACAGAGGATATTGGACCAGGGTTCTCTTAGACATTCTGAAGAAGCATAAGGGAAACATTTCTATCAAGGAACTGAGTGATATGACTGCCATTAAAGCTGAAGACATATTAACCACTCTGCAGAGCCTAGAATTGATTCAATACAGGAAAGGTCAGCATGTTATATGCGCAGATCCGAAAGTGTTGGATCGCCATCTTAAAGCTGCTGGCAGAGGGGGCCTGGAGGTTGATGTTAGCAAACTGATCTGGACTCCTTATAAAGAACAAAGTTGA
五、实时荧光定量PCR分析GsMYST1的表达模式
利用引物GsMYST1-qPCR-F(SEQ ID NO.5)和GsMYST1-qPCR-R(SEQ ID NO.6)对3周龄的野生大豆幼苗各器官的cDNA和经不同浓度的ABA或NaCl处理1h的3周龄的野生大豆幼苗各器官的cDNA进行qRT-PCR扩增。
根据qRT-PCR结果可知GsMYST1基因在野生大豆植株中各个器官中均有表达，其中根部表达量相对较高，说明GsMYST1基因可能参与盐胁迫的响应(见图1中的A)。用不同浓度的ABA及NaCl处理野生大豆植株1h后的结果表明，GsMYST1的表达能够受到NaCl和ABA的诱导(见图1中的B和C)。
六、GUS活性染色及GUS含量测定分析GsMYST1在NaCl和ABA胁迫下的表达模式
3周龄的野生大豆幼苗分别经100mM NaCl与100μM ABA处理1h后，对GsMYST1pro:GUS转基因拟南芥进行GUS染色，
活性染色分析，取X-Gluc 5mg、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和1mL 50mM磷酸缓冲液定容至10mL。将纯合体植物组织完全浸泡于GUS染液中，放置于37℃中避光8h。将GUS染液吸出后，用70％乙醇与30％乙酸混合液脱色直至脱色完全。观察植物组织染色结果。
植株的GUS活性的定量检测所需试剂：(1)0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)；(2)10％SDS溶液；(3)0.5M EDTA (pH8.0)；(4)GUS酶提取液；(5)MUG底物；(6)Stop Buffer(0.2MNa2CO3)；(7)考马斯亮蓝G250溶液；(8)1mg/mL BSA。
使用GUS提取液进行总蛋白提取，总蛋白浓度的测定使用Bradford法。取总蛋白提取液100μL，加入到37℃的400μL GUS提取缓冲液，再加MUG底物500μL，放入37℃温箱中。每隔15min取200μL混合反应物加入到800μL反应终止液，共取样5次，室温避光保存。利用荧光分光光度计测定以365nm激发波长、455nm发射波长时各时间点的荧光强度数值。以荧光强度值对反应时间做曲线，求出单位时间的荧光强度变化值，并计算出GUS活性(nmol4-MU/min mg protein)。
结果表明，植株所有器官中GsMYST1基因的表达量均有上升，其中根部的表达量变化最大，且GsMYST1受NaCl胁迫诱导后表达量增加更多，这说明GsMYST1基因能应答盐胁迫反应(见图1中的D和E)。
利用DNAMAN将GsMYST1蛋白与不同植物中的MYST家族蛋白进行氨基酸序列比对后发现，GsMYST1蛋白同大豆中的GmMYST1及拟南芥中的AtHAM1、AtHAM2的相似性分别为100％、82.74％和84.53％，并且MYST家族蛋白的C端高度保守，而N端具有多样性(见图2)。
通过在NCBI上寻找多种微生物、植物及动物的组蛋白乙酰转移酶序列构建进化树，结果如图3所示，表明GsMYST1在进化上比较保守。
实施例2：GsSnRK1与GsMYST1的互作
一、酵母二元杂交验证GsSnRK1与GsMYST1的互作
(一)pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsMYST1表达载体的构建
1.GsSnRK1基因的获得
以野生大豆总cDNA为模板，采用BD-GsSnRK1-SmaIF(SEQ ID NO.7)和BD-GsSnRK1-SalIR(SEQ ID NO.8)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。
2、重组载体pGBKT7-GsSnRK1的构建
用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对pGBKT7载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGBKT7-GsSnRK1重组载体，对pGBKT7-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGBKT7-GsSnRK1重组载体为将pGBKT7载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体。pGBKT7-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。
3、重组载体pGADT7-GsMYST1的构建
以pEASY-Blunt Simple-GsMYST1质粒为模板，采用AD-GsMYST1-SmaIF(SEQ IDNO.9)和AD-GsMYST1-SmaIR(SEQ ID NO.10)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。用限制性内切酶SmaI(New EnglandBiolabs)对pGADT7载体(Clontech,Version No.PR732196)进行酶切，通过PCR的方法在GsMYST1基因的上下游分别添加SmaI酶切位点以及与载体部分的同源臂。将pGADT7载体用SmaI进行单酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶与上述PCR产物进行连接。鉴定正确后将所获得载体命名为pGADT7-GsMYST1。
测序结果表明：pGADT7-GsMYST1重组载体为将pGADT7载体的SmaI酶切位点通过同源重组插入GsMYST1基因，且保持pGADT7载体的其他序列不变得到的载体。pGADT7-GsMYST1重组载体表达GsMYST1蛋白。
(二)转化酵母菌Y2HGold
分别将pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsMYST1两个载体及pGBKT7空载体和pGADT7-GsMYST1两个载体及pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7两个载体及pGBKT7和pGADT7两个载体转化酵母菌Y2HGold，分别得到含质粒pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsMYST1、pGBKT7和pGADT7-GsMYST1、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7、pGBKT7和pGADT7的酵母菌Y2HGold，转化酵母感受态细胞的具体步骤参见唯地生物Y2HGold Chemically Competent Cell转化的具体操作。
结果如图4所示，在SD/-Trp/-Leu/-His(含20mM 3-AT)培养基上，试验组含有pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsMYST1重组载体的酵母菌株能够正常生长，而空白对照组pGBKT7和pGADT7及负对照组pGBKT7和pGADT7-GsMYST1、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7的酵母菌株均不能正常生长，X-α-gal染色的结果也进一步验证了这一结果，表明了GsSnRK1蛋白与GsMYST1蛋白的互作关系。
二、拟南芥原生质体验证GsSnRK1与GsMYST1的互作及定位
(一)pPBEL-BiFC载体的构建
1.GsSnRK1基因的获得
利用同上方法获得GsSnRK1基因的PCR扩增产物。
2.GsMYST1基因的获得
以上述pEASY-Blunt Simple-GsMYST1质粒为模板，采用BiFC-GsMYST1-PmlIF(SEQID NO.11)和BiFC-GsMYST1-PmlIR(SEQ ID NO.12)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsMYST1基因。
3.pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体的构建
1)pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体的构建
用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对pPBEL-BiFC载体和上述GsSnRK1基因的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体，对pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体为将pPBEL-BiFC载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pPBEL-BiFC载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。
2)pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体的构建
采用PmlI限制性内切酶(New England Biolabs)对pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体进行单酶切后进行胶回收纯化，然后利用同源重组酶将GsMYST1与酶切纯化后的载体进行连接，将产物转化DH5α感受态细胞。挑取阳性克隆载体，对pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：GsMYST1重组载体成功插入到pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体的PmlI酶切位点，且保持pPBEL-BiFC-GsSnRK1载体的其他序列不变。得到的重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1表达GsSnRK1蛋白和GsMYST1蛋白。
(二)拟南芥原生质体转化
采用聚乙二醇法将上述pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体转化到拟南芥原生质体(具体方法参见中科瑞泰植物原生质体制备及转化试剂盒说明书)，选取转化过pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体和pPBEL-BiFC空载体的拟南芥原生质体，装片，利用激光共聚焦显微镜观察。结果如图5中的A所示：GsMYST1蛋白与GsSnRK1蛋白互作并且定位在细胞核中。
(三)拟南芥原生质体蛋白的提取及Western blot检测
将相关质粒在拟南芥原生质体中进行瞬时表达后提取总蛋白，采用Co-IP技术分析二者的互作关系。利用anti-HA从所有裂解物中免疫沉淀(即IP)出HA-GsMYST1，并通过anti-Myc抗体进行Western blot检测Myc-GsSnRK1蛋白；以及利用anti-Myc从所有裂解物中免疫沉淀出Myc-GsSnRK1，并通过anti-HA抗体进行Western blot检测HA-GsMYST1蛋白。结果如图5中的B表明，两者之间都存在互作，并能形成蛋白复合物。
三、GsSnRK1对GsMYST1的磷酸化分析
(一)GsSnRK1蛋白执行磷酸化功能及GsMYST1上GsSnRK1磷酸化位点的预测
通过在线工具(http://ppsp.biocuckoo.org)对GsSnRK1蛋白执行磷酸化功能及GsMYST1上GsSnRK1磷酸化位点的预测。
结果显示GsSnRK1蛋白第49位氨基酸赖氨酸(K)为GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸。GsMYST1蛋白第44位点处的丝氨酸(S)为GsSnRK1假定的磷酸化位点。
(二)蛋白表达载体的构建
1.重组载体pET32b-GsSnRK1的构建
1)GsSnRK1基因的获得
以上述pGBKT7-GsSnRK1质粒为模板，采用pET-HA-GsSnRK1-SalIF(SEQ ID NO.13)和pET-HA-GsSnRK1-XhoIR(SEQ ID NO.14)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。
2)重组载体pET32b-GsSnRK1的构建
用限制性内切酶SalI(New England Biolabs)和XhoI(New England Biolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsSnRK1重组载体，对pET32b-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-GsSnRK1重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。
2.重组载体pET32b-GsSnRK1(K49M)的构建
1)GsSnRK1(K49M)基因的获得
我们将GsSnRK1基因序列上编码第49位氨基酸的碱基AAG替换为ATG，使GsSnRK1蛋白的第49位氨基酸由赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)，我们重新人工合成了突变过的GsSnRK1基因并命名为GsSnRK1(K49M)，GsSnRK1(K49M)基因编码的GsSnRK1(K49M)蛋白不具有磷酸化的功能。
以GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用pET-HA-GsSnRK1(K49M)-SalIF(SEQ IDNO.15)和pET-HA-GsSnRK1(K49M)-XhoIR(SEQ ID NO.16)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSnRK1(K49M)基因。
2)重组载体pET32b-GsSnRK1(K49M)的构建
用限制性内切酶SalI(New England Biolabs)和XhoI(New England Biolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体，对pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1(K49M)基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体表达GsSnRK1(K49M)蛋白。
3.重组载体pET32b-GsMYST1的构建
1)GsMYST1基因的获得
以上述pEASY-Blunt Simple-GsMYST1质粒为模板，采用pET-HA-GsMYST1-EcoRVF(SEQ ID NO.17)和pET-HA-GsMYST1-EcoRVR(SEQ ID NO.18)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsMYST1基因。
2)重组载体pET32b-GsMYST1的构建
采用限制性内切酶EcoRV(New England Biolabs)对pET32b载体进行单酶切，然后利用同源重组酶将GsMYST与酶切纯化后的载体进行连接，得到pET32b-HA-GsMYST1重组载体。
测序结果表明：pET32b-GsMYST1重组载体为将pET32b载体的EcoRV单酶切后，插入的GsMYST1基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsMYST1重组载体表达GsMYST1蛋白。
4.重组载体pET32b-GsMYST1(S44A)的构建
1)GsMYST1(S44A)基因的获得
我们将GsMYST1基因序列上编码第44位氨基酸的碱基TCG替换为GCC，使GsMYST1蛋白的第44位氨基酸由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，我们重新人工合成了突变过的GsMYST1基因并命名为GsMYST1(S44A)，GsMYST1(S44A)基因编码的GsMYST1(S44A)蛋白不具有被GsSnRK1蛋白磷酸化的能力。
以GsMYST1(S44A)基因为模板，采用pET-HA-GsMYST1(S44A)-EcoRV(SEQ IDNO.19)和pET-HA-GsMYST1(S44A)-EcoRVR(SEQ ID NO.20)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsMYST1(S44A)基因。
2)重组载体pET32b-GsMYST1(S44A)的构建
采用限制性内切酶EcoRV(New England Biolabs)对pET32b载体进行单酶切，然后利用同源重组酶将GsMYST(S44A)与酶切纯化后的载体进行连接，得到pET32b-HA-GsMYST1(S44A)重组载体。
测序结果表明：pET32b-GsMYST1(S44A)重组载体为将pET32b载体的EcoRV单酶切后，插入的GsMYST1(S44A)基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsMYST1(S44A)重组载体表达GsMYST1(S44A)蛋白。
(三)蛋白的表达和纯化
将蛋白表达载体pET32b-GsSnRK1、pET32b-GsSnRK1(K49M)、pET32b-GsMYST1和pET32b-GsMYST1(S44A)分别转化大肠杆菌BL21感受态(TRANSGEN BIOTECH)，具体操作步骤详见
Figure BDA0003468840700000091
BL21(DE3)Chemically Competent Cell说明书。分别获得含有pET32b-GsSnRK1、pET32b-GsSnRK1(K49M)、pET32b-GsMYST1和pET32b-GsMYST1(S44A)蛋白表达载体的BL21大肠杆菌并诱导蛋白表达。
分别对表达的GsSnRK1、GsSnRK1(K49M)、GsMYST1和GsMYST1(S44A)蛋白进行纯化，GsSnRK1和GsSnRK1(K49M)蛋白的纯化采用上海谷研实业有限公司提供的Myc融和蛋白纯化试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书；GsMYST1和GsMYST1(S44A)蛋白的纯化采用康为世纪His-Tagged Protein Purification Kit试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书。
(四)Phos-tagTM检测GsSnRK1对GsMYST1的磷酸化
采用Phos-tagTM试剂盒分别检测GsSnRK1对GsMYST1、GsSnRK1对GsMYST1(S44A)的磷酸化水平，具体操作步骤详见Phos-tagTM试剂盒说明书。
结果如图6中的A所示：GsSnRK1对GsMYST1有磷酸化的作用，GsSnRK1对GsMYST1(S44A)没有磷酸化作用。证明了GsSnRK1蛋白对GsMYST1蛋白具有磷酸化作用，GsMYST1的第44位氨基酸S是GsSnRK1关键的磷酸化位点。
(五)Western blot检测GsSnRK1对GsMYST1的磷酸化
采用Western blot分别检测GsSnRK1对GsMYST1、GsSnRK1对GsMYST1(S44A)、GsSnRK1(K49M)对GsMYST1的磷酸化水平。采用pPKDsub抗体检测是否存在磷酸化，采用HA抗体检测GsMYST1和GsMYST1(S44A)的含量，采用Myc抗体检测GsSnRK1和GsSnRK1(K49M)的含量。
结果如图6中的B所示：采用pPKDsub抗体检测到GsSnRK1对GsMYST1有磷酸化的作用，而GsSnRK1对GsMYST1(S44A)及GsSnRK1(K49M)对GsMYST1均没有磷酸化作用。再一次证明了GsSnRK1蛋白对GsMYST1蛋白具有磷酸化作用，且GsSnRK1的第49位氨基酸K是GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸，GsMYST1的第44位氨基酸S是GsSnRK1关键的磷酸化位点。
实施例3：GsMYST1的遗传转化及在转基因大豆中的表达分析
一、pCAMBIA3301-35Spro:GFP表达载体的构建
1.GFP基因的获取
利用质粒pCAMBIA1302为模板，根据GFP基因设计引物并在其上下游分别添加NcoI和PmlI酶切位点，采用3301-GFP-NcoIF(SEQ ID NO.21)和3301-GFP-PmlIR(SEQ ID NO.22)及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GFP基因。
2.重组载体pCAMBIA3301-35Spro:GFP的构建
用限制性内切酶NcoI(New England Biolabs)和PmlI(New England Biolabs)分别对pCAMBIA3301载体进行双酶切，然后利用同源重组酶将GFP与酶切纯化后的载体进行连接，得到pCAMBIA3301-35Spro:GFP重组载体，对pCAMBIA3301-35Spro:GFP重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pCAMBIA3301-35Spro:GFP重组载体为将pCAMBIA3301载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GFP基因，且保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变得到的载体。
二、pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP表达载体的构建
1.GsMYST1基因的获取
以上述pEASY-Blunt Simple-GsMYST1质粒为模板，采用3301-HA-GsMYST1-NcoIF(SEQ ID NO.23)和3301-HA-GsMYST1-PmlIR(SEQ ID NO.24)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2.重组载体pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP的构建
用限制性内切酶NcoI(New England Biolabs)对上述pCAMBIA3301-35Spro:GFP载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将GsMYST1与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pCAMBIA3301-35Spro:GFP载体的其他序列不变得到的载体，得到pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP重组载体，对pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP重组载体为将pCAMBIA3301-35Spro:GFP载体的NcoI单酶切后，插入GsMYST1基因，且保持pCAMBIA3301-35Spro:GFP载体的其他序列不变得到的载体。
三、pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1表达载体的构建
选取GsMYST1的非保守结构域(184-435bp)
1.pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1正向载体的构建
1)GsMYST1正向基因的获取
以上述pEASY-Blunt Simple-GsMYST1质粒和为模板，采用pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1-XhoIF(SEQ ID NO.25)和pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1-XhoIR(SEQ ID NO.26)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2)重组载体pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1正向的构建
用限制性内切酶XhoI(New England Biolabs)对pHANNIBAL载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将部分GsMYST1与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pHANNIBAL载体的其他序列不变得到的载体，得到pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1正向重组载体，对pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1正向重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1正向重组载体为将pHANNIBAL载体的XhoI单酶切后，插入部分GsMYST1，且保持pHANNIBAL载体的其他序列不变得到的载体。
2.pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1载体的构建
1)GsMYST1反向基因的获取
以上述pEASY-Blunt Simple-GsMYST1质粒和为模板，采用pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1-XbaIF(SEQ ID NO.27)和pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1-XbaIR(SEQ ID NO.28)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2)重组载体pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1的构建
用限制性内切酶XbaI(New England Biolabs)对上述pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1正向载体进行单酶切后，然后利用同源重组酶将部分GsMYST1反义片段与酶切纯化后的载体进行连接，且保持pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1载体的其他序列不变得到的载体，得到pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1重组载体，对pHANNIBAL-RNAi-GsMYST重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1重组载体为将pHANNIBAL载体的XbaI单酶切后，插入部分GsMYST1，且保持pHANNIBAL载体的其他序列不变得到的载体。
3.pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1表达载体的构建
以上述pHANNIBAL-RNAi-GsMYST1质粒和为模板，采用3301-RNAi-GsMYST1-EcoRIF(SEQ ID NO.29)和3301-RNAi-GsMYST1-NcoIR(SEQ ID NO.30)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到CaMV 35S启动子、部分正义片段、内含子以及部分反义片段PCR扩增产物。
2)重组载体pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1的构建
用限制性内切酶EcoRI(New England Biolabs)和NcoI(New England Biolabs)分别对pCAMBIA3301载体进行双酶切，然后利用同源重组酶将CaMV 35S启动子、部分正义片段、内含子以及部分反义片段与酶切纯化后的载体进行连接，得到pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1重组载体，对pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1重组载体为将pCAMBIA3301载体的EcoRI和NcoI酶切位点间的DNA片段替换为CaMV 35S启动子、部分正义片段、内含子以及部分反义片段基因，且保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变得到的载体。
四、转化发根农杆菌K599
采用冻融法将表达载体pCAMBIA3301-35Spro:GFP、pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP、pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1分别转化至发根农杆菌K599中，具体操作步骤详见
Figure BDA0003468840700000101
发根农杆菌K599感受态说明书。
五、发根农杆菌K599介导转基因大豆毛状根的遗传转化及植株在盐胁迫下的表型分析
1.转基因大豆毛状根的获得
将大豆Williams82种子播于土壤中(土:蛭石＝1:1)约1-2cm深。置于恒温气候箱中，白天28℃/晚上20℃，每日浇水，取6d龄子叶尚未展开的幼苗用于K599侵染。用注射器将分别含有重组载体pCAMBIA3301-35Spro:GFP、pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP、pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1的K599发根农杆菌菌液及不含任何载体的K599发根农杆菌菌液注射到大豆子叶节中，侵染后覆膜。待长出毛状根后，将侵染位点及以下部分用蛭石埋住，使其保持湿润。28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30d，保持潮湿环境。等到长出毛状根30d后，当毛状根长至约10cm时，将主根减去，将复合体植株埋入混合土中(营养土:蛭石＝1:1)，每3d浇一次水。等到长出毛状根45d后，用于鉴定及后续表型分析。
2.转基因大豆毛状根的鉴定
1)pCAMBIA3301-35Spro:GFP、pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP转基因大豆毛状根的鉴定
利用PCR的方法对转基因大豆毛状根中添加的标签GFP进行检测，取长度为5mm大豆毛状根，放入离心管内并加入35μl Lysis Buffer A,95℃加热10min，静置后取上清液1μl作为PCR反应体系的模板。分别采用GFP-FW(SEQ ID NO.31)和GFP-RW(SEQ ID NO.32)引物及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对pCAMBIA3301-35Spro:GFP、pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP载体携带的特异性基因片段进行检测，得到PCR扩增产物。克隆出GFP基因，表明相关目的基因已经在转基因大豆毛状根中表达。
2)pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1转基因大豆毛状根的鉴定
利用PCR的方法对转基因大豆毛状根进行鉴定，取长度为5mm大豆毛状根，放入离心管内并加入35μl Lysis Buffer A，95℃加热10min，静置后取上清液1μl作为PCR反应体系的模板。分别采用PDK-F(SEQ ID NO.33)和PDK-R(SEQ ID NO.34)引物及PrimeSTAR MaxDNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1载体携带的特异性基因片段进行检测，得到PCR扩增产物。克隆出PDK基因，表明相关目的基因已经在转基因大豆毛状根中表达。
六、转基因大豆毛状根的绿色荧光蛋白分析及GsMYST1基因与蛋白的表达量分析
1.转基因大豆毛状根的绿色荧光蛋白分析
选取过表达pCAMBIA3301-35Spro:GFP和pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP的转基因大豆毛状根，装片，利用激光共聚焦显微镜观察。
结果如图7中的A所示，发现pCAMBIA3301-35Spro:GFP和pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP的转基因大豆毛状根均有绿色荧光蛋白的表达，而在K599空菌诱导的毛状根中则没有发现绿色荧光蛋白的表达。
2.转基因大豆毛状根中GsMYST1基因与蛋白的表达量分析
1)取鉴定后的转基因大豆毛状根的cDNA，采用引物GsMYST1-qPCR-F和GsMYST1-qPCR-R进行qRT-PCR分析转基因毛状根中GsMYST1基因的表达量。
结果如图7中的B所示，根据qRT-PCR结果表明过表达35Spro:GsMYST1-GFP转基因毛状根中GsMYST1基因的表达量有显著的上升，而在RNAi-GsMYST1转基因毛状根中GsMYST1基因的表达量有显著的下调。
2)Western blot检测GsMYST1蛋白的表达。
提取pCAMBIA3301-35Spro:GFP和pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP转基因大豆毛状根的总蛋白，采用GFP抗体检测GsMYST1蛋白是否在转基因大豆毛状根中表达。
结果如图7中的C所示：Western blot结果表明HA-GsMYST1-GFP蛋白也已经成功表达。
七、GsMYST1基因在转基因大豆毛状根中乙酰化水平的测定
在拟南芥中组蛋白乙酰转移酶MYST家族成员HAM1和HAM2具有乙酰化组蛋白H4的生物化学功能，由于其在进化中的保守性，推测GsMYST1在大豆中同样也具有乙酰化组蛋白H4的功能。提取pCAMBIA3301-35Spro:GFP、pCAMBIA3301-35Spro:HA-GsMYST1-GFP和pCAMBIA3301-RNAi-GsMYST1转基因大豆毛状根的总蛋白，用anti-H4ace抗体(1:10000)进行Western blot来检测其体内H4乙酰化状态。
结果如图8所示，过量表达35Spro:HA-GsMYST1-GFP转基因毛状根的H4乙酰化水平最高，而RNAi-GsMYST1转基因毛状根的H4乙酰化水平最低，空载株系的H4乙酰化水平处于二者之间。因而，可以得出结论GsMYST1在大豆体内具有乙酰化组蛋白H4的生物化学功能。
八、在转基因大豆毛状根中GsSnRK1磷酸化GsMYST1的分析
1.pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1表达载体的构建
1)GsSnRK1(K49M)基因的获得
以上述GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用BiFC-GsSnRK1(K49M)-SmaIF(SEQ IDNO.35)和BiFC-GsSnRK1(K49M)-SmaIR(SEQ ID NO.36)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSnRK1(K49M)基因。
2)pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1载体的构建
用限制性内切酶SmaI(New England Biolabs)和SalI(New England Biolabs)分别对上述PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体和上述GsSnRK1(K49M)基因的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1重组载体，对PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1重组载体为将pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体的SmaI和SalI酶切位点间的GsSnRK1片段替换为GsSnRK1(K49M)基因，且保持pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1重组载体表达GsSnRK1(K49M)和GsMYST1蛋白。
2.pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)表达载体的构建
1)GsMYST1(S44A)基因的获得
以上述GsMYST1(S44A)基因为模板，采用BiFC-GsMYST1(S44A)-PmlIF(SEQ IDNO.37)和BiFC-GsMYST1(S44A)-PmlIR(SEQ ID NO.38)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsMYST1(S44A)基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：
2)PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)载体的构建
用限制性内切酶PmlI(New England Biolabs)对上述PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体进行单酶切，经同源重组酶连接，得到PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)重组载体，对PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)重组载体为将pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体的PmlI酶切位点间的GsMYST1片段替换为GsMYST1(S44A)基因，且保持pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)重组载体表达GsSnRK1和GsMYST1(S44A)蛋白。
3.pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)表达载体的构建
1)GsSnRK1(K49M)和GsMYST1(S44A)基因的获取
分别采用BiFC-GsSnRK1(K49M)-SmaIF和BiFC-GsSnRK1(K49M)-SmaIR引物、BiFC-GsMYST1(S44A)-PmlIF和BiFC-GsMYST1(S44A)-PmlIR引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒，按照上述方法获得GsSnRK1(K49M)和GsMYST1(S44A)PCR产物。
2)pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)表达载体的构建
用限制性内切酶PmlI(New England Biolabs)对上述PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1载体进行单酶切，经同源重组酶连接，得到PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)重组载体，对PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)重组载体为将pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1载体的PmlI酶切位点间的GsMYST1片段替换为GsMYST1(S44A)基因，且保持pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)重组载体表达GsSnRK1(K49M)和GsMYST1(S44A)蛋白。
4.转基因大豆毛状根GsSnRK1体内磷酸化GsMYST1分析
利用含有上述相应质粒pPBEL-BiFC、pPBEL-BiFC-GsSnRK1、pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1、pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsMYST1(S44A)、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsMYST1(S44A)的发根农杆菌K599对Williams82大豆进行发根，长出毛状根30d后，减去主根，通过上述PCR方法对毛状根分别进行基因型鉴定，以确认目的基因整合到植物染色体中。等到长出毛状根45d后，将转基因嵌合体大豆植株经150mMNaCl处理2h后提取毛状根总蛋白。使用anti-Myc和anti-HA抗体分别来确认Myc-GsSnRK1和HA-GsMYST1在总蛋白中的表达，
结果如图9所示，Myc-GsSnRK1及其突变体和HA-GsMYST1及其突变体在相应毛状根中均有表达。用磷酸化AMPKα(Thr172)抗体或pPKD底物抗体分别检测GsSnRK1或GsMYST1蛋白的磷酸化水平，结果表明GsSnRK1的Thr176在盐处理前有较轻微的磷酸化水平，但在150mMNaCl处理后其磷酸化水平有显著的提高；GsSnRK1(K49M)的Thr176也可以被磷酸化，尽管信号比GsSnRK1(wt)弱。从所有裂解物中免疫沉淀出HA-GsMYST1，并通过磷酸化(Ser/Thr)pPKD底物抗体检测GsMYST1在Ser44上的磷酸化，结果表明GsSnRK1(wt)能有效磷酸化HA-GsMYST1(wt)，但不能磷酸化HA-GsMYST1(S44A)。理论上，起主体抑制作用的激酶活性丧失突变体GsSnRK1(K49M)应完全抑制HA-GsMYST1(wt)的磷酸化。然而，在本研究中，虽然GsSnRK1(K49M)存在，但GsMYST1(wt)或GsMYST1(S44A)仍具有非常低的磷酸化水平，这表明在体内可能存在其他蛋白激酶可以磷酸化GsMYST1。这些数据表明在植物体中GsSnRK1可能作为上游激酶磷酸化GsMYST1。
九、转基因大豆植株在盐胁迫下的表型及生理指标分析
1转基因大豆植株的表型分析
分别将其置于霍格兰营养液或含有150mM NaCl的霍格兰营养液中培养10d后，对表型及相关生理数据进行分析。通过对地上部分的长度、根长、干重、叶绿素含量等生理指标进行统计，所有实验技术重复和生物学重复各3次。
如图10所示，正常情况下，各组植株的生长状态相似，而在盐处理后，过表达空载植株、共表达GsSnRK1(K49M)/GsMYST1(wt)、共表达GsSnRK1(wt)/GsMYST1(S44A)、共表达GsSnRK1(K49M)/GsMYST1(S44A)及RNAi-GsMYST1转基因嵌合体大豆植株生长出现停滞，表现出严重的叶片变黄和枯萎。生长状态最好的为共表达GsSnRK1(wt)/GsMYST1(wt)的转基因嵌合体大豆植株，单独过表达GsSnRK1及GsMYST1的转基因嵌合体大豆植株其生长状态介于两者之间。
如图11所示，正常情况下，各组植株地上部分的长度、根长、干重、叶绿素含量等生理指标无明显差异；而在盐处理后，过表达空载质粒的、共表达GsSnRK1(K49M)-GsMYST1、共表达GsSnRK1/GsMYST1(S44A)、共表达GsSnRK1(K49M)/GsMYST1(S44A)及RNAi-GsMYST1转基因嵌合体大豆植株的地上部分的长度、根长、干重、叶绿素含量等均较正常条件下降低，生长最好的为共表达GsSnRK1(wt)/GsMYST1(wt)的转基因嵌合体大豆植株，其地上部分的长度、根长、干重、叶绿素含量等均升高。单独过表达GsSnRK1及GsMYST1的转基因嵌合体大豆植株在盐胁迫下地上部分的长度、根长、干重、叶绿素含量介于两者之间。这也进一步说明了GsSnRK1与GsMYST1能协同增强植物对盐胁迫的耐受性。
本研究得到国家自然科学基金(No：31670272)、黑龙江省自然科学基金(No：C2017014)、东北农业大学启动基金和东北农业大学农业生物功能基因重点实验室开放式项目资金资助。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1及其相关生物材料与应用
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 434
<212> PRT
<213> Glycine soja G07256
<400> 1
Met Gly Ser Leu Glu Ala Pro Thr Ala Ala Glu Asn Gly Ser Ala Pro
1               5                   10                  15
Ala Ala Gly Asn Gly Lys Ser Pro Ser Val Asn Gly Ala Glu Ala Ala
            20                  25                  30
Leu Glu Pro Asp Ala Ser Lys Arg Arg Arg Ser Ala Val Leu Pro Leu
        35                  40                  45
Glu Val Gly Thr Arg Val Met Cys Arg Trp Arg Asp Asn Lys Tyr His
    50                  55                  60
Pro Val Lys Val Ile Glu Arg Arg Lys Val Pro Asn Val Ile Pro Asn
65                  70                  75                  80
Asp Tyr Glu Tyr Tyr Val His Tyr Thr Glu Phe Asn Arg Arg Leu Asp
                85                  90                  95
Glu Trp Val Lys Leu Asp Gln Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu Ala Val
            100                 105                 110
Val Asp Glu Lys Val Glu Glu Lys Gly Ala Thr Gly Leu Lys Met Thr
        115                 120                 125
Arg His Gln Lys Arg Lys Ile Asp Glu Thr His Val Glu Gly His Glu
    130                 135                 140
Glu Leu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Glu His Glu Glu Phe Thr Lys Val
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ile Ala Thr Ile Glu Leu Gly Arg Tyr Glu Ile Glu Thr Trp
                165                 170                 175
Tyr Phe Ser Pro Phe Pro Pro Glu Tyr Asn Asp Cys Leu Lys Leu Tyr
            180                 185                 190
Phe Cys Glu Phe Cys Leu Asn Phe Met Lys Arg Lys Glu Gln Leu Gln
        195                 200                 205
Arg His Met Arg Lys Cys Asp Leu Lys His Pro Pro Gly Asp Glu Ile
    210                 215                 220
Tyr Arg Ser Gly Thr Leu Ser Met Phe Glu Val Asp Gly Lys Lys Asn
225                 230                 235                 240
Lys Val Tyr Gly Gln Asn Leu Cys Tyr Leu Ala Lys Leu Phe Leu Asp
                245                 250                 255
His Lys Thr Leu Tyr Tyr Asp Val Asp Leu Phe Leu Phe Tyr Val Leu
            260                 265                 270
Cys Glu Cys Asp Asp Arg Gly Cys His Met Val Gly Tyr Phe Ser Lys
        275                 280                 285
Glu Lys His Ser Glu Glu Ser Tyr Asn Leu Ala Cys Ile Leu Thr Leu
    290                 295                 300
Pro Pro Tyr Gln Arg Lys Gly Tyr Gly Lys Phe Leu Ile Ala Phe Ser
305                 310                 315                 320
Tyr Glu Leu Ser Lys Lys Glu Gly Lys Val Gly Thr Pro Glu Arg Pro
                325                 330                 335
Leu Ser Asp Leu Gly Leu Leu Ser Tyr Arg Gly Tyr Trp Thr Arg Val
            340                 345                 350
Leu Leu Asp Ile Leu Lys Lys His Lys Gly Asn Ile Ser Ile Lys Glu
        355                 360                 365
Leu Ser Asp Met Thr Ala Ile Lys Ala Glu Asp Ile Leu Thr Thr Leu
    370                 375                 380
Gln Ser Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Arg Lys Gly Gln His Val Ile Cys
385                 390                 395                 400
Ala Asp Pro Lys Val Leu Asp Arg His Leu Lys Ala Ala Gly Arg Gly
                405                 410                 415
Gly Leu Glu Val Asp Val Ser Lys Leu Ile Trp Thr Pro Tyr Lys Glu
            420                 425                 430
Gln Ser
<210> 2
<211> 1305
<212> DNA
<213> Glycine soja G07256
<400> 2
atgggttcac tcgaggcccc aaccgccgcg gaaaacggtt ccgctcccgc cgccggcaac 60
ggaaaatccc cctccgtcaa cggcgcggag gcggcgctgg agcccgacgc atcgaagcgg 120
cggagatcgg ccgtgctccc actggaggtg ggcacgcgcg tcatgtgccg gtggagggac 180
aacaagtacc accccgtcaa agtcatcgaa cgccgcaagg ttcccaacgt catccccaac 240
gattacgagt actacgtcca ttacactgag ttcaatagga ggcttgatga gtgggtgaag 300
cttgaccagt tggatcttaa ttcagtggag gctgttgttg atgagaaagt ggaggagaag 360
ggtgcaacag gtttgaagat gactcgccac caaaagagga agattgatga gacacatgta 420
gagggacatg aggagcttga tgctgccagt ttgcgagaac atgaggaatt taccaaagtg 480
aaaaatatag ctactattga gcttggaaga tatgagattg agacatggta cttctcccca 540
ttcccaccag aatacaatga ctgtttgaag ctgtactttt gtgagttttg cctcaatttc 600
atgaaacgca aagaacagct tcagaggcat atgaggaaat gtgatcttaa gcatccccct 660
ggtgatgaga tatacagaag tggtacactg tcaatgtttg aggtcgatgg caaaaagaac 720
aaggtttatg ggcagaatct ttgttatttg gccaagttat ttcttgatca caagaccctc 780
tattatgatg tagacctgtt tctgttctat gttttatgtg aatgtgatga tcgaggttgt 840
cacatggttg gctatttctc caaggaaaaa cattctgagg aatcttacaa tttggcatgt 900
atcctcaccc taccacctta ccaaaggaaa ggctatggca aatttctaat tgcattctca 960
tatgagctgt ccaaaaaaga gggcaaagtt ggcacacctg aaagacctct ttctgacctt 1020
ggactgctaa gctacagagg atattggacc agggttctct tagacattct gaagaagcat 1080
aagggaaaca tttctatcaa ggaactgagt gatatgactg ccattaaagc tgaagacata 1140
ttaaccactc tgcagagcct agaattgatt caatacagga aaggtcagca tgttatatgc 1200
gcagatccga aagtgttgga tcgccatctt aaagctgctg gcagaggggg cctggaggtt 1260
gatgttagca aactgatctg gactccttat aaagaacaaa gttga 1305
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atgggttcac tcgaggcc 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcaactttgt tctttataag gagtc 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caaaggaaag gctatggcaa at 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agcagtccaa ggtcagaaag 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
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<400> 7
cccgggggac agatcaactg gccgtgg 27
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
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<400> 8
gtcgacgaga acacgtagct gtgaaagg 28
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggccagtgaa ttccacccgg gttcactcga ggccc 35
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ccgtatcgat gcccacccac tttgttcttt ataaggagtc cagatcag 48
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
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<400> 11
gttccagatt acgctcacgt gatgggttca ctcgaggccc caaccgccgc 50
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gaagcttact agtgaattca cgtgactttg ttctttataa ggagtccaga tcag 54
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gtcgacgagc agaaactcat ctctgaagag gatctggaca gatcaactgg ccgtgg 56
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ctccaggaga acacgtagct gtga 24
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gtcgacgagc agaaactcat ctctgaagag gatctggaca gatcaactgg ccgtgg 56
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ctccaggaga acacgtagct gtga 24
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cgacaaggcc atggcgatgg agtacccata cgacgtac 38
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ctcgaattcg gatccgaact ttgttcttta taaggagtcc 40
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cgacaaggcc atggcgatgg agtacccata cgacgtac 38
<210> 20
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<400> 20
ctcgaattcg gatccgaact ttgttcttta taaggagtcc 40
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<211> 51
<212> DNA
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<400> 21
acacggggga ctcttgacca tgggtagtaa aggagaagaa cttttcactg g 51
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
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<400> 22
ggtcacctgt aattcacacg tgtcacacgt ggtggtggtg gt 42
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
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<400> 23
acacggggga ctcttgacca tgggataccc ttacgatg 38
<210> 24
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<213> 人工合成
<400> 24
aaagttcttc tcctttacta cccacgtgac tttgttcttt ataaggagtc c 51
<210> 25
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catttggaga ggacacctcg agatgaagta ccaccccgtc aaag 44
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<211> 47
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<400> 26
aattggggta ccgaattctc gaggagggtc ttgtgatcaa gaaataa 47
<210> 27
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
atcgataagc ttggatctct agagagggtc ttgtgatcaa gaaataactt gg 52
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
catatctcat taaagcagga ctctagaatg aagtaccacc ccgtcaa 47
<210> 29
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
agctatgacc atgattacga attcgtctca gaagaccaaa gggctattg 49
<210> 30
<211> 46
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<213> 人工合成
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agaaatttac cctcagatct accatggaag ctagcttgca tgcctg 46
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atggtgagca agggcgag 18
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ttacttgtac agctcgtcca tgc 23
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ctgtaatcaa tccaaatgta agat 24
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ccaattggta aggaaataat tatt 24
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cccggggaca gatcaactgg ccgtgg 26
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gtcgacgaga acacgtagct gtgaaagg 28
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gttccagatt acgctcacgt gatggaaaag ctgaattttg tt 42
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gaagcttact agtgaattca cgtgaaaatg ggcatagcca ct 42

Claims (3)

1.蛋白GsMYST1或与蛋白GsMYST1相关的生物材料在提高大豆耐盐性中的应用，其特征在于，所述应用包括在植物中过表达蛋白GsMYST1或共表达蛋白GsMYST1和GsSnRK1蛋白；所述蛋白GsMYST1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述与蛋白GsMYST1相关的生物材料为编码所述蛋白GsMYST1的核酸分子，含有编码所述蛋白GsMYST1的核酸分子的表达盒，含有编码所述蛋白GsMYST1的核酸分子的重组载体，含有编码所述蛋白GsMYST1的核酸分子的重组微生物中的任意一种；编码所述蛋白GsMYST1的核酸分子是核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的cDNA分子或DNA分子。
2.一种培育具有耐盐性的转基因大豆毛状根的方法，其特征在于，将蛋白GsMYST1的编码基因导入大豆毛状根，或将蛋白GsMYST1的编码基因和GsSnRK1蛋白的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白GsMYST1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。
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