CN110078807B

CN110078807B - 促进钾离子高效吸收的蛋白质及其编码基因

Info

Publication number: CN110078807B
Application number: CN201910359882.3A
Authority: CN
Inventors: 张海纹; 李瑞芬; 江颖; 冯浩
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110078807A

Abstract

本发明公开了促进钾离子高效吸收的蛋白质及其编码基因。本发明公开的促进钾离子高效吸收的蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。在植物中表达本发明的蛋白质可以提高植物的钾离子吸收能力和耐盐性，并且和其他植物的HAK家族基因相比，表现出在低钾条件下对钾的强吸收能力。表明，本发明的蛋白质及其编码基因可以促进钾离子高效吸收，具有广泛的应用前景。

Description

促进钾离子高效吸收的蛋白质及其编码基因

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，促进钾离子高效吸收的蛋白质及其编码基因。

背景技术

目前，植物耐盐碱、耐干旱分子机制的匮乏成为现代农业发展的瓶颈问题，已严重阻碍改良作物育种的发展。应用植物资源培育抗旱抗盐碱等逆境的绿色植物，以达到改善环境、提高作物产量有异同寻常的意义。植物保持钾钠平衡对提高植物的耐盐性具有举足轻重的作用，理解盐胁迫下植物体对钾的高效吸收和利用的分子机制，在农业和环境改善上具有广阔的应用价值。钾是细胞质中最丰富的阳离子，占细胞干重的10％，主要功能包括，酶的辅助因子或激活剂，平衡负电荷，维持区域电中性，控制细胞膜的极性和膜电势，调节渗透势及其后续效应包括维持膨压和水势，带动细胞伸展、延长和物质运输，节律运动和气孔的开闭等，这些维持植物细胞生存所必须的生理功能赋予钾在植物中不可替代的作用。

盐生野大麦(Hordeum brevisubulatum)是大麦属多年生优良牧草，能够在含盐量0.6-1.0％的土地上生长良好，具有非常强的耐盐性。前期生理实验证明，与大麦相比，野大麦的耐盐性主要依赖于能够在高盐条件下维持高的钾钠离子比。目前对野大麦的研究仅仅局限在形态、解剖及生理方面的分析，尚未挖掘出与其高效钾转运相关的关键基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有在低钾条件下促进钾离子吸收能力的蛋白质及其编码基因。

本发明提供的在低钾条件下促进钾离子吸收能力的蛋白质，来源于野大麦(Hordeum brevisubulatum)，名称是HbHAK1，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

与A1)所述蛋白质相比，A2)所述蛋白质中序列1的第345、532、580、665、667 和/或701位氨基酸的氨基酸残基可不变。

与A1)所述蛋白质相比，A2)所述蛋白质中序列1的第170、342、469、520、593、 650、653和/或661位的氨基酸残基可不变。

A2)所述蛋白质可为将序列表中序列1的第13位的丙氨酸残基取代为苏氨酸残基得到的蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的HbHAK1蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的HbHAK1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的HbHAK1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA 分子编码序列1所示的HbHAK1蛋白质。

本发明还提供了与HbHAK1相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码HbHAK1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或 b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2的所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)将序列表中序列2的第37-39位的核苷酸由gcg突变为acg得到的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码HbHAK1的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码HbHAK1的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码HbHAK1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的HbHAK1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码HbHAK1蛋白质且具有HbHAK1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或 85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 (％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和 1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS 中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为： 50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用 2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS 的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

B2)所述的含有编码HbHAK1蛋白质的核酸分子的表达盒(HbHAK1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达HbHAK1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动HbHAK1基因转录的启动子，还可包括终止HbHAK1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP", Chao等人(1999)PlantPhysiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利 200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin 和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg 等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141； Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述HbHAK1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因) 3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCambia1302载体。

B3)所述重组载体具体可为pCambia1302-HbHAK1-GFP。所述 pCambia1302-HbHAK1-GFP为将pCambia1302载体的BglII和SpeI识别序列间的DNA 片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段得到的重组载体，所述 pCambia1302-HbHAK1-GFP能表达序列表中序列1所示的HbHAK1与GFP的融合蛋白质。

所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。

所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)培育钾离子吸收能力增强生物的方法，包括：使受体生物中表达HbHAK1，或提高受体生物中HbHAK1的含量，或提高受体生物中HbHAK1的活性，得到与所述受体植物相比钾离子吸收能力增强的目的生物；

X2)提高生物钾离子吸收能力的方法，包括：使受体生物中表达HbHAK1，或提高受体生物中HbHAK1的含量，或提高受体生物中HbHAK1的活性，得到与所述受体植物相比钾离子吸收能力增强的目的生物，实现生物钾离子吸收能力的增强；

X3)培育耐盐生物的方法，包括：使受体生物中表达HbHAK1，或提高受体生物中HbHAK1的含量，或提高受体生物中HbHAK1的活性，得到与所述受体植物相比耐盐性增强的目的生物；

X4)提高生物耐盐性的方法，包括：使受体生物中表达HbHAK1，或提高受体生物中HbHAK1，或提高受体生物中HbHAK1的活性，得到与所述受体植物相比耐盐性增强的目的生物，实现生物耐盐性的增强。

上述方法中，X1)-X4)所述方法均可通过向所述受体生物中导入HbHAK1的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述HbHAK1的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述HbHAK1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述HbHAK1的编码基因可利用含有所述HbHAK1的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pCambia1302-HbHAK1-GFP。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含HbHAK1蛋白或其编码基因的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了HbHAK1或所述生物材料的下述任一应用：

Y1)调控生物钾离子吸收能力；

Y2)制备调控生物钾离子吸收能力产品；

Y3)提高生物对钾离子的吸收能力；

Y4)制备提高生物对钾离子的吸收能力产品；

Y5)调控生物耐盐性；

Y6)制备调控生物耐盐性产品；

Y7)提高生物耐盐性；

Y8)制备提高生物耐盐性产品；

Y9)生物育种。

本发明还提供了具有如下D1)-D4)中任一功能的产品，所述产品含有HbHAK1 或所述生物材料：

D1)调控生物钾离子吸收能力；

D2)提高生物对钾离子的吸收能力；

D3)调控生物耐盐性；

D4)提高生物耐盐性。

所述产品可以HbHAK1或所述生物材料作为其活性成分，还可将HbHAK1或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

本发明中，所述生物可为下述M1)-M3)中的任一种：

M1)植物或微生物；

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M1)禾本科植物或十字花科植物。

所述钾离子吸收能力可为低钾条件下的钾离子吸收能力。所述低钾条件可为钾离子浓度低于生物正常钾离子需要的环境。所述低钾条件可为大于0小于等于10mM的环境。进一步，所述低钾条件可为大于0小于等于1mM的环境。进一步，所述低钾条件可为大于0小于等于100μM的环境。进一步，所述低钾条件可为大于0小于等于10μM 的环境。

所述耐盐性可为所述低钾条件下的耐盐性。所述耐盐性具体可为耐低钾条件下钠离子含量高于生物正常需要钠离子含量的高钠环境。所述高钠环境可为钠离子含量为50mM-750mM的环境。进一步，所述高钠环境可为钠离子含量为50mM-500mM的环境。更进一步，所述高钠环境可为钠离子含量为50mM-200mM的环境。

所述耐盐性具体可体现在在所述低钾条件下生物维持较高K⁺/Na⁺吸收比的能力。

本发明的HbHAK1主要在根中表达，能够被低钾、高盐、ABA和PEG6000胁迫诱导；其亚细胞定位表明HbHAK1定位在细胞膜上；在酵母突变株中，与其他植物的HAK家族基因相比，其编码蛋白表现出在低钾条件下对钾的强吸收能力；在植物中表达HbHAK1 可有效提高植株的吸钾能力和耐盐性。表明，本发明的HbHAK1及其编码基因具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为阳性HbHAK1转基因植株能够恢复突变体在低钾条件下的生长缺陷表型。A中，MP表示MP液体培养基，10μM K⁺表示10μM钾培养基，100μM K⁺表示100μM钾培养基；B和C中横坐标均为钾离子的添加量，0表示MP液体培养基，10表示10μM钾培养基，100表示100μM钾培养基。

图2为HbHAK1定位于细胞膜上的实验结果。

图3为HbHAK1基因在CY162trk1△trk2△酵母菌株系统中的互补实验。Emptyvector表示不含有HbHAK1基因的空载体(出发载体)。

图4为HbHAK1与HvHAK1的氨基酸序列比对和差异的氨基酸位点。

图5为不同点突变的HbHAK1在酵母突变株中的钾离子转运能力分析。EV表示不含有HbHAK1基因及其突变基因的空载体(出发载体)。每个图中从左至右的稀释度依次为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3。A13T表示HbHAK1第13位的氨基酸由A突变为T，C170A 表示HbHAK1第170位的氨基酸由C突变为A，A650V表示HbHAK1第650位的氨基酸由 A突变为V，E653Q表示HbHAK1第653位的氨基酸由E突变为Q，Q667L表示HbHAK1 第667位的氨基酸由Q突变为L，R342K表示HbHAK1第342位的氨基酸由R突变为K， E345D表示HbHAK1第345位的氨基酸由E突变为D，I469M表示HbHAK1第469位的氨基酸由I突变为M，K520R表示HbHAK1第520位的氨基酸由K突变为R，V532I表示 HbHAK1第532位的氨基酸由V突变为I，M580I表示HbHAK1第580位的氨基酸由M突变为I，L593V表示HbHAK1第593位的氨基酸由L突变为V，E661D表示HbHAK1第661 位的氨基酸由E突变为D，A665--表缺失HbHAK1第665位的A，N701S表示HbHAK1第 701位的氨基酸由N突变为S。

图6为高盐条件下，表达HbHAK1的酵母菌斑对盐的耐受性。每个图中从左至右的稀释度依次为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3。EV表示不含有HbHAK1基因及其突变基因的空载体(出发载体)。A13T表示HbHAK1第13位的氨基酸由A突变为T，C170A表示HbHAK1 第170位的氨基酸由C突变为A，A650V表示HbHAK1第650位的氨基酸由A突变为V， E653Q表示HbHAK1第653位的氨基酸由E突变为Q，Q667L表示HbHAK1第667位的氨基酸由Q突变为L。

图7为HbHAK1在B31(ena1-4△nha1△)酵母菌株表达的互补实验验证。B31-p 表示仅含出发载体的重组菌。每个图中从左至右的稀释度依次为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3。

图8为HbHAK1基因在不同胁迫条件下的表达模式。A-D分别为NaCl、ABA、甘露醇和PEG6000处理不同时间时HbHAK1基因的相对表达量。HbHAK1的相对表达水平：不同处理条件下不同时间点的HbHAK1基因表达值与未处理的0点的差异倍数。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA 的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的野大麦(Hordeum brevisubulatum)(刘树强，优质耐盐牧草— —野大麦，中国草业科学，1987，4(6)：53。)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的拟南芥athak5突变体(Gierth M,

P,Schroeder JI.Thepotassium transporter AtHAK5functions in K⁺ deprivation-induced high-affinityK⁺ uptake and AKT1 K⁺ channel contribution to K⁺ uptake kinetics inArabidopsis roots.Plant Physiol.2005 137(3):1105-1114.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

钾离子转运缺陷型酵母Cy162(CY162trk1△trk2△酵母菌株)(Anderson JA,Huprikar SS,Kochian LV,Lucas WJ,Gaber RF(1992)，Functional expression of aprobable Arabidopsis thaliana potassium channel in Saccharomyces cerevisiae，Proc Natl Acad Sci USA 9:3736–3740)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

B31(ena1-4△nha1△)酵母菌株(Kinclová O,Ramos J,Potier S,Sychrová H.(2001).Functional study of the Saccharomyces cerevisiae Nha1p C-terminus. MolMicrobiol.2001May；40(3):656-68.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、HbHAK1可以促进拟南芥在低钾条件下对钾离子的吸收

本实施例提供了一个来源于野大麦(Hordeum brevisubulatum)的蛋白质，该蛋白质具有促进低钾条件下钾离子的吸收，其名称为HbHAK1，其氨基酸序列为序列表中序列1，CDS序列为序列表中序列2。

一、HbHAK1可以促进拟南芥在低钾条件下对钾离子的吸收

HbHAK1功能检测步骤如下：

1、重组载体的构建

将pCambia1302载体(Zhang H,Zhao FG,Tang RJ,Yu Y,Song J,Wang Y, Li L,Luan S.(2017)Two tonoplast MATE proteins function as turgor-regulatingchloride channels in Arabidopsis.Proc Natl Acad Sci U S A.114:E2036-E2045)的BglII和SpeI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因，得到重组载体，将该重组载体记为 pCambia1302-HbHAK1-GFP，pCambia1302-HbHAK1-GFP能表达序列表中序列1所示的 HbHAK1与GFP的融合蛋白质。

2、转基因植株的构建

将步骤1构建好的pCambia1302-HbHAK1-GFP质粒导入农杆菌GV3101中，利用农杆菌介导的植物转化方法转化受体植物拟南芥athak5突变体植株，得到待果荚成熟后，收集成熟的种子，在抗性(卡纳抗性)板上将收集的种子点上，筛选出阳性HbHAK1 转基因植株。

将pCambia1302转化受体植物拟南芥athak5突变体植株，得到空载对照植株。

3、转基因植株的鉴定

提取步骤2的阳性HbHAK1转基因植株的RNA,反转录为cDNA，利用PCR的方法验证转基因阳性植株，利用空载对照植株和拟南芥athak5突变体植株作为对照。所用引物为：上游引物(HbCIPK2-RT-F：5’-GCTGCTCAGATACAATTTACAAGC-3’)为HbHAK1 基因3’端编码序列中的一段，下游引物(HbCIPK2-RT-R： 5’-GCATTGAACGACTTGGCATCTG-3’)为3’UTR中的一段。以HbADP基因为内标(内标引物为HbADP-F:5′-CAAGAGATAGTATGTGTGCGTATG-3′,HbADP-R:5′- AACCACGGCACAGAAATACTGAT-3′)。

结果(图2中A)显示，与空载对照植株和拟南芥athak5突变体植株相比，阳性HbHAK1转基因植株中HbHAK1基因的表达量显著增加，空载对照植株和拟南芥athak5 突变体植株中HbHAK1基因的表达量无显著差异。

4、转基因植株的表型鉴定

待测植株：两个T2代阳性HbHAK1转基因纯合株系(HbHAK1-1和HbHAK1-2)、空载对照植株、拟南芥athak5突变体植株以及athak5突变体的背景植物—哥伦比亚生态型拟南芥(野生型，Col-0)。

将各待测植株分别置于不同的培养基中进行培养，所用培养为MP液体培养基、10μM钾培养基和100μM钾培养基。MP液体培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在MP液体培养基中的浓度分别为1.0mM Ca(NO₃)₂，0.5mM H₃PO₄，1.25mM HNO₃， 0.5mM MgSO₄，20mM FeNaEDTA，0.5mM CuSO₄，0.5mM MnSO₄，10mM H₃BO₃，0.05mM Na₂MoO₄，0.25mM NaCl和0.5mMZnSO₄)，实验条件下蒸馏水中以及溶质中含有微量钾离子，故MP液体培养基作为极低钾条件培养基；10μM钾培养基为向MP液体培养基中添加氯化钾得到的培养基，氯化钾的添加量为10μM；100μM钾培养基为向MP液体培养基中添加氯化钾得到的培养基，氯化钾的添加量为100μM。

结果如图1中A所示，当在低钾离子条件下(MP液体培养基，)，athak5突变体呈现出严重的生长缺陷，而表达HbHAK1的两个株系(HbHAK1-1和HbHAK1-2)均能够明显回补athak5突变体的表型。随着培养基中钾离子浓度的升高，athak5突变体的生长缺陷表型恢复，与阳性HbHAK1转基因纯合株系和野生型生长类似。空载对照植株的生长状况与athak5突变体植株无明显区别。

进一步通过统计播种7天的各植株的鲜重(每30株的鲜重)和根长(即最长根的长度)，结果分别如图1中B和C所示。钾离子浓度在100μM以下时，athak5突变体的鲜重和根长明显小于野生型(Col-0)，但表达HbHAK1的两个株系(HbHAK1-1和 HbHAK1-2)都能恢复到野生型的状态，鲜重和根长均显著高于空载对照植株。空载对照植株的根长和鲜重与athak5突变体植株无明显区别。

这一实验结果充分表明HbHAK1能够在极低钾条件下促进钾离子的吸收。

5、HbHAK1的亚细胞定位

将上述步骤得到的T2代阳性HbHAK1转基因纯合株系的种子放置植物培养箱避光培养4天，获得黄化的幼苗，然后放置在载玻片上，盖玻片压片，倒置于confocal 显微镜载物台，20倍物镜下观察；观察叶表皮细胞和保卫细胞，GFP荧光的激发光波长为488nm。同时，利用FM4-64染料对植株进行处理，FM4-64染色观察激发光波长为 561nm，用于细胞膜定位的阳性对照。

结果发现，HbHAK1在细胞质膜上有较强的绿色荧光信号，与FM4-64激发的红光位置完全吻合(图2中B)，结果表明HbHAK1定位在细胞膜上。

二、酵母功能互补实验

1、重组载体的构建

将出发载体p424(即文献“Dominik Mumberg,Rolf MulIer and Martin Funk，Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae:comparison oftranscriptional activity and their use for heterologous expression，NucleicAcids Research,1994,Vol.22,No.25 5767-5768”中的p424MET25)的SpeI 和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因，得到重组载体，将该重组载体记为p424-HbHAK1。

2、功能互补实验

将步骤1得到的重组载体p424-HbHAK1,按照标准酵母转化方法导入钾离子转运缺陷型酵母Cy162(CY162 trk1△trk2△酵母菌株)中，在相应氨基酸缺陷型酵母培养基上筛选得到阳性克隆。每个含有目标基因质粒的阳性转化子平板中均挑取3个1mm 大小的单克隆，转接到新的相应的氨基酸缺陷型酵母培养基上，30℃恒温培养箱中倒置培养2天左右。挑取适量活化好的每个菌落溶到一定体积的ddH₂O中，混匀，调菌液浓度一致，按10倍关系进行梯度稀释三次，即稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3。按每个菌斑8μl菌液量，依次吸取各稀释度的菌液点在含不同钾离子浓度(0、100μM、 500μM、1mM、5mM、10mM、50mM)的相应氨基酸缺陷型AP培养基以及在10mM 钾离子基础上再施加50-750mM Na⁺离子的相应氨基酸缺陷型AP培养基上；晾干菌液，于30℃恒温培养箱倒置培养3天，观察酵母菌斑生长情况。其中，各培养基的具体制备方法如下：

1.氨基酸缺陷型酵母培养基配方如下：

Minimal Base 26.7g/L；

-Trp DO Supplement 0.69g/L，或，-Ura DO Supplement 0.77g/L；

Agar 2mg/100mL；

pH:5.8-6.0(利用NaOH调节)。

2.氨基酸缺陷型AP培养基：该培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：

盐：8mM H₃PO₄，2mM MgSO₄，0.2mM CaCl₂，10mM L-Arginine；

微量元素：500μg/L H₃BO₄；50μg/L CuSO₄，100μg/L KI，400μg/L MnSO₄，200μg/LNa₂MoO₄，400μg/L ZnSO₄；

维生素：10μg/L Biotin，400ng/L Nicotinic acid，2mg/L Inositol，400ng/LPantothenic acid；

DO supplement：0.69g/L–Trp DO supplement或0.77g/L–Ura DO supplement；

Dextrose：2mg/100mL；

Agar：2mg/100mL；

pH：6.5(L-Arginine)。

利用大麦HvHAK1基因(AF025292)、拟南芥AtHAK5基因(AT4G13420)、水稻OsHAK5基因(LOC4326945)和谷子SiHAK1基因(Seita.7G082300.1)作为对照。

部分结果如图3所示，HbHAK1具有高效的钾离子转运能力，尤其是在极低钾条件下，其转运活性明显高于已报道的大麦HvHAK1、拟南芥AtHAK5、水稻OsHAK5和前期从谷子中获得的SiHAK1。

三、HbHAK1与HvHAK1的差异氨基酸对HbHAK1的强的转运活性是至关重要的。

大麦HvHAK1是第一个报导的HAK/KUP/KT家族蛋白，作为同一属的野大麦HbHAK1与HvHAK1的蛋白序列相似性达到99％，通过序列比对发现，它们仅有15个氨基酸不同(图4，表1)。为了验证这些差异氨基酸是否为影响HbHAK1转运活性的关键氨基酸位点，发明人通过点突变分别获得了这15个点突变(即将HbHAK1相应位点的氨基酸突变为HvHAK1相应位点的氨基酸，HbHAK1第665位的氨基酸突变方式为缺失)的 HbHAK1酵母表达载体，并将其分别转入酵母突变株Cy162中验证其转运功能(表1)。具体突变方法如下：

点突变1：将HbHAK1第13位的氨基酸由A突变为T；

点突变2：将HbHAK1第170位的氨基酸由C突变为A；

点突变3：将HbHAK1第650位的氨基酸由A突变为V；

点突变4：将HbHAK1第653位的氨基酸由E突变为Q；

点突变5：将HbHAK1第667位的氨基酸由Q突变为L；

点突变6：将HbHAK1第342位的氨基酸由R突变为K；

点突变7：将HbHAK1第345位的氨基酸由E突变为D；

点突变8：将HbHAK1第469位的氨基酸由I突变为M；

点突变9：将HbHAK1第520位的氨基酸由K突变为R；

点突变10：将HbHAK1第532位的氨基酸由V突变为I；

点突变11：将HbHAK1第580位的氨基酸由M突变为I；

点突变12：将HbHAK1第593位的氨基酸由L突变为V；

点突变13：将HbHAK1第661位的氨基酸由E突变为D；

点突变14：将HbHAK1缺失第665位的A；

点突变15：将HbHAK1将第701位的氨基酸由N突变为S。

功能的检测与重组载体、重组菌株的构建方法同步骤二，与步骤二的不同之处在于步骤二所用基因为HbHAK1编码基因，本步骤所用基因为将HbHAK1编码基因进行相应密码子突变而得到的HbHAK1突变基因，HbHAK1突变基因的DNA序列满足：每种 HbHAK1突变基因均编码发生一种上述点突变的蛋白质。各点突变所用HbHAK1突变基因具体如下：

点突变1：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第37-39位的核苷酸由gcg 突变为acg得到的HbHAK1突变基因；

点突变2：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第508-510位的核苷酸由 tgc突变为gcc得到的HbHAK1突变基因；

点突变3：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1948-1950位的核苷酸由gcg突变为gtg得到的HbHAK1突变基因；

点突变4：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1957-1959位的核苷酸由gaa突变为caa得到的HbHAK1突变基因；

点突变5：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1999-2001位的核苷酸由cag突变为ctg得到的HbHAK1突变基因；

点突变6：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1024-1026位的核苷酸由aga突变为aaa得到的HbHAK1突变基因；

点突变7：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1033-1035位的核苷酸由gag突变为gac得到的HbHAK1突变基因；

点突变8：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1405-1407位的核苷酸由atc突变为atg得到的HbHAK1突变基因；

点突变9：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1558-1560位的核苷酸由aag突变为agg得到的HbHAK1突变基因；

点突变10：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1594-1596位的核苷酸由gtc突变为atc得到的HbHAK1突变基因；

点突变11：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1738-1740位的核苷酸由atg突变为atc得到的HbHAK1突变基因；

点突变12：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1777-1779位的核苷酸由ctg突变为gtg得到的HbHAK1突变基因；

点突变13：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1981-1983位的核苷酸由gag突变为gat得到的HbHAK1突变基因；

点突变14：缺失序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第1993-1995位的核苷酸由gcg得到的HbHAK1突变基因；

点突变15：将序列表中序列2所示的HbHAK1编码基因第2101-2103位的核苷酸由aac突变为agc得到的HbHAK1突变基因。

结果发现HbHAK1的第13位的氨基酸A突变成T后，其含有HbHAK1该突变位点的CY162菌株在低钾条件下的生长状态没有明显变化；而其他14个位点的氨基酸突变后，其CY162菌株在低钾条件下的生长均受到不同程度的抑制；当培养基中K⁺浓度为 1mM时，第170、342、469、520、593、650、653、661位的氨基酸突变的HbHAK1，其菌株的生长活性有所提高，而含有其余的6个氨基酸位点突变的HbHAK1的CY162菌株的生长仍然被抑制(图5)。因此，推测这6个氨基酸位点是影响HbHAK1高亲和转运钾离子的活性的最关键的氨基酸位点，这6个位点分别为HbHAK1的第345、532、580、665、667、701位氨基酸。野大麦和大麦的基因有一定的共线性，因此这些差异氨基酸位点对于改良禾本科植物钾离子吸收能力提供了重要的靶点，具有重要的研究价值。

表1、HbHAK1与HvHAK1氨基酸差异位点表

在氨基酸序列中，A表示丙氨酸，C表示半胱氨酸，R表示精氨酸，E表示谷氨酸， I表示异亮氨酸，K表示赖氨酸，V表示缬氨酸，M表示甲硫氨酸，T表示苏氨酸,D表示天冬氨酸，L表示亮氨酸，Q表示谷氨酰胺，N表示天冬酰胺，S表示丝氨酸。

四、高盐胁迫下HbHAK1仍能保持高效的钾离子吸收活性。

盐胁迫能够直接影响植物的生长发育，而在盐胁迫时，植物如果能够吸收更多的钾离子，就会降低钠离子的吸收，从而减少钠离子的毒害作用。为了探索HbHAK1的功能是否受盐浓度的影响，发明人在进一步的实验中，将K⁺浓度定为10mM(不添加其他阳离子)，然后不断增加NaCl的浓度(NaCl在培养基中的浓度分别为50mM、200mM、 500mM和750mM)，观察酵母菌斑的生长情况。

结果如图6所示，随着NaCl浓度的增加，转染空载体(即出发载体)和有突变位点的HbHAK1的酵母菌斑均受到不同程度的生长抑制，而HbHAK1仍能保持良好的生长，甚至在盐浓度达到750mM时，HbHAK1的表达仍能够让酵母菌斑生长。表明，HbHAK1 可以提高酵母的耐盐性。

为了进一步确定HbHAK1的高效吸收钾的功能，发明人将p424-HbHAK1与 p424-AtHAK5转化到Na⁺外向转运缺陷的B31(ena1-4△nha1△)酵母菌株中进行功能验证，方法同步骤二，与步骤二的不同之处在于：将步骤二所用菌株由CY162 trk1△trk2△酵母菌株替换为B31(ena1-4△nha1△)酵母菌株，所用培养基中钾离子浓度为10μM，NaCl浓度为0或50mM。

结果如图7所示，当培养基中加入50mM Na⁺时，表达HbHAK1和AtHAK5的重组菌菌斑未能恢复生长。因此，实验充分表明HbHAK1介导的盐的耐受性是由于其对钾，尤其是在低钾条件下的极高效吸收能力，实现植株维持较高K⁺/Na⁺比的能力。

实施例2、HbHAK1基因表达分析

野大麦幼苗培养至两叶一心时，分别在NaCl、ABA、甘露醇和PEG6000胁迫条件下，在处理0、30min、1hr、3hr、6hr、12hr各时间点取根材料，通过实时荧光定量 PCR分析基因表达情况。各胁迫处理分别为向1/2Hoagland培养液中添加相应物质进行胁迫处理，NaCl、ABA、甘露醇和PEG6000在胁迫处理的培养液中的浓度分别为350mM、 50μM、350mM和15mg/100mL。1/2Hoagland培养液为将Hoagland's营养液中各溶质的浓度减半得到的培养液。实时荧光定量PCR所用引物和内参同实施例1。

通过实时荧光定量PCR试验确定根中的HbHAK1基因在不同非生物胁迫下的诱导表达模式。如图8所示，在营养贫乏的水培条件下，野大麦根中的HbHAK1表达被明显上调(约7倍)，这与大部分已报道的HAK/KUP/KT家族ClusterⅠ基因受低钾条件诱导表达类似；在盐、ABA、甘露醇处理的12个小时期间，随着胁迫时间的延长，野大麦根的HbHAK1的表达在多种胁迫过程中均是被上调的。其中盐胁迫处理6小时，表达上调至7-8倍；ABA处理3小时，表达上调达至22倍，甘露醇胁迫6小时，表达上调至 5-6倍。而与甘露醇处理的情况不同，PEG6000处理下的HbHAK1的表达呈缓慢上调趋势，到12小时上调达到3倍左右。

<110> 北京市农林科学院

<120> 促进钾离子高效吸收的蛋白质及其编码基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 776

<212> PRT

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 1

Met Ser Leu Gln Val Glu Asp Pro Arg Ser Ala Glu Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Leu Lys Arg His Asp Ser Leu Phe Gly Asp Ala Glu Lys Val Ser Asp

20 25 30

Ser Lys His His Gly Ser Gln Val Ser Trp Met Arg Thr Leu Ser Leu

35 40 45

Ala Phe Gln Ser Val Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Ile Gly Thr Ser Pro

50 55 60

Leu Tyr Val Tyr Ser Ser Thr Phe Pro Asp Gly Ile Lys Asn Arg Asp

65 70 75 80

Asp Leu Leu Gly Val Leu Ser Leu Ile Leu Tyr Thr Leu Ile Ile Ile

85 90 95

Pro Met Leu Lys Tyr Val Phe Ile Val Leu Tyr Ala Asn Asp Asn Gly

100 105 110

Asp Gly Gly Thr Phe Ala Leu Tyr Ser Leu Ile Ser Arg Tyr Ala Lys

115 120 125

Ile Arg Leu Ile Pro Asp Gln Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Ser Asn

130 135 140

Tyr His Ile Glu Ala Pro Asn Ser Gln Leu Lys Arg Ala Gln Trp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Lys Leu Glu Ser Ser Lys Ala Cys Lys Ile Val Leu Phe Thr

165 170 175

Leu Thr Ile Leu Gly Thr Ser Met Val Ile Gly Asp Gly Thr Leu Thr

180 185 190

Pro Ala Ile Ser Val Leu Ser Ala Val Ser Gly Ile Arg Glu Lys Ala

195 200 205

Pro Ser Leu Thr Gln Thr Gln Val Val Leu Ile Ser Val Ala Ile Leu

210 215 220

Phe Met Leu Phe Ser Val Gln Arg Phe Gly Thr Asp Lys Val Gly Tyr

225 230 235 240

Thr Phe Ala Pro Val Ile Ser Val Trp Phe Leu Leu Ile Ala Gly Ile

245 250 255

Gly Met Tyr Asn Leu Val Val His Asp Ile Gly Val Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Asn Pro Met Tyr Ile Val Gln Tyr Phe Ile Arg Asn Gly Lys Ser Gly

275 280 285

Trp Val Ser Leu Gly Gly Ile Ile Leu Cys Val Thr Gly Thr Glu Gly

290 295 300

Met Phe Ala Asp Leu Gly His Phe Asn Ile Arg Ala Val Gln Leu Ser

305 310 315 320

Phe Asn Gly Ile Leu Phe Pro Ser Val Ala Leu Cys Tyr Ile Gly Gln

325 330 335

Ala Ala Tyr Leu Arg Arg Phe Pro Glu Asn Val Ala Asn Thr Phe Tyr

340 345 350

Arg Ser Ile Pro Ala Pro Met Phe Trp Pro Thr Phe Ile Val Ala Ile

355 360 365

Leu Ala Ala Ile Ile Ala Ser Gln Ala Met Leu Ser Gly Ala Phe Ala

370 375 380

Ile Leu Ser Lys Ala Leu Ser Leu Gly Cys Met Pro Arg Val Arg Val

385 390 395 400

Ile His Thr Ser His Lys Tyr Glu Gly Gln Val Tyr Ile Pro Glu Val

405 410 415

Asn Phe Leu Met Gly Leu Ala Ser Ile Val Val Thr Val Ala Phe Arg

420 425 430

Thr Thr Thr Ser Ile Gly His Ala Tyr Gly Ile Cys Val Val Thr Thr

435 440 445

Phe Ala Ile Thr Thr His Leu Met Thr Val Val Met Leu Leu Ile Trp

450 455 460

Lys Lys His Val Ile Phe Ile Met Leu Phe Tyr Val Val Phe Gly Ser

465 470 475 480

Ile Glu Leu Ile Tyr Leu Ser Ser Ile Met Ser Lys Phe Ile Glu Gly

485 490 495

Gly Tyr Leu Pro Ile Cys Phe Ala Leu Val Val Met Ser Leu Met Ala

500 505 510

Ala Trp His Tyr Val Gln Val Lys Arg Tyr Trp Tyr Glu Leu Asp His

515 520 525

Ile Val Pro Val Ser Glu Met Thr Met Leu Leu Glu Lys Asn Glu Val

530 535 540

Arg Arg Ile Pro Gly Val Gly Leu Leu Tyr Thr Glu Leu Val Gln Gly

545 550 555 560

Ile Pro Pro Val Phe Pro Arg Leu Ile Gln Lys Ile Pro Ser Val His

565 570 575

Ser Ile Phe Met Phe Met Ser Ile Lys His Leu Pro Ile Ser Arg Val

580 585 590

Leu Pro Thr Glu Arg Phe Ile Phe Arg Gln Val Gly Pro Arg Glu His

595 600 605

Arg Met Phe Arg Cys Val Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Asp Thr Leu Glu

610 615 620

Glu Pro Lys Glu Phe Ala Ala Phe Leu Val Asp Arg Leu Lys Met Phe

625 630 635 640

Ile Gln Glu Glu Ser Ala Phe Ala Leu Ala Gln Asp Glu Glu Glu Ser

645 650 655

Gly Gly Ala Gly Glu Val Ser Asp Ala Ala Gln Ala Arg Pro Arg Arg

660 665 670

Ser Thr Val His Ser Glu Glu Ala Val Gln Gly Gln Ala Arg Val Ser

675 680 685

Ser His Ser Ala Ser Gly Arg Met Ser Phe His Thr Asn Gln Ala Val

690 695 700

Glu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Arg Glu Val Glu Arg Gly Met Val

705 710 715 720

Tyr Leu Met Gly Glu Ala Asn Val Thr Ala Glu Ala Lys Ser Ser Ile

725 730 735

Leu Lys Lys Ile Val Val Asn His Val Tyr Thr Phe Leu Arg Lys Asn

740 745 750

Leu Thr Glu Gly His Lys Val Leu Ala Ile Pro Lys Asp Gln Leu Leu

755 760 765

Lys Val Gly Ile Thr Tyr Glu Ile

770 775

<210> 2

<211> 2331

<212> DNA

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 2

atgtcgctgc aagtcgagga cccgcggagc gcggaggcgc ccgcgccgct caagaggcac 60

gactcgctgt tcggtgacgc ggagaaggtc tccgactcga agcaccatgg gtctcaggtg 120

agctggatgc ggacgctgag cctggctttc cagagcgtgg gcatcatcta cggcgacatc 180

gggacgtcgc cgctctacgt ctactccagc accttcccgg atggcatcaa gaacagggac 240

gatctcctgg gcgtcctctc gctcatcctc tacaccctca tcatcatacc catgctcaag 300

tacgtcttca tcgtgctcta cgccaacgac aacggagatg gtggcacgtt tgcgctctac 360

tccctgatat cacggtacgc gaagatcagg ctgatcccgg accagcaggc agaggatgcg 420

gcggtgtcca attaccacat agaggcacca aactcgcagc tgaagagggc acaatggttg 480

aagcagaagc ttgagtccag caaggcctgc aagattgtgc tcttcaccct caccatcctc 540

ggcacatcaa tggtgatagg cgatggaacc ttgaccccag caatttctgt gctctctgcg 600

gtgagcggga tcagagagaa ggcgccaagc ttgactcaaa cacaagtggt cctcatctcg 660

gtggcgattc tgttcatgct cttctcggtc cagcggttcg ggaccgacaa ggtcgggtac 720

acctttgcgc cggtcatctc agtgtggttc cttctaattg ccggcatcgg gatgtacaac 780

ctcgttgttc acgacatcgg tgttctgcgg gccttcaatc cgatgtatat agtgcaatac 840

ttcataagga acgggaagag tggatgggta tcacttggtg gaattatctt gtgtgtcaca 900

ggcacggaag gcatgtttgc tgacctagga catttcaaca tcagggctgt tcagctcagc 960

ttcaacggca tcctgttccc atcggtggca ctgtgttata tcgggcaggc ggcctacctg 1020

aggagattcc cagagaacgt tgcaaacact ttctatagat ccatcccagc accaatgttc 1080

tggccaacct tcatcgtcgc cattcttgct gccatcatag caagccaagc tatgctctcc 1140

ggtgcgtttg ccatcctctc caaggccctg tctctcggtt gcatgccaag ggttcgagtg 1200

atccacacct cgcacaagta cgaggggcag gtgtacattc ctgaagtgaa cttcctcatg 1260

ggattggcga gcatcgtcgt cacggtcgcc ttccggacga ccaccagcat cggccatgcc 1320

tacgggatct gtgtggtgac cacgtttgcg atcaccaccc acctgatgac cgtcgtcatg 1380

ctgctcatat ggaagaagca cgtcatcttc atcatgctgt tctacgtcgt gttcgggtcc 1440

atagagctga tctacctctc ctccataatg tcgaagttca tcgaaggcgg gtacctcccc 1500

atctgcttcg cgctggtggt gatgagcctg atggcggctt ggcactacgt ccaggtgaag 1560

aggtactggt acgagctcga ccacatcgtg cccgtcagcg agatgacgat gctgctggag 1620

aagaacgagg tgcggcggat ccccggggtg ggcctcctgt acacggagct ggtccagggc 1680

atccccccgg tgttcccccg gctgatccag aagataccgt ccgtgcactc catcttcatg 1740

ttcatgtcga tcaagcacct gcccatctcg cgcgtgctgc ccacggagag gttcatcttc 1800

cggcaggtcg ggccgaggga gcaccggatg ttccggtgcg tggcgcggta cgggtacagc 1860

gacacgctgg aggagcccaa ggaattcgcc gcgttcctcg tggacaggct caagatgttc 1920

atccaggaag agagcgcgtt cgcgctcgcg caggacgaag aggagagcgg cggcgccggt 1980

gaggtttcgg acgcggccca ggcgaggccg aggcgatcca cggtgcacag cgaggaggcg 2040

gtccaaggcc aagcgcgggt gagcagccac tcggcctcag ggaggatgag tttccacacg 2100

aaccaggcgg tggaggagga gaagcagctg attgacaggg aggtggagcg agggatggtg 2160

tatctcatgg gggaggccaa tgtcacggcg gaagccaagt cctccatctt gaagaagatc 2220

gtggtgaacc atgtctacac gttcttgagg aagaacttga cggaggggca caaggtgctg 2280

gccattccca aagaccagct gctcaaagtc gggatcacat acgagatata g 2331

Claims

1.蛋白质，为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B4）中的任一种：

B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.下述任一方法：

X1）培育钾离子吸收能力增强生物的方法，包括：使受体生物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比钾离子吸收能力增强的目的生物；

X2）提高生物钾离子吸收能力的方法，包括：使受体生物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比钾离子吸收能力增强的目的生物，实现生物钾离子吸收能力的增强；

X3）培育耐盐生物的方法，包括：使受体生物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比耐盐性增强的目的生物；

X4）提高生物耐盐性的方法，包括：使受体生物中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的含量，或提高受体生物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到与所述受体植物相比耐盐性增强的目的生物，实现生物耐盐性的增强；

所述生物为单子叶植物或双子叶植物或酵母。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：X1）-X4）所述方法均通过向所述受体生物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

所述生物为单子叶植物或双子叶植物或酵母。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2中B1）所述核酸分子或权利要求3中所述核酸分子。

7.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料的下述任一应用：

Y1）提高生物对钾离子的吸收能力；

Y2）制备提高生物对钾离子的吸收能力产品；

Y3）提高生物耐盐性；

Y4）制备提高生物耐盐性产品；

Y5）耐盐生物育种；

所述生物为单子叶植物或双子叶植物或酵母。

8.具有如下D1）或D2）功能的产品，含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料：

D1）提高生物对钾离子的吸收能力；

D2）提高生物耐盐性；

所述生物为单子叶植物或双子叶植物或酵母。

9.根据权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述生物为禾本科植物或十字花科植物。