CN112813092B

CN112813092B - GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用

Info

Publication number: CN112813092B
Application number: CN202010782419.2A
Authority: CN
Inventors: 崔宇鹏; 于霁雯; 杨书贤; 边盈盈; 裴文锋; 马建江
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN116064654A; CN112813092A

Abstract

本发明公开了GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用。本发明还公开了GbBCCP5蛋白质或与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料在如下m1)‑m5)中任一种中的应用：m1)调控酵母菌甘油三酯含量；m2)调控植物油份含量；m3)构建甘油三酯产量提高的重组酵母；m4)培育油份含量降低的转基因植物；m5)植物育种。本发明对进一步阐明植物种子油份含量分子机理及通过基因工程技术和手段培育高油份含量的作物新品种具有重要的理论和现实意义。

Description

GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用，特别涉及GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控棉籽油份含量及酵母菌甘油三酯含量中的应用。

背景技术

棉花是一种棉、油综合利用的重要经济作物，在我国和世界经济中具有重要地位。棉籽是棉花生产中的主要副产品，其产量为皮棉产量的1.5-2倍。去壳后的棉仁占种子重量的55％-60％，其中油份含量占30％-40％。棉籽油富含人体必须脂肪酸，可作为食用油，也可用于生产生物柴油。一直以来棉花育种研究主要集中在纤维的产量与品质研究方面，而对提高棉籽含油量的研究严重滞后。因此，研究提高棉籽油份含量及改良脂肪酸组分对我国棉花高油育种工作具有重要意义。

油脂合成首先需要脂肪酸在质体中合成，转运到胞质中形成脂酰基池，才能用于内质网的油脂合成。油脂合成受脂肪酸产生的限制，反过来，脂肪酸的生物合成受到乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性的调控。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和油份高低。通过利用基因工程手段提高棉籽油脂含量，对棉花的遗传育种研究具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供GbBCCP5蛋白质或与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了GbBCCP5蛋白质或与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料在如下m1)-m5)中任一种中的应用：

m1)调控酵母菌甘油三酯含量；

m2)调控植物油份含量；

m3)构建甘油三酯产量提高的重组酵母；

m4)培育油份含量降低的转基因植物；

m5)植物育种。

上述应用中，所述GbBCCP5蛋白质来源于海岛棉Gossypium barbadense L.，是如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示的蛋白质：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

A4)与A1)-A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述A2)中的GbBCCP5蛋白质，所述标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述A3)中的GbBCCP5蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A1)-A4)中的GbBCCP5蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述应用中，所述与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码GbBCCP5蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。

进一步的，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GbBCCP5蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GbBCCP5蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。在本发明中，序列表中的序列1由732个脱氧核苷酸组成，是GbBCCP5蛋白质的全长cDNA序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GbBCCP5的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GbBCCP5的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GbBCCP5且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GbBCCP5的核酸分子的表达盒(GbBCCP5基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GbBCCP5的DNA，该DNA不但可包括启动GbBCCP5转录的启动子，还可包括终止GbBCCP5转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子及豌豆rbcS E9终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述GbBCCP5基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的一个实施例中，所述重组载体可为将所述GbBCCP5基因插入载体pYES2的多克隆位点(如BamHI和XhoI酶切位点之间)得到的重组表达载体pYES2-GbBCCP5。在本发明的另一个实施例中，所述重组载体可为将所述GbBCCP5基因部分片段插入pCLCrVA载体的多克隆位点(如SpeI和AscI酶切位点之间)得到的重组表达载体VIGS-VA-GbBCCP5。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述酵母具体可为酿酒酵母(如酿酒酵母INVSc1)，所述细菌可为农杆菌(如根癌农杆菌LBA4404)。在本发明的一个实施例中，所述重组微生物可为携带有重组表达载体pYES2-GbBCCP5的重组酵母INVSC1(pYES2-GbBCCP5)。在本发明的另一个实施例中，所述重组微生物为携带有重组表达载体VIGS-VA-GbBCCP5的重组农杆菌LBA4404(VIGS-VA-GbBCCP5)。

上述应用中，所述调控酵母菌甘油三酯含量具体体现在：当酵母菌中的GbBCCP5蛋白质含量和/或活性提高时，该酵母菌的甘油三酯产量提高；当酵母菌中的GbBCCP5蛋白质含量和/或活性降低时，该酵母菌的甘油三酯产量降低。

所述调控植物油份含量为调控植物种子油份含量，具体体现在：当植物中的GbBCCP5蛋白质含量和/或活性提高时，该植物的种子油份含量提高；当植物中的GbBCCP5蛋白质含量和/或活性降低时，该植物的种子油份含量降低。

所述植物育种的目的是培育高油份含量的作物新品种。

本发明的第二个目的是提供一种甘油三酯产量提高的重组酵母的构建方法。

本发明提供的甘油三酯产量提高的重组酵母的构建方法包括如下步骤：将GbBCCP5蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到甘油三酯产量提高的重组酵母。

进一步的，所述GbBCCP5蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入所述受体酵母中。所述重组表达载体为将GbBCCP5蛋白质的编码基因插入表达载体中得到的载体。

更进一步的，所述GbBCCP5蛋白质的编码基因的核苷酸序列为序列1所示的DNA分子。

所述表达载体可为pYES2载体。所述重组表达载体可为将所述GbBCCP5基因插入pYES2载体的多克隆位点(如BamHI和XhoI酶切位点之间)得到的重组表达载体pYES2-GbBCCP5。

所述受体酵母可为酿酒酵母；所述酿酒酵母具体可为酿酒酵母INVscI。

按照上述方法构建得到的甘油三酯产量提高的重组酵母及其在制备甘油三酯中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供制备甘油三酯的方法。

本发明提供的制备甘油三酯的方法包括将上述重组酵母进行诱导培养的步骤。

进一步的，所述诱导培养包括如下步骤：将上述重组酵母在SD-ura扩增液体培养基中进行活化，待OD_600nm为2.6时离心，收集沉淀物；然后用SD-ura诱导液体培养基重悬所述沉淀物，使培养体系的OD_600nm为1.3，在摇床上进行诱导培养，离心，收集菌体沉淀；所述菌体沉淀中含有甘油三酯。

更进一步的，所述诱导培养具体可按照如下步骤进行：将上述重组酵母在30mL的SD-ura扩增液体培养基中进行活化，待OD_600nm为2.6时，室温5000rpm离心5min，收集沉淀物，用60mL的SD-ura诱导液体培养基重悬所述沉淀物，使培养体系的OD_600nm为1.3，在30℃摇床上180rpm/min诱导培养，培养24-48h后5000rpm离心5min，收集菌体沉淀；所述菌体沉淀中含有甘油三酯。

本发明的最后一个目的是提供一种培育油份含量降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育油份含量降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中GbBCCP5蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的油份含量低于所述受体植物。

上述方法中，所述降低受体植物中GbBCCP5蛋白质的含量和/或活性的方法是通过沉默所述受体植物中GbBCCP5蛋白质的编码基因来实现；

所述GbBCCP5蛋白质的编码基因的核苷酸序列为序列1所示的DNA分子。

进一步的，沉默所述受体植物中GbBCCP5蛋白质的编码基因方法是通过向受体植物中导入GbBCCP5基因沉默载体和辅助载体来实现。

更进一步的，所述GbBCCP5基因沉默载体为将序列1第1-320位所示的DNA分子插入pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变后得到的载体；所述辅助载体为pCLCrVB载体。

上述方法中，所述转基因植物的油份含量低于所述受体植物具体体现在转基因植物的棉籽油份含量低于所述受体植物。

上述GbBCCP5基因沉默载体或序列1第1-320位所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。

上述GbBCCP5基因沉默载体或序列1第1-320位所示的DNA分子在培育含油量降低的转基因棉花中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述双子叶植物可为棉花。更进一步的，所述棉花具体可为海岛棉(如海岛棉Hai 7124)。

本发明从海岛棉Hai 7124中克隆得到GbBCCP5基因。本发明成功构建了pYES2::GbBCCP5酵母表达载体，并在酿酒酵母中异源过表达GbBCCP5基因，诱导表达实验结果表明：与转空载体酵母相比，过表达GbBCCP5基因的重组酵母中的甘油三酯含量显著提高。本发明还成功构建了病毒诱导GbBCCP5基因沉默载体，并转化海岛棉Hai 7124，共获得4个GbBCCP5沉默棉花阳性单株。实验结果表明：与转空载体棉花相比，GbBCCP5沉默棉花阳性单株的棉籽油份含量显著降低。说明GbBCCP5基因可调控植物含油量，尤其是种子含油量。本发明对进一步阐明植物种子含油量分子机理及通过基因工程技术和手段培育种子高含油量的作物新品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为GbBCCP5基因的克隆。

图2为将BamHI-XhoI酶切的质粒pYES2与目的基因GbBCCP5进行体外连接。

图3为PCR鉴定阳性重组酵母株系。注：M为DNA分子标记MarkerIII，1-10为重组酵母INVSC1(pYES2-GbBCCP5)PCR产物。

图4为GbBCCP5基因在转基因酵母株系中的表达量。

图5为甘油三酯酶法测定酵母甘油三酯含量。

图6为转空载体棉花中VA和VB引物检测结果。注：A：转空载体棉花中VA引物检测结果；B：转空载体棉花中VB引物检测结果。

图7为GbBCCP5沉默棉花中VA和VB引物检测结果。注：1-4为GbBCCP5沉默棉花中VA引物检测结果；5-8为GbBCCP5沉默棉花中VB引物检测结果。

图8为qRT-PCR检测GbBCCP5基因在GbBCCP5沉默棉花中的表达量。对照为3个转空载体棉花株系；VIGS为4个GbBCCP5沉默棉花株系。

图9为核磁共振检测棉籽含油量。对照为3个转空载体棉花株系；VIGS为4个GbBCCP5沉默棉花株系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的生物材料及试剂盒来源如下：植物总RNA提取试剂盒(DP432)是天根生化(科技)北京有限公司的产品。RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix(AT311-02)、荧光定量酶TransStart Top GreenqPCR SuperMix(AQ131-04)、克隆载体pEASY-T5Zero Cloning Kit(CT501-01)和质粒提取试剂盒EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit(EM111-01)均是北京全式金生物技术有限公司的产品。高保真PCR扩增酶KOD-Plus-Neo(KOD-401)是TOYOBO生物公司的产品。DNAFragment Purification Kit ver4.0胶回收试剂盒和DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒均是TaKaRa生物公司的产品。infusion连接酶是诺唯赞生物技术有限公司的产品。酵母总RNA提取试剂盒(RNAprep pure)是Promega公司的产品。大肠杆菌感受态菌体DH5α是上海生工的产品。限制性内切酶BamHI、XhoI、SpeI和AscI均是NEB公司的产品。组织甘油三酯测定试剂盒(E1013)是北京普利莱基因技术有限公司的产品。酿酒酵母INVSc1感受态细胞是上海唯地生物技术有限公司的产品，货号为YC1050。农杆菌LBA4404感受态细胞是上海唯地生物技术有限公司的产品，货号为AC1030。酵母表达载体pYES2是优宝生物的产品，货号为VT1351。

下述实施例中的药品来源如下：琼脂糖是北京全式金生物技术有限公司的产品。蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等均是国产分析纯的产品。氨苄青霉素(IA0340)、卡那霉素(YZ-130556)、利福平(IR0110)、链霉素(IS0360)、蔗糖(YZ-4454)、棉籽糖(D8180)、半乳糖(YZ-4117A)均是北京索莱宝科技有限公司的产品。

下述实施例中的主要仪器如下：PCR扩增仪(BIO-RAD)、电泳设备(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、高速离心机(Hettich MIKRO200R)、酶标仪(BIO-TEC KC4)、真空冷冻干燥仪(ALPHA I-5)、用于测定棉籽油份含量的纽迈核磁共振仪器(NMI20-Analyst)。

下述实施例中的培养基配方如下：

LB液体培养基配方如下：酵母提取物(Yeast extract)5g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L和氯化钠(NaCl)10g/L，最后用ddH₂O定容至1L。

LB固体培养基配方如下：酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，最后用ddH₂O定容至1L。

酿酒酵母菌体扩增液体培养基(SD-ura扩增液体培养基)的配方如下：称取酵母缺陷型培养基SD-ura(酵母缺陷型培养基SD-ura是北京索莱宝科技有限公司的产品，货号为S0620)8g放入900mL的超纯水中，调pH到5.8，121℃高压灭菌15min，待温度降至约55℃时加入100mL除菌后浓度为20％的葡萄糖溶液。

酿酒酵母菌体扩增固体培养基(SD-ura扩增固体培养基)的配方如下：称取酵母缺陷型培养基SD-ura 8g和琼脂粉20g放入900mL的超纯水中，调pH到5.8，121℃高压灭菌15min，待温度降至约55℃时加入100mL除菌后浓度为20％的葡萄糖溶液。

酿酒酵母蛋白诱导液体培养基(SD-ura诱导培养基)的配方如下：称取酵母缺陷型培养基SD-ura 8g放入900mL的超纯水中，调pH到5.8，121℃高压灭菌15min，待温度降至约55℃时加入100mL除菌后浓度为20％的半乳糖溶液和100mL除菌后浓度为10％的棉籽糖溶液。

本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。

下述实施例中的载体pCLCrVA(以下简称VA)和辅助载体pCLCrVB(以下简称VB)均记载于文献“A versatile system for functional analysis of genes and microRNAsin cotton)”中，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的海岛棉Hai 7124记载于文献“Yupeng Cui,Jianjiang Ma,Guoyuan Liu,Nuohan Wang,Wenfeng Pei,Man Wu,Xingli Li,Jinfa Zhang,Jiwen Yu,Genome-wide identification,sequence variation and expression of the glycerol-3-phosphate acyltransferase(GPAT)gene family in Gossypium,Frontiers inGenetics,10,116,2019-2-20.”中，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、棉花GbBCCP5基因的克隆

1、RNA的提取

采用天根公司的植物总RNA提取试剂盒提取海岛棉Hai 7124开花后10、20和30天的胚珠的总RNA。

2、cDNA的获得

以提取的各时期棉花胚珠混合总RNA(1000ng)为模板，利用全式金公司的反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

3、PCR扩增

将反转录产物cDNA溶液稀释6倍作为PCR反应模板，采用GbBCCP5-F和GbBCCP5-R引物进行PCR，得到PCR产物。引物序列如下：

GbBCCP5-F：5′-ATGATTTTGGCTAGAGGATCTG-3’；

GbBCCP5-R：5′-TCAAGGTTCAATCACGAACAGAG-3’。

PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增程序如表2所示。

表1

表2

Step1	Predenature	94℃,2min
			Step2	Denature	98℃,10s
Step3	Annealing	59℃,30s
			Step4	Estension	68℃,25s
Step5	Estension	68℃,5min

备注：从Step2到step4进行32次循环扩增。

4、PCR扩增产物检测

通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测步骤3获得的PCR扩增产物，得到大小为732bp的PCR扩增产物(图1)。

5、测序

利用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit ver4.0对目的片段进行纯化回收。将胶回收的产物连接pEASY-T5克隆载体(克隆载体pEASY-T5Zero CloningKit中的产品)并转化大肠杆菌感受态DH5α。37℃过夜培养从kan抗性LB培养基上挑取单克隆到含有kan的600μl LB培养基中37℃摇菌过夜培养。将含有目的基因片段大小条带的菌液送测序，将测序正确的克隆命名为pEASY-GbBCCP5。

测序结果表明，该阳性克隆载体(pEASY-GbBCCP5)为在pEASY-T5克隆载体中插入了序列表中序列1所示的核苷酸序列后得到的载体。将序列表中序列1所示的基因命名为GbBCCP5，该基因编码的蛋白命名为GbBCCP5，该蛋白含有243个氨基酸，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、异源过表达GbBCCP5基因对酿酒酵母中甘油三酯含量的影响

一、重组酵母的构建

1、pYES2::GbBCCP5酵母表达载体的构建

(1)目的基因ORF序列的扩增

根据终载体pYES2的图谱设计BamHI-XhoI为插入位点(图2)并合成引物。引物序列如下：

GbBCCP5-BamHI-F：5’-ttcggatccGCCACCATGATTTTGGCTAGAGGATCTG-3’(划线部分含有限制性内切酶BamHI的识别序列)；

GbBCCP5-XhoI-R：5’-atcctcgagTCAAGGTTCAATCACGAACAGAG-3’(划线部分含有限制性内切酶XhoI的识别序列)。

以实施例1中阳性克隆质粒pEASY-GbBCCP5为模板，采用GbBCCP5-BamHI-F和GbBCCP5-XhoI-R引物使用KOD-Plus-Neo高保真酶进行PCR，扩增得到含有BamHI和XhoI酶切位点的GbBCCP5目的片段。

PCR反应体系如表3所示。

表3

ddH<sub>2</sub>0	30μl
		模板	2μl
正向引物GbBCCP5-BamHI-F(10μM)	2μl
		反向引物GbBCCP5-XhoI-R(10μM)	2μl
2mM dNTPs	5μl
		25mM MgSO<sub>4</sub>	3μl
10×PCR Buffer for KOD-PLUS-Neo	5μl
		KOD-Plus-Neo	1μl
总体积	50μl

PCR反应所需条件设置为：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸25s，32个循环；68℃延伸10min。

(2)融合表达载体的构建

1)用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切酵母表达载体pYES2，回收载体骨架。

2)回收纯化含有BamHI和XhoI酶切位点的GbBCCP5目的片段，并用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切该回收产物。

3)将步骤1)获得的载体骨架和步骤2)获得的回收产物连接，得到连接产物。

4)将步骤3)获得的连接产物热激转化大肠杆菌DH5α，37℃培养箱倒置过夜培养，挑阳性克隆测序；测序结果正确的克隆命名为pYES2::GbBCCP5酵母表达载体。

2、转化酿酒酵母感受态INVSc1

将pYES2::GbBCCP5酵母表达载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到重组酵母INVSc1(pYES2::GbBCCP5)。

将pYES2空载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到对照酵母INVSc1(pYES2)。

具体转化步骤如下：a、取100μl冰上融化的酿酒酵母感受态细胞INVSc1，依次加入预冷的目的质粒pYES2::GbBCCP5 2-5μg、Carrier DNA(优宝生物，货号为VT1351)(95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μl和PEG/LiAc(优宝生物，货号为VT1351)500μl并吸打混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。b、42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。c、5000rpm离心40s，弃上清，ddH₂O400μl重悬菌体，5000rpm离心30s，弃上清。d、ddH₂O50μl重悬菌体，重悬后的菌液涂在SD-ura扩增固体培养基上，随后置于29℃恒温培养箱培养48-96h。

3、阳性重组酵母的鉴定

挑取酵母单克隆置于1ml的SD-ura扩增液体培养基中，30℃，300rpm/min过夜培养后用pYES2载体特异引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和CYC1：5’-GTGACATAACTAATTACATGATG-3’对菌液进行PCR鉴定。PCR扩增得到大小为732bp的目的条带的克隆为阳性克隆。鉴定结果如图3所示。

随机选取三个阳性克隆重组酵母命名为重组酵母INVscI(pYES2::GbBCCP5)OE1-重组酵母INVscI(pYES2::GbBCCP5)OE3，用于下述诱导表达及甘油三酯含量分析实验。

二、重组酵母的诱导表达、表达量分析及甘油三酯含量测定

1、重组酵母的诱导表达

将鉴定正确的阳性重组酵母INVscI(pYES2::GbBCCP5)OE1-重组酵母INVscI(pYES2::GbBCCP5)OE3和对照酵母INVscI(pYES2)(CK)在30ml的SD-ura扩增液体培养基中分别进行活化，待OD_600nm为2.6时，室温5000rpm离心5min，弃除上清并收集沉淀物；用60ml的SD-ura诱导培养基重悬沉淀物，使重组酵母株系、对照酵母的培养体系的OD_600nm均为1.3，然后在30℃摇床、180rpm/min条件下进行诱导培养。

2、qRT-PCR验证GbBCCP5基因表达

诱导培养24h后5000rpm离心5min，收集菌体沉淀。通过酵母RNA提取试剂盒(R6870-01，郑州千汇基商贸有限公司)提取菌体沉淀中的RNA，反转录cDNA。将得到的cDNA稀释4倍后作为qRT-PCR的模板，采用GbBCCP5-qF1和GbBCCP5-qR1引物进行qRT-PCR。以18S为内参基因。引物序列如下：

GbBCCP5-qF1：5’-TTTTGGCTAGAGGATCTGTTTTC-3’；

GbBCCP5-qR1：5’-GGATGACCCTGAATTGACTGG-3’；

18SF：5’-TTAGTTGGTGGAGTGATTTG-3’；

18SR：5’-GGTGGCTCTGTCAGTGTAG-3’。

结果如图4所示，结果表明：3个阳性重组酵母中GbBCCP5基因相对表达量显著高于对照酵母。

3、甘油三酯含量测定

诱导培养48h后5000rpm离心1min，收集菌体沉淀，并用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次菌体，最后放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥。干燥后采用甘油三酯酶法测定试剂盒(E1013，北京普利莱基因技术有限公司)测定各酵母菌体沉淀中的甘油三酯含量。

结果如图5所示。结果表明：对照酵母CK和3个阳性重组酵母OE1、OE2和OE3的甘油三酯含量分别为2719.00umol/L、4167.33umol/L、4145.67umol/L和3922.33umol/L。与对照酵母CK相比，3个阳性重组酵母OE1、OE2和OE3中的甘油三酯含量分别提高了53.27％、52.47％和44.26％。说明GbBCCP5基因可调控酵母菌甘油三酯含量。

实施例3、GbBCCP5沉默棉花的获得及棉籽含油量分析

一、GbBCCP5沉默棉花的获得

1、VIGS-VA-GbBCCP5沉默载体的构建

(1)根据终载体VA的图谱设计SpeI-AscI为插入位点并合成引物，引物序列如下：

GbBCCP5-vigsF1：ATGCCTGCAGACTAGTATGATTTTGGCTAGAGGATCTG(下划线所示的序列含有限制性内切酶SpeI的识别序列和载体上的片段)；

GbBCCP5-vigsR1：TAGACCTAGGGGCGCGCCACATTTTTGCGAATTATCAGTTC(下划线所示的序列含有限制性内切酶AscI的识别序列和载体上的片段)。

(2)以实施例1中阳性克隆质粒pEASY-GbBCCP5为模板，采用GbBCCP5-vigsF1和GbBCCP5-vigsR1引物进行PCR扩增，获得长度为320bp的特异V-GbBCCP5片段(序列1第1-320位)，并纯化回收该片段。

(3)用限制性内切酶SpeI和AscI双酶切VA载体，纯化回收线性化的VA载体。用infusion酶将特异V-GbBCCP5片段与线性化的VA载体连接，得到连接产物。

(4)将连接产物热激转化大肠杆菌DH5α，放置37℃培养箱倒置过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果正确的克隆命名为VIGS-VA-GbBCCP5沉默载体。

VIGS-VA-GbBCCP5沉默载体是将大小为320bp的特异V-GbBCCP5片段插入VA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持VA载体的其他序列不变后得到的载体。

2、重组农杆菌的构建

将VIGS-VA-GbBCCP5沉默载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到重组农杆菌LBA4404(VIGS-VA-GbBCCP5)，记作VIGS-VA-GbBCCP5菌液。

将VA载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到重组农杆菌LBA4404(VA)，记作VA菌液。

将VB辅助载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到重组农杆菌LBA4404(VB)，记作VB菌液。

具体转化过程如下：根癌农杆菌LBA4404感受态细胞100μl中加入目的质粒1μg，混匀后冰浴30min；液氮速冻75s，37℃热激2-6min；冰浴5min，再加入500μl LB液体培养基；180rpm，28℃培养4h后取100μL菌液涂在含有卡那霉素(50mg/L)、链霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)的LB固体培养基上，28℃培养大约2-3天；挑选阳性克隆，在含有卡那霉素(50mg/L)、链霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)的LB液体培养基上28℃培养48h，-20℃保存备用。

3、幼叶注射法转化棉花

(1)分别将VIGS-VA-GbBCCP5菌液、VA菌液和VB菌液在含有利福平、卡那霉素和链霉素的LB液体培养基中，28℃，190rpm过夜培养16小时，使OD_600nm值在1.5-2.0范围。

(2)将OD_600nm值在1.5-2.0范围的各菌液4000rpm离心10min，弃上清，回收菌体沉淀，用转化介质(配方如表4)重悬沉淀至菌液OD_600nm＝1.5。

表4

(3)将OD_600nm＝1.5的VB菌液与OD_600nm＝1.5的VA菌液等体积混匀，室温(25℃)静置3h，得到对照组侵染液。

将OD_600nm＝1.5的VB菌液与OD_600nm＝1.5的VIGS-VA-GbBCCP5菌液等体积混匀，室温(25℃)静置3h，得到实验组侵染液。

(4)分别用对照组侵染液和实验组侵染液侵染Hai 7124棉花材料，得到转空载体棉花和GbBCCP5沉默棉花。具体方法如下：拿针头划伤种植两周后子叶展平的Hai7124棉花子叶背面，用1ml无菌注射器吸取对应菌液往划伤的子叶中注满菌液(注入量约为1mL)。

(5)注射后黑暗过夜培养棉株，随后置于25℃培养室在16h光照/8h黑暗的光照周期下正常培养。

4、阳性棉花株的鉴定

对病毒侵染约30天后的棉花取其倒三叶，提取DNA，并进行PCR检测。所用引物序列如下：

CLCrVA-F：5’-ATTTTGCGCCTGACTAGCCT-3’；

CLCrVA-R：5’-CGAATTTTCAACGTTGCATACA-3’；

CLCrVB-F：5’-ATGTACAGTTTAAAGAGTAGACG-3’；

CLCrVB-R：5’-ATTATCCAATATAATCAAGGTCATAC-3’。

结果如图6和图7所示。结果表明：CLCrVA-F/CLCrVA-R引物和CLCrVB-F/CLCrVB-R引物在转空载体棉花(对照棉花株系)中分别扩增得到大小为214bp和771bp的片段。CLCrVA-F/CLCrVA-R引物和CLCrVB-F/CLCrVB-R引物在GbBCCP5沉默棉花阳性株系中分别扩增得到大小为534bp和771bp的片段。最终共得到3个对照棉花株系和4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系。

5、GbBCCP5基因表达量的检测

在3个对照棉花株系和4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系开花当天进行挂牌，取开花后25天的胚珠，提取RNA并反转录获得cDNA，以其为模板，采用实施例2步骤二的2中的GbBCCP5-qF1和GbBCCP5-qR1引物进行GbBCCP5基因沉默效率检测，以GbUBQ7F和GbUBQ7R为内参基因引物。

GbUBQ7F：5’-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3’；

GbUBQ7R：5’-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3’。

结果如图8所示。结果表明：3个对照棉花株系中GbBCCP5基因的相对表达量分别为1.0、1.07、1.12，平均表达量为1.06；4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系中GbBCCP5基因的相对表达量分别为0.87、0.69、0.39、0.77，平均表达量为0.68。与3个对照棉花株系中GbBCCP5基因的平均表达量相比，GbBCCP5在4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系中的平均表达量下降了38.33％。

二、棉籽油份含量检测

测定3个对照棉花株系和4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系的棉籽油份含量。具体步骤如下：按单株收获3个对照棉花株系和4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系中部位置的棉籽，并分别进行单株棉籽油份含量测定，每个株系油份含量测定3个重复。棉籽油份含量测定仪器为纽迈核磁共振仪器(NMI20-Analyst)，具体测定方法按照仪器使用说明书进行操作。

结果如图9所示。结果表明：3个对照棉花株系的棉籽油份含量分别为22.75％、22.69％、21.78％，平均油份含量为22.41％，而4个GbBCCP5沉默棉花阳性株系的棉籽油份含量分别为19.66％、16.43％、12.57％和16.91％，平均油份含量为16.39％。与对照棉花株系相比，GbBCCP5基因被沉默后的棉花棉籽平均油份含量降低了6.01％。说明GbBCCP5基因可调控棉籽油份含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>732

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

atgattttgg ctagaggatc tgttttcaaa ttttcctccc ttcctggaca tgctttggga 60

tcatctgttg ccttcaaggt tgctgtagat ggatcatcaa atgattctac tatccctcca 120

gtcaattcag ggtcatccac accagaacca caggatgcta agccatcaag taatgtctct 180

cctccagctt tggccacaga agaatcaatc tcagagttcc ttaatcaagt ttcaagtcta 240

gtcaagctag ttgattcgag agatattgta gagttgcagc ttaaacaact tgactgtgaa 300

ctgataattc gcaaaaatgt ggccttgccc caaccaccct ctgcagctcc tgttgttatg 360

tcgcaggcat cctctctacc accagtaggg cctccaaccc aaactgcccc tgcctctgcc 420

cctacacctt ctgggcaagc acctgctgtt gcaactccac catcttttcc agctcccaag 480

tcagccaaat ctttgcttcc acctcttaag tgtccaatgg ctggtacatt ctacacaagt 540

ccgggtcctg gtgaaccacc atttgtgaag gttggagaca aagtgcaaaa gggtcaggtg 600

ttatgcatca ttgaagcaat gaagttgatg aatgaaattg aagctgatca atcaggaacc 660

atagtcgaga tccttgtaga agatggcaaa gctgtcagtg ttgatacgcc tctgttcgtg 720

attgaacctt ga 732

<210>2

<211>243

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Met Ile Leu Ala Arg Gly Ser Val Phe Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly

1 5 10 15

His Ala Leu Gly Ser Ser Val Ala Phe Lys Val Ala Val Asp Gly Ser

20 25 30

Ser Asn Asp Ser Thr Ile Pro Pro Val Asn Ser Gly Ser Ser Thr Pro

35 40 45

Glu Pro Gln Asp Ala Lys Pro Ser Ser Asn Val Ser Pro Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Thr Glu Glu Ser Ile Ser Glu Phe Leu Asn Gln Val Ser Ser Leu

65 70 75 80

Val Lys Leu Val Asp Ser Arg Asp Ile Val Glu Leu Gln Leu Lys Gln

85 90 95

Leu Asp Cys Glu Leu Ile Ile Arg Lys Asn Val Ala Leu Pro Gln Pro

100 105 110

Pro Ser Ala Ala Pro Val Val Met Ser Gln Ala Ser Ser Leu Pro Pro

115 120 125

Val Gly Pro Pro Thr Gln Thr Ala Pro Ala Ser Ala Pro Thr Pro Ser

130 135 140

Gly Gln Ala Pro Ala Val Ala Thr Pro Pro Ser Phe Pro Ala Pro Lys

145 150 155 160

Ser Ala Lys Ser Leu Leu Pro Pro Leu Lys Cys Pro Met Ala Gly Thr

165 170 175

Phe Tyr Thr Ser Pro Gly Pro Gly Glu Pro Pro Phe Val Lys Val Gly

180 185 190

Asp Lys Val Gln Lys Gly Gln Val Leu Cys Ile Ile Glu Ala Met Lys

195 200 205

Leu Met Asn Glu Ile Glu Ala Asp Gln Ser Gly Thr Ile Val Glu Ile

210 215 220

Leu Val Glu Asp Gly Lys Ala Val Ser Val Asp Thr Pro Leu Phe Val

225 230 235 240

Ile Glu Pro

Claims

1.GbBCCP5蛋白质或与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料在如下m1)或m2)中的应用：

m1)提高酿酒酵母甘油三酯含量；

m2)构建甘油三酯产量提高的重组酿酒酵母；

所述与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码GbBCCP5蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GbBCCP5蛋白质是如下A1)或A2)所示的蛋白质：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

或，所述与GbBCCP5蛋白质相关的生物材料B1)所述核酸分子如序列1所示。

3.一种甘油三酯产量提高的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：将权利要求1中所述的GbBCCP5蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到甘油三酯产量提高的重组酿酒酵母。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述GbBCCP5蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入所述受体酵母中；

所述重组表达载体为将GbBCCP5蛋白质的编码基因插入表达载体中得到的载体；所述表达载体为pYES2载体；

或，所述GbBCCP5蛋白质的编码基因为序列1所示的DNA分子。

5.按照权利要求3或4所述的方法构建得到的甘油三酯产量提高的重组酿酒酵母。

6.权利要求5所述的重组酿酒酵母在制备甘油三酯中的应用。

7.制备甘油三酯的方法，包括将权利要求5所述的重组酿酒酵母进行诱导培养的步骤。