CN112143746A

CN112143746A - 一种提高植物抗病性的基因GmAP5及其应用

Info

Publication number: CN112143746A
Application number: CN202011060912.XA
Authority: CN
Inventors: 王源超; 夏业强
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112143746B

Abstract

本发明公开了一种提高植物抗病性的基因GmAP5及其应用，属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，本发明涉及一种植物源抗病基因GmAP5及其重组表达载体和应用。该基因来源于大豆，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。过表达该基因显著性促进大豆对大豆疫霉菌的抗病性，是一种理想的增强植物抗病性的基因。通过遗传转化的方法使该基因在大豆或烟草中表达使其获得对多种病原菌的抗性能力，从而可以提高作物田间抗病性。本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面。

Description

一种提高植物抗病性的基因GmAP5及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及一种提高植物抗病性的基因GmAP5及其应用。

背景技术

卵菌(Oomycete)隶属于藻菌界(Stramenopiles)，包含大量植物和动物病原菌，给农业生产和生态环境带来巨大威胁。大豆疫霉(Phytophthora sojae)是卵菌中重要的植物病原菌，主要侵染大豆根茎部引起大豆根茎腐烂病，每年给世界造成约20亿美元的经济损失，严重威胁着大豆生产。大豆疫霉根腐病在80年代后期首次传入中国，随后在中国大部分地区快速扩散，并成为东北和福建大豆主产区的主要病害之一。目前该病菌在中国黑龙江、江苏、河南、安徽等20多个省均有分布，对当地的大豆生产已经造成了不同程度的危害。因此，改良作物抗病性，对有效控制作物疫病从而保障粮食安全生产具有重要的意义。

目前，农业生产中主要采取使用种植抗病品种的策略来防控作物疫病的发生。抗病品种中含有一类针对特定疫霉菌小种的抗病基因。但是这类抗病蛋白具有高度专一性，只能识别特定的某些疫霉菌小种含有的无毒基因。而疫霉菌在进化过程中通过丢失或沉默这些无毒基因，逃避植物抗病蛋白的识别，导致抗病基因失效从而爆发作物疫病。因此，研究开发对疫霉菌具有广谱持久抗病性的基因，是提高作物抗病性的有效途径之一。

质外体空间是病原菌和寄主进行互作和竞争的重要战场。在病原菌和寄主互作的过程中，植物在质外体与病原菌进行了多层次的“军备竞赛”并形成了一系列的防卫系统，植物质外体蛋白酶是植物应答非生物胁迫的重要组成部分。植物分泌型蛋白酶主要包括半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，以及金属蛋白酶。植物天冬氨酸蛋白酶是植物蛋白酶类非常重要的亚家族成员，参与前体蛋白的加工，蛋白质的降解，以及细胞程序性死亡(PCD)过程，同时也参与植物对病原微生物的抗性。拟南芥基因组中的一类天冬氨酸蛋白酶(Constitutive disease resistance 1,CDR1)在病原菌侵染时，在质外体大量积累，参与了植物抗病过程；水稻OsCDR1是拟南芥CDR1的同源基因，过表达OsCDR1增强水稻对稻瘟病菌的抗性。近期研究表明，在大豆中过表达天冬氨酸蛋白酶(GmAP5)能够提高寄主对大豆疫霉的抗性，大豆疫霉的效应子Avh240通过定位在植物细胞膜上形成同源二聚体来抑制GmAP5的分泌。因此分泌型天冬氨酸蛋白酶是植物在质外体参与植物抗性的重要组成成分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因GmAP5及其编码的蛋白和应用。

本发明的另一目的在于提供一种沉默基因GmAP5的片段。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基因GmAP5，该基因为如下(1)或(2)：

(1)具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1具有70％以上同源性的核苷酸序列；优选为具有80％以上同源性的核苷酸序列；进一步优选为具有90％以上同源性的核苷酸序列。

上述的基因GmAP5编码的蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种密码子优化的如SEQ ID NO.2所示蛋白的编码基因，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。利用本发明的基因GmAP5编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。

含有上述基因GmAP5或上述密码子优化的基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

上述的重组表达载体是将所述的基因GmAP5或密码子优化的基因插入到含有C-端eGFP的双元载体pBin-eGFP酶切位点SmaI中得到的载体pBin-GmAP5-eGFP。

使用上述的基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

上述的转基因细胞系是由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记等。

用于扩增所述基因GmAP5的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。用于扩增基因GmAP5全长的引物对包括正向引物F和反向引物R；所述正向引物F的序列如SEQ ID No.4所示；所述反向引物R的序列如SEQ ID No.5所示。

一种沉默基因GmAP5的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

含有上述沉默基因GmAP5的片段的重组沉默载体。构建该重组沉默载体的出发沉默载体优选为植物转化质粒，可以为沉默载体pFGC5941。

作为一种优选技术方案，该重组沉默载体是将沉默基因GmAP5的特异性片段插入到沉默载体pFGC5941酶切位点AscI和BamHI中得到的载体pFGC::RNAi-GmAP5。

本发明还提供了上述基因GmAP5、由上述基因GmAP5编码的蛋白质、上述的密码子优化的基因或者上述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。

所述的提高植物免疫抗性或抗病性是提高植物对致病菌的免疫抗性或提高植物抗致病菌引起的病害。进一步的，本发明所述致病菌为能够侵染主要粮食及经济作物的致病菌，可以为卵菌、真菌或细菌，如疫霉菌、镰刀菌、稻瘟菌等易引起的植物病害的致病菌。

本发明还提供了上述基因GmAP5、由上述基因GmAP5编码的蛋白质、上述的密码子优化的基因或者上述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在植物育种中的应用。将上述基因GmAP5、由上述基因GmAP5编码的蛋白质、上述的密码子优化的基因或者上述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌导入作物后能够获得显著抗病性/或增加产量的作物品种，优选导入大豆、烟草、番茄或马铃薯中获得能够增强抗病性和/或增加产量的作物品种。

本研究对大豆细胞外泌液的分析发现天冬氨酸蛋白酶GmAP5参与大豆抵抗大豆疫霉侵染过程。在过表达GmAP5基因的大豆上接种大豆疫霉，造成的大豆疫霉生物量显著减少。而在沉默GmAP5基因的大豆上接种大豆疫霉，造成的大豆疫霉生物量显著增加。GmAP5基因对大豆抗病性起着非常重要的作用，对大豆中GmAP5的研究可带动许多其它植物如番茄和马铃薯胞外抗病蛋白的相关研究。这些研究将能更好的阐明植物对疫霉菌的抗病功能，可为抗病基因工程育种提供优秀的抗病基因资源。

本发明的有益效果：

本发明所述基因GmAP5编码的蛋白质通过分泌到胞外发挥抗病作用，从而增强植物抗病性。在植物中过表达不会影响植物生长性状，尤其对疫霉菌的抗病具有广谱性，可以显著增强植物对疫霉菌的抗病性，本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物对疫病的抗病性，从而达到增产减药的目的。

附图说明

图1：pBin::GFP和pBin::GmAP5-GFP转基因大豆毛状根接种大豆疫霉菌后表现的发病症状。

图2：显微镜观察并计数pBin::GFP和pBin::GmAP5-GFP转基因大豆毛状根接种大豆疫霉菌后卵孢子数目。

图3：实时荧光定量PCR检测pBin::GFP和pBin::GmAP5-GFP转基因大豆毛状根接种大豆疫霉菌后大豆疫霉生物量。

图4：pBin::GFP和pBin::GmAP5-GFP转基因大豆毛状根蛋白表达检测。Westernblot检测对照GFP和GmAP5-GFP的表达量，检测抗体为anti-GFP。

图5：pFGC::GFP和pFGC::GmAP5处理大豆毛状根接种大豆疫霉菌后表现的发病症状。

图6：显微镜观察并计数pFGC::GFP和pFGC::GmAP5转基因大豆毛状根接种大豆疫霉菌后卵孢子数目。

图7：实时荧光定量PCR检测pFGC::GFP和pFGC::GmAP5处理大豆毛状根接种大豆疫霉菌后大豆疫霉生物量。

图8：pFGC::RNAi-GmAP5载体沉默大豆毛状根中GmAP5基因表达检测。实时荧光定量PCR检测沉默大豆毛状根中GmAP5基因表达量，其中(空载体：PFGC：RNAi-EV)为对照植物。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司。

实施例1

1)供试植物和供试菌株的保存和培养

(1)供试的大豆种子为Williams 82。

(2)大肠杆菌(E.coli)菌株JM109、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株K599为本实验室保存。

(3)大豆疫霉菌株P6497为Brett M.Tyler教授(美国俄勒冈州立大学)馈赠(现有技术已经公开)，由本实验室保存。

2)GmAP5基因克隆：

(1)以大豆基因组为模板，利用GmAP5的基因引物F/R扩增GmAP5全长基因；

pBin-GmAP5-GFP-F：gaacgatagggtacccccgggATGCCTCCATCATCACTGTTTTC(SEQ IDNo.4)

pBin-GmAP5-GFP-R：catggatccgtcgaccccgggCTACTTAGCCAATCTACTACAATCAGCC(SEQ ID No.5)。

(2)50μL反应体系为：5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,Takara PrimerSTARTaq酶0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL，前后引物终浓度10pmol；

(3)PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1kb/1min，循环32次，72℃再延伸10min；

(4)在1％琼脂糖凝胶上进行核酸电泳分离，溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯下拍照，记录结果，并切胶回收GmAP5等基因PCR产物。用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。

3)植物表达载体的构建：

(1)将回收的GmAP5基因的PCR产物，利用同源重组酶分别连接到SmaI单酶切的pBIN-GFP载体上；

(2)转化大肠杆菌感受态细胞JM109，均匀的涂在LB(含卡纳霉素50μg/mL)平板上，37℃培养12h；

(3)利用载体引物(Pbin-GFP4-F和Pbin-GFP4-R)进行菌落PCR验证，将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行核酸电泳，染色拍照后记录阳性克隆；

Pbin-GFP4-F：GGAGAGGACCTCGAGAATTCTCAAC(SEQ ID NO.7)

Pbin-GFP4-R：GTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTC(SEQ ID NO.8)

(4)挑取两个阳性单菌落摇菌扩配，并按照质粒提取试剂盒使用说明的要求(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞股份有限公司测序。

(5)将测序正确的质粒，通过农杆菌电击转化到农杆菌K599或GV3101中，加入无抗LB，28℃扩培1h，均匀的涂在LB(含卡纳霉素50μg/mL，链霉素50μg/mL或含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，28℃培养48h；

(6)利用载体引物(Pbin-GFP4-F和Pbin-GFP4-R)进行菌落PCR验证，挑取正确克隆-70℃保存甘油菌和进行后续实验。

4)沉默载体pFGC::GmAP5的构建：

提取大豆总RNA，利用反转录合成cDNA。根据GmAP5的cDNA的序列设计引物扩增部分片段用于GmAP5基因沉默载体的构建。

分别用pFGC-GmAP5-ACSI-RNAi-1F/2R和pFGC-GmAP5-BamH1-RNAi-1F/2R的引物扩增GmAP5的片段。进行PCR扩增长度为250bp的部分基因序列(SEQ ID NO.6)，PCR扩增程序为98℃预变性5分钟，98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环35次，最后72℃延伸10分钟；PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收PCR产物。用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的PCR产物根据ClonExpress II One StepCloning Kit(Vazyme)按照说明操作分别连接到AscI和BamHI酶切的pFGC载体上得到pFGC::RNAi-GmAP5质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含卡纳50ug/mL)平板，37℃培养16小时后菌落PCR验证挑取克隆，按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取pFGC::RNAi-GmAP5质粒，测序正确的质粒电击转化到农杆菌中，涂LB(卡那霉素50ug/mL，链霉素50ug/mL)平板，30℃培养48小时后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。

pFGC-GmAP5-ACSI-RNAi-1F：

ttacaattaccatggggcgcgccATGCCTCCATCATCACTGTTTTC(SEQ ID NO.9)

pFGC-GmAP5-ACSI-RNAi-2R：

ttaaatcatcgattgggcgcgccGAGAAGAAGGTGGTGATTTAAGTTGTG(SEQ ID NO.10)

pFGC-GmAP5-BamHI-RNAi-1F：

ctctagactcacctaggatccATGCCTCCATCATCACTGTTTTC(SEQ ID NO.11)

pFGC-GmAP5-BamHI-RNAi-2R：

aatttgcaggtatttggatccGAGAAGAAGGTGGTGATTTAAGTTGTG(SEQ ID NO.12)

实施例2

大豆中过表达和沉默GmAP5基因：

参考Kereszt等人建立的大豆毛状根转化方法(A.Kereszt et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study rootbiology.Nature Protocols2,948-952(2007))。

具体操作步骤如下：

1)将大豆种子(合丰47等感病品种)种于湿润的蛭石中，置于于温室(25℃、16h光照/8h黑暗)培养，约7天后，取下豆瓣即可灭菌用于实验。此时子叶分化能力强。

2)种豆6天后，挑取农杆菌K599单菌落到含有抗生素(50ug/mL卡那霉素和50ug/mL链霉素)的液体LB中，28℃条件下培养24h。

3)子叶消毒：用刀片割下长势较好的大豆子叶，将子叶用75％的酒精处理1min，接着用10％次氯酸钠处理10min，之后用无菌水洗3遍。

4)制备菌体悬浮液：超净台内，取2mL菌液，5000rpm，离心3min，用配置好的缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，10mM MgCl₂，200μMacetosyringonepH 5.6)洗涤菌体两次，最后将菌液OD600值调整至0.6，备用。

5)豆瓣处理：戴上无菌手套，将豆瓣从子叶叶柄上切下，在子叶下表皮中间靠叶柄端用无菌手术刀片切一个伤口。

6)接菌：将处理好的豆瓣上表皮朝下放置在MS培养基上，于伤口处点滴菌液(15-20μL)，菌液适量，形成略隆起的小水泡。

7)用封口膜封闭培养皿，置于温室(25℃、16h光照/8h黑暗)培养，大约3周后会长出发状根。每天注意污染情况，随时转接污染的皿。

8)毛状根生长：培养过程中，接种菌液处伤口变褐色(2-3天)，然后会在中间或者整个伤口生长愈伤组织，愈伤组织颗粒状或者连成片状(7天左右开始生长)，愈伤组织需经过一至两周长出根来。

9)毛状根的初步鉴定，可以通过体式显微镜(Leica MZ FLIII)荧光观察鉴定。

过表达与沉默GmAP5基因的大豆根毛上接种大豆疫霉菌：

利用体式荧光显微镜(Leica MZ FLIII)筛选表现较强荧光的大豆毛状根。挑取表达有目的基因和对照长势相当的毛状根，在无菌水湿润后的滤纸上并排放齐，将新鲜培养的标记红色荧光的大豆疫霉菌株菌丝块放在两种发状根的尖端，25℃条件下培养36-48h后，在荧光显微镜下观察拍照(图1，图5)，过表达GmAP5的大豆毛状根与对照组过表达GFP相比具有较少的大豆疫霉卵孢子数目，表明GmAP5能够提高大豆对大豆疫霉的抗性，观察结束后取样冻存，用于后续测定大豆疫霉侵染后的卵孢子数目(图2，图6)和生物量(图3，图7)以及过表达GmAP5大豆根毛的蛋白表达水平检测(图4)或沉默GmAP5基因的大豆根毛基因表达水平检测(图8)。

大豆疫霉侵染大豆根毛后大豆疫霉生物量检测：

收集大豆疫霉侵染36h后的过表达或沉默GmAP5基因的大豆根毛进行大豆疫霉生物量检测。基因组的抽提采用TIANGEN公司基因组提取试剂盒按照说明操作，用分光光度计检测其含量和质量。

实时荧光定量PCR反应:

PCR反应体系包含gDNA 5uL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10uL,前后引物各0.4uL，ROX Reference Dye II 0.4uL,水13.8uL。反应程序:I:95度30秒，II:95度5秒，60度34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是:95度15秒,60度1分钟,95度15秒。数据分析采用2-ΔΔCT方法(K.J.Livak,T.D.Schmittgen,Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T))Method.Methods25,402-408(2001).)，检测结果如图2、图6所示。

实时荧光定量PCR反应的前后引物为：

RT-Actin-GMCYP93A-F：CCAGAATGACGCTGAGTCAG(SEQ ID NO.13)

RT-Actin-GMCYP93A-R：GCAAATCGAAAGGCTTCAGG(SEQ ID NO.14)

RT-Actin-P.sojae–F：ACTGCACCTTCCAGACCATC(SEQ ID NO.15)

RT-Actin-P.sojae–R：CCACCACCTTGATCTTCATG(SEQ ID NO.16)

过表达GmAP5基因的大豆根毛上蛋白水平检测：

收集大豆疫霉侵染36h后的过表达GmAP5的大豆根毛进行GmAP5蛋白表达水平的检测。将收集的大豆根毛液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl，50mM TrisHCl pH 7.5，1.0％(v/v)NP-40，and 1.0％(v/v)protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30分钟。18000g离心收集上清液80uL加入20uL 5倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴5分钟。取10uL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5小时。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的GFP一抗(Abmart)孵育2小时后用PBST洗膜5分钟三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR，irdye 800，926-32210)孵育30分钟后用PBST洗膜5分钟三次，扫膜拍照(图4)。实验结果显示：Western-blot显示GmAP5-GFP的融合蛋白(～72kDa)在大豆毛状根中成功表达。

沉默GmAP5基因的大豆根毛上沉默水平检测：

收集大豆疫霉侵染36h后的沉默GmAP5基因的大豆根毛进行GmAP5基因沉默水平的检测。提总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。反转录生成第一链:取0.7ug RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20uL反应。反转录产物用水进行10倍稀释用于实时定量PCR反应检测基因沉默效率。

实时荧光定量PCR反应:

PCR反应体系包含cDNA 5uL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10uL，qRT-GmAP5-F/R引物各0.4uL，ROX Reference Dye II 0.4uL，水13.8uL。反应程序：I:95度30秒，II:95度5秒，60度34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒，60度1分钟，95度15秒。数据分析采用2-ΔΔCT方法，检测结果如图8所示，沉默GmAP5基因的毛状根，GmAP5的转录水平与沉默空载体的毛状根相比具有显著的降低，表明GmAP5在大豆毛状根中成功沉默。

qRT-GmAP5-F：ATGCCTCCATCATCACT(SEQ ID NO.17)

qRT-GmAP5-R：GAGGTTGAGTTGTTAGTG(SEQ ID NO.18)。

实验结果表明，在过表达GmAP5基因的大豆上接种大豆疫霉，造成的大豆疫霉生物量显著减少。而在沉默GmAP5基因的大豆上接种大豆疫霉，造成的大豆疫霉生物量显著增加。GmAP5基因对大豆抗病性起着非常重要的作用，对大豆中GmAP5的研究可带动许多其它植物如番茄和马铃薯胞外抗病蛋白的相关研究。这些研究将能更好的阐明植物对疫霉菌的抗病功能，可为抗病基因工程育种提供优秀的抗病基因资源。

序列表：

GmAP5基因序列(SEQ ID NO.1)：

ATGCCTCCATCATCACTGTTTTCAAACATGCATTTCTTGTTCTTTTTTCTTCTCTCCTCCATACACCTCTCTGTACAACTCAACCACACCACCACCACCACTAACAACTCAACCTCATTATTCTCACTCTCTTTCCCTCTCACATCACTCTCCCTCTCCACCAACACCGCTCTCAAGATGATGCTACGCAACTCACTCATTGCAAACACAAACAACAACAACACACAACTTAAATCACCACCTTCTTCTCCTTACAACTACAAGTTGTCTTTCAAATACTCCATGGCTTTAATCGTGGACCTTCCCATTGGTACCCCACCGCAGGTCCAGCCCATGGTGTTGGACACCGGAAGCCAGCTCTCGTGGATTCAGTGTCACAAAAAAGCACCCGCGAAGCCTCCCCCAACGGCGTCGTTTGACCCTTCTCTCTCCTCTACCTTTTCTACCCTTCCGTGTACTCACCCTGTCTGCAAGCCCCGAATTCCCGATTTTACCCTCCCCACCTCCTGCGACCAGAACCGCCTCTGCCACTACTCCTACTTCTACGCCGACGGCACTTACGCCGAGGGCAATCTCGTCAGAGAAAAATTCACTTTTTCGCGTTCCCTTTTTACCCCCCCTCTCATCCTCGGCTGCGCCACCGAGTCCACCGACCCCAGGGGCATTTTGGGAATGAACCGTGGACGCCTCTCCTTCGCTTCCCAGTCCAAAATTACAAAATTCTCCTACTGTGTCCCCACCCGCGTGACCCGACCTGGGTACACTCCAACCGGGTCGTTCTACCTTGGCCACAACCCGAATTCCAACACGTTTCGGTACATCGAAATGTTGACTTTTGCTCGGAGTCAACGCATGCCGAATCTCGATCCTTTGGCCTACACTGTAGCCTTACAGGGGATAAGAATCGGAGGAAGAAAACTCAACATCTCGCCGGCGGTTTTTCGTGCCGATGCTGGTGGGTCGGGTCAAACCATGCTTGACTCCGGATCCGAGTTTACTTACCTTGTTAACGAGGCTTATGATAAAGTGCGGGCTGAAGTAGTTAGGGCTGTGGGCCCCAGGATGAAGAAGGGTTACGTGTACGGTGGTGTTGCGGACATGTGTTTCGATGGGAATGCGATTGAGATCGGACGGCTAATAGGGGACATGGTGTTTGAGTTCGAGAAGGGGGTGCAAATAGTGGTTCCCAAGGAGAGGGTTCTGGCTACCGTGGAGGGTGGGGTTCACTGCATCGGGATTGCGAACTCTGATAAATTGGGTGCGGCCAGTAACATTATTGGGAATTTCCATCAGCAGAATCTGTGGGTGGAGTTTGATCTGGTCAATCGCAGAATGGGTTTTGGTACGGCTGATTGTAGTAGATTGGCTAAGTAG

GmAP5蛋白序列(SEQ ID NO.2)：

MPPSSLFSNMHFLFFFLLSSIHLSVQLNHTTTTTNNSTSLFSLSFPLTSLSLSTNTALKMMLRNSLIANTNNNNTQLKSPPSSPYNYKLSFKYSMALIVDLPIGTPPQVQPMVLDTGSQLSWIQCHKKAPAKPPPTASFDPSLSSTFSTLPCTHPVCKPRIPDFTLPTSCDQNRLCHYSYFYADGTYAEGNLVREKFTFSRSLFTPPLILGCATESTDPRGILGMNRGRLSFASQSKITKFSYCVPTRVTRPGYTPTGSFYLGHNPNSNTFRYIEMLTFARSQRMPNLDPLAYTVALQGIRIGGRKLNISPAVFRADAGGSGQTMLDSGSEFTYLVNEAYDKVRAEVVRAVGPRMKKGYVYGGVADMCFDGNAIEIGRLIGDMVFEFEKGVQIVVPKERVLATVEGGVHCIGIANSDKLGAASNIIGNFHQQNLWVEFDLVNRRMGFGTADCSRLAK

GmAP5基因密码子优化后序列(SEQ ID NO.3)：

ATGCCCCCTAGCTCCCTTTTCAGTAACATGCATTTTTTGTTCTTCTTTCTGCTTTCTAGTATCCATTTGTCCGTGCAACTTAACCATACCACAACTACAACAAACAATAGCACAAGTCTCTTTTCTTTGAGTTTTCCTCTCACTTCTCTTTCTCTTAGTACCAATACCGCCCTTAAGATGATGCTGCGCAATAGCTTGATCGCTAACACTAACAACAACAATACCCAACTGAAGTCTCCCCCTTCTAGCCCTTATAACTATAAGTTGAGCTTTAAGTATTCTATGGCTTTGATTGTTGATCTGCCTATCGGGACCCCTCCACAAGTACAGCCTATGGTGTTGGATACAGGGTCCCAACTGAGTTGGATCCAATGTCATAAGAAAGCACCAGCAAAACCACCTCCAACCGCTTCTTTCGATCCTTCTCTCTCATCCACTTTCTCCACACTCCCATGCACCCATCCTGTTTGCAAACCTAGGATTCCTGATTTCACTCTTCCTACCAGTTGTGACCAAAATAGGCTGTGCCACTATTCATATTTTTATGCAGATGGAACATATGCAGAAGGAAACTTGGTTAGGGAAAAGTTTACATTCAGCAGGTCACTTTTTACACCCCCCCTGATCCTTGGATGCGCCACAGAATCAACTGATCCAAGAGGAATACTTGGAATGAACAGAGGTCGTCTCTCATTCGCATCTCAATCAAAGATTACAAAATTCAGCTATTGCGTGCCTACCAGGGTTACAAGGCCTGGTTACACACCCACAGGGAGTTTTTACCTCGGGCATAACCCAAATTCAAACACCTTCCGCTATATTGAAATGCTCACTTTTGCAAGAAGCCAAAGGATGCCTAATCTGGACCCATTGGCCTACACTGTAGCCCTCCAGGGAATTCGTATTGGTGGCAGGAAATTGAACATTTCTCCTGCCGTTTTCAGGGCAGACGCTGGCGGTAGCGGGCAGACAATGCTCGATAGCGGATCCGAATTCACATACCTCGTGAACGAGGCATATGACAAAGTCAGAGCTGAAGTTGTGAGGGCAGTTGGGCCTAGGATGAAGAAGGGTTATGTGTACGGAGGGGTTGCTGACATGTGTTTTGATGGCAACGCAATTGAAATAGGAAGGCTTATCGGTGACATGGTCTTCGAGTTTGAAAAGGGTGTTCAGATTGTTGTGCCTAAGGAACGTGTCTTGGCTACTGTCGAAGGAGGAGTGCACTGCATAGGCATAGCCAATTCCGACAAATTGGGCGCAGCTAGCAACATTATTGGAAATTTCCATCAACAAAATCTCTGGGTTGAATTCGACCTTGTTAATCGTAGAATGGGTTTTGGAACTGCAGACTGCTCTAGGTTGGCAAAG

GmAP5基因引物：

pBin-GmAP5-GFP-F(SEQ ID NO.4)：

gaacgatagggtacccccgggATGCCTCCATCATCACTGTTTTC

pBin-GmAP5-GFP-R(SEQ ID NO.5)：

catggatccgtcgaccccgggCTACTTAGCCAATCTACTACAATCAGCC

GmAP5沉默序列(SEQ ID NO.6)：

ATGCCTCCATCATCACTGTTTTCAAACATGCATTTCTTGTTCTTTTTTCTTCTCTCCTCCATACACCTCTCTGTACAACTCAACCACACCACCACCACCACTAACAACTCAACCTCATTATTCTCACTCTCTTTCCCTCTCACATCACTCTCCCTCTCCACCAACACCGCTCTCAAGATGATGCTACGCAACTCACTCATTGCAAACACAAACAACAACAACACACAACTTAAATCACCACCTTCTTCTC

载体引物：

Pbin-GFP4-F：GGAGAGGACCTCGAGAATTCTCAAC(SEQ ID NO.7)

Pbin-GFP4-R：GTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTC(SEQ ID NO.8)

GmAP5沉默引物：

pFGC-GmAP5-ACSI-RNAi-1F(SEQ ID NO.9)：

ttacaattaccatggggcgcgccATGCCTCCATCATCACTGTTTTC

pFGC-GmAP5-ACSI-RNAi-2R(SEQ ID NO.10)：

ttaaatcatcgattgggcgcgccGAGAAGAAGGTGGTGATTTAAGTTGTG

pFGC-GmAP5-BamHI-RNAi-1F(SEQ ID NO.11)：

ctctagactcacctaggatccATGCCTCCATCATCACTGTTTTC

pFGC-GmAP5-BamHI-RNAi-2R(SEQ ID NO.12)：

aatttgcaggtatttggatccGAGAAGAAGGTGGTGATTTAAGTTGTG

实时荧光定量PCR反应的前后引物为：

RT-Actin-GMCYP93A-F：CCAGAATGACGCTGAGTCAG(SEQ ID NO.13)

RT-Actin-GMCYP93A-R：GCAAATCGAAAGGCTTCAGG(SEQ ID NO.14)

RT-Actin-P.sojae–F：ACTGCACCTTCCAGACCATC(SEQ ID NO.15)

RT-Actin-P.sojae–R：CCACCACCTTGATCTTCATG(SEQ ID NO.16)

GmAP5定量PCR引物

qRT-GmAP5-F：ATGCCTCCATCATCACT(SEQ ID NO.17)

qRT-GmAP5-R：GAGGTTGAGTTGTTAGTG(SEQ ID NO.18)

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种提高植物抗病性的基因GmAP5及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 1

atgcctccat catcactgtt ttcaaacatg catttcttgt tcttttttct tctctcctcc 60

atacacctct ctgtacaact caaccacacc accaccacca ctaacaactc aacctcatta 120

ttctcactct ctttccctct cacatcactc tccctctcca ccaacaccgc tctcaagatg 180

atgctacgca actcactcat tgcaaacaca aacaacaaca acacacaact taaatcacca 240

ccttcttctc cttacaacta caagttgtct ttcaaatact ccatggcttt aatcgtggac 300

cttcccattg gtaccccacc gcaggtccag cccatggtgt tggacaccgg aagccagctc 360

tcgtggattc agtgtcacaa aaaagcaccc gcgaagcctc ccccaacggc gtcgtttgac 420

ccttctctct cctctacctt ttctaccctt ccgtgtactc accctgtctg caagccccga 480

attcccgatt ttaccctccc cacctcctgc gaccagaacc gcctctgcca ctactcctac 540

ttctacgccg acggcactta cgccgagggc aatctcgtca gagaaaaatt cactttttcg 600

cgttcccttt ttaccccccc tctcatcctc ggctgcgcca ccgagtccac cgaccccagg 660

ggcattttgg gaatgaaccg tggacgcctc tccttcgctt cccagtccaa aattacaaaa 720

ttctcctact gtgtccccac ccgcgtgacc cgacctgggt acactccaac cgggtcgttc 780

taccttggcc acaacccgaa ttccaacacg tttcggtaca tcgaaatgtt gacttttgct 840

cggagtcaac gcatgccgaa tctcgatcct ttggcctaca ctgtagcctt acaggggata 900

agaatcggag gaagaaaact caacatctcg ccggcggttt ttcgtgccga tgctggtggg 960

tcgggtcaaa ccatgcttga ctccggatcc gagtttactt accttgttaa cgaggcttat 1020

gataaagtgc gggctgaagt agttagggct gtgggcccca ggatgaagaa gggttacgtg 1080

tacggtggtg ttgcggacat gtgtttcgat gggaatgcga ttgagatcgg acggctaata 1140

ggggacatgg tgtttgagtt cgagaagggg gtgcaaatag tggttcccaa ggagagggtt 1200

ctggctaccg tggagggtgg ggttcactgc atcgggattg cgaactctga taaattgggt 1260

gcggccagta acattattgg gaatttccat cagcagaatc tgtgggtgga gtttgatctg 1320

gtcaatcgca gaatgggttt tggtacggct gattgtagta gattggctaa gtag 1374

<210> 2

<211> 457

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 2

Met Pro Pro Ser Ser Leu Phe Ser Asn Met His Phe Leu Phe Phe Phe

1 5 10 15

Leu Leu Ser Ser Ile His Leu Ser Val Gln Leu Asn His Thr Thr Thr

20 25 30

Thr Thr Asn Asn Ser Thr Ser Leu Phe Ser Leu Ser Phe Pro Leu Thr

35 40 45

Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ala Leu Lys Met Met Leu Arg Asn

50 55 60

Ser Leu Ile Ala Asn Thr Asn Asn Asn Asn Thr Gln Leu Lys Ser Pro

65 70 75 80

Pro Ser Ser Pro Tyr Asn Tyr Lys Leu Ser Phe Lys Tyr Ser Met Ala

85 90 95

Leu Ile Val Asp Leu Pro Ile Gly Thr Pro Pro Gln Val Gln Pro Met

100 105 110

Val Leu Asp Thr Gly Ser Gln Leu Ser Trp Ile Gln Cys His Lys Lys

115 120 125

Ala Pro Ala Lys Pro Pro Pro Thr Ala Ser Phe Asp Pro Ser Leu Ser

130 135 140

Ser Thr Phe Ser Thr Leu Pro Cys Thr His Pro Val Cys Lys Pro Arg

145 150 155 160

Ile Pro Asp Phe Thr Leu Pro Thr Ser Cys Asp Gln Asn Arg Leu Cys

165 170 175

His Tyr Ser Tyr Phe Tyr Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Glu Gly Asn Leu

180 185 190

Val Arg Glu Lys Phe Thr Phe Ser Arg Ser Leu Phe Thr Pro Pro Leu

195 200 205

Ile Leu Gly Cys Ala Thr Glu Ser Thr Asp Pro Arg Gly Ile Leu Gly

210 215 220

Met Asn Arg Gly Arg Leu Ser Phe Ala Ser Gln Ser Lys Ile Thr Lys

225 230 235 240

Phe Ser Tyr Cys Val Pro Thr Arg Val Thr Arg Pro Gly Tyr Thr Pro

245 250 255

Thr Gly Ser Phe Tyr Leu Gly His Asn Pro Asn Ser Asn Thr Phe Arg

260 265 270

Tyr Ile Glu Met Leu Thr Phe Ala Arg Ser Gln Arg Met Pro Asn Leu

275 280 285

Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Ala Leu Gln Gly Ile Arg Ile Gly Gly

290 295 300

Arg Lys Leu Asn Ile Ser Pro Ala Val Phe Arg Ala Asp Ala Gly Gly

305 310 315 320

Ser Gly Gln Thr Met Leu Asp Ser Gly Ser Glu Phe Thr Tyr Leu Val

325 330 335

Asn Glu Ala Tyr Asp Lys Val Arg Ala Glu Val Val Arg Ala Val Gly

340 345 350

Pro Arg Met Lys Lys Gly Tyr Val Tyr Gly Gly Val Ala Asp Met Cys

355 360 365

Phe Asp Gly Asn Ala Ile Glu Ile Gly Arg Leu Ile Gly Asp Met Val

370 375 380

Phe Glu Phe Glu Lys Gly Val Gln Ile Val Val Pro Lys Glu Arg Val

385 390 395 400

Leu Ala Thr Val Glu Gly Gly Val His Cys Ile Gly Ile Ala Asn Ser

405 410 415

Asp Lys Leu Gly Ala Ala Ser Asn Ile Ile Gly Asn Phe His Gln Gln

420 425 430

Asn Leu Trp Val Glu Phe Asp Leu Val Asn Arg Arg Met Gly Phe Gly

435 440 445

Thr Ala Asp Cys Ser Arg Leu Ala Lys

450 455

<210> 3

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcccccta gctccctttt cagtaacatg cattttttgt tcttctttct gctttctagt 60

atccatttgt ccgtgcaact taaccatacc acaactacaa caaacaatag cacaagtctc 120

ttttctttga gttttcctct cacttctctt tctcttagta ccaataccgc ccttaagatg 180

atgctgcgca atagcttgat cgctaacact aacaacaaca atacccaact gaagtctccc 240

ccttctagcc cttataacta taagttgagc tttaagtatt ctatggcttt gattgttgat 300

ctgcctatcg ggacccctcc acaagtacag cctatggtgt tggatacagg gtcccaactg 360

agttggatcc aatgtcataa gaaagcacca gcaaaaccac ctccaaccgc ttctttcgat 420

ccttctctct catccacttt ctccacactc ccatgcaccc atcctgtttg caaacctagg 480

attcctgatt tcactcttcc taccagttgt gaccaaaata ggctgtgcca ctattcatat 540

ttttatgcag atggaacata tgcagaagga aacttggtta gggaaaagtt tacattcagc 600

aggtcacttt ttacaccccc cctgatcctt ggatgcgcca cagaatcaac tgatccaaga 660

ggaatacttg gaatgaacag aggtcgtctc tcattcgcat ctcaatcaaa gattacaaaa 720

ttcagctatt gcgtgcctac cagggttaca aggcctggtt acacacccac agggagtttt 780

tacctcgggc ataacccaaa ttcaaacacc ttccgctata ttgaaatgct cacttttgca 840

agaagccaaa ggatgcctaa tctggaccca ttggcctaca ctgtagccct ccagggaatt 900

cgtattggtg gcaggaaatt gaacatttct cctgccgttt tcagggcaga cgctggcggt 960

agcgggcaga caatgctcga tagcggatcc gaattcacat acctcgtgaa cgaggcatat 1020

gacaaagtca gagctgaagt tgtgagggca gttgggccta ggatgaagaa gggttatgtg 1080

tacggagggg ttgctgacat gtgttttgat ggcaacgcaa ttgaaatagg aaggcttatc 1140

ggtgacatgg tcttcgagtt tgaaaagggt gttcagattg ttgtgcctaa ggaacgtgtc 1200

ttggctactg tcgaaggagg agtgcactgc ataggcatag ccaattccga caaattgggc 1260

gcagctagca acattattgg aaatttccat caacaaaatc tctgggttga attcgacctt 1320

gttaatcgta gaatgggttt tggaactgca gactgctcta ggttggcaaa g 1371

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaacgatagg gtacccccgg gatgcctcca tcatcactgt tttc 44

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catggatccg tcgaccccgg gctacttagc caatctacta caatcagcc 49

<210> 6

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcctccat catcactgtt ttcaaacatg catttcttgt tcttttttct tctctcctcc 60

atacacctct ctgtacaact caaccacacc accaccacca ctaacaactc aacctcatta 120

ttctcactct ctttccctct cacatcactc tccctctcca ccaacaccgc tctcaagatg 180

atgctacgca actcactcat tgcaaacaca aacaacaaca acacacaact taaatcacca 240

ccttcttctc 250

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggagaggacc tcgagaattc tcaac 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtggtgcaga tgaacttcag ggtc 24

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttacaattac catggggcgc gccatgcctc catcatcact gttttc 46

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaaatcatc gattgggcgc gccgagaaga aggtggtgat ttaagttgtg 50

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctctagactc acctaggatc catgcctcca tcatcactgt tttc 44

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aatttgcagg tatttggatc cgagaagaag gtggtgattt aagttgtg 48

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccagaatgac gctgagtcag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcaaatcgaa aggcttcagg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actgcacctt ccagaccatc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccaccacctt gatcttcatg 20

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgcctccat catcact 17

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaggttgagt tgttagtg 18

Claims

1.一种基因GmAP5，该基因为如下(1)或(2)：

(1)具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1具有70％以上同源性的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的基因GmAP5编码的蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种密码子优化的如权利要求2所述蛋白的编码基因，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求1所述基因GmAP5或权利要求3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体是将权利要求1所述的基因GmAP5或权利要求3所述的基因插入到含有C-端eGFP的双元载体pBin-eGFP酶切位点SmaI中得到的。

6.用于扩增权利要求1所述基因GmAP5的引物对，其特征在于，它包括正向引物F和反向引物R；所述正向引物F的序列如SEQ ID No.4所示；所述反向引物R的序列如SEQ ID No.5所示。

7.一种沉默权利要求1所述基因GmAP5的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

8.含有权利要求7所述沉默基因GmAP5的片段的重组沉默载体。

9.权利要求1中所述的基因GmAP5、权利要求2中所述的蛋白、权利要求3中所述的基因或权利要求4中所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。

10.权利要求1中所述的基因GmAP5、权利要求2中所述的蛋白、权利要求3中所述的基因或权利要求4中所述的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在植物育种中的应用。