CN110408626A - 一种提高大豆疫霉菌抗性的基因GmWRKY148及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高大豆疫霉菌抗性的基因GmWRKY148增强大豆对大豆疫霉菌的抗性及其应用。本发明公开的基因GmWRKY148，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。过量表达GmWRKY148的大豆Williams在疫霉胁迫情况下的表型及疫霉积累量指标表明，GmWRKY148在提高植物对疫霉菌抗性方面发挥了重要的调控作用。通过采用该基因进行植物抗疫霉根腐病的基因工程改良，发现该基因对培育具有较高抗疫霉根腐病的植物品种具有一定的作用，可以通过提高植物对疫霉菌的抗性进而为提高植物的产量和品质服务。

Description

一种提高大豆疫霉菌抗性的基因GmWRKY148及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高大豆疫霉菌抗性的基因GmWRKY148及其应用。

技术背景

植物经常受到多种非生物和/或生物胁迫,如干旱和高温、干旱和寒冷、盐度和热，或任何主要的非生物胁迫结合病原体感染。大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)是一种卵菌，可在条件适宜时侵染大豆，有多个生理小种，难以防治。采用多种防治措施相结合的综合防治技术是根本有效的防治途径，其中应用基因工程技术培育抗病品种防治大豆疫霉根腐病最为有效。

WRKY转录因子是植物最大的转录调节因子家族之一，是调节植物生理过程信号网络的重要组成成分。WRKY蛋白通常作为正向或负向调节因子，激活或者抑制植物重要的生理进程。WRKY转录因子的表达可以受多种环境和内部因子强烈而迅速的诱导，尤其是生物胁迫相关的因子。尽管关于大豆WRKY基因家族己有一些报道，但其在大豆抗病中的研究报道不多。

大豆疫霉根腐病(Phytophthora root rot,PRR)是由大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)引起的严重土传性病害，能在大豆的整个生育期侵染其各种组织和器官。目前已在全球范围内均有报道该病的发生。对大豆生产造成了巨大的产量和经济损失。但由于P.sojae具有高度的遗传变异性，抗性品种往往不能保持连续的抗性，很快又会被新的毒力小种所克服。鉴于人豆疫霉生理小种比较丰富，研究其病原菌的毒性变异规律，将对该病害的防治具有重大指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供大豆GmWRKY148基因与其在抗疫霉根腐病方面的应用，该基因可导入植物，提高大豆对大豆疫霉菌的抗性，以进行植物品种改良。

本发明的目的之一在于提供一种基因GmWRKY148。

本发明的目的之二在于提供一种含有基因GmWRKY148的重组表达载体。

本发明的目的之三在于提供基因GmWRKY148的应用。

本发明内容具体详述如下：

本发明提供一种基因GmWRKY148，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％同源性且能够提高大豆疫霉菌抗性的基因序列。

本发明还提供一种扩增基因GmWRKY148的引物：

GmWRKY148-F GCAGCTTCTAACTCTGGCGA(SEQ ID NO.2)

GmWRKY148-R TTTATTATAAGTGATAAGATCTACAAGCAA(SEQ ID NO.3)。

本发明还提供一种包含基因GmWRKY148的重组表达载体。

所述重组表达载体可以选择植物遗传转化中常用的表达质粒插入本发明所述的基因GmWRKY148形成重组表达载体，例如重组表达载体为pBINGFP2-GmWRKY148的植物过量表达载体。

利用植物表达载体将本发明的GmWRKY148导入大豆细胞，可获得抗病性改变的转基因细胞及转基因大豆根毛。

使用GmWRKY148构建植物表达载体时，可以在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型的启动子或诱导性启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如可加入植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、GFP基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，也可不加入任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。

携带有本发明的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化大豆细胞或组织，并将转化的大豆组织培养成大豆植株。

本发明还提供一种转化体，由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。例如含有所述pBINGFP2-GmWRKY148编码基因的宿主菌，是由GmWRKY148基因转入发根农杆菌菌株K599所得。

本发明还提供所述基因GmWRKY148或其扩增引物或重组表达载体或转化体在提高大豆疫霉菌抗性中的应用。

本发明还提供所述基因GmWRKY148或其扩增引物或重组表达载体或转化体在大豆提高抗疫霉菌引起的病害中的应用。

本发明还提供所述基因GmWRKY148或其扩增引物或重组表达载体或转化体在大豆育种中的应用。

本发明还提供所述基因GmWRKY148或其扩增引物或重组表达载体或转化体在导入大豆后获得显著抗疫霉菌病害的品种中的应用。

本发明的有益效果

本发明利用Phytozome以AtWRKY44(AT2G37260.1)为探针查找大豆中与拟南芥AtWRKY44同源的基因，进行BLAST比对。结果发现同源基因数量较多，经过大豆疫霉菌P6497的诱导，选择了表达量变化较大的基因，即GmWRKY148，确定其为研究对象，该基因与AtWRKY44的同源性为30.24％。

GmWRKY148诱导表达分析表明其参与大豆疫霉胁迫的应答。进一步的研究过量表达GmWRKY148的大豆Williams在疫霉胁迫情况下的表型及疫霉积累量指标表明，GmWRKY148在提高植物对疫霉菌抗性方面发挥了重要的调控作用。通过采用该基因进行大豆抗疫霉根腐病的基因工程改良，发现该基因对培育具有较高抗疫霉根腐病的大豆品种具有一定的作用，可以通过提高大豆对疫霉菌的抗性进而为提高大豆的产量和品质服务。

附图说明

图1 GmWRKY148的PCR扩增产物；

图2大豆GmWRKY148蛋白的三维结构；

图3 GmWRKY148进化树分析；

图4 GmWRKY148启动子胁迫响应顺式作用元件分析；

图5 GmWRKY148的组织表达分析；

图6大豆栽培品种Williams和Williams 82中GmWRKY148在疫霉诱导下的表达模式；

图7含有GmWRKY148的植物表达载体示意图；

图8转基因阳性发状根的荧光筛选；

图9 Williams转基因阳性发状根的过表达效率检测；

图10 GmWRKY148在大豆Williams中的抗性功能分析；

图11大豆Williams发状根中疫霉侵染的显微观察。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

1)GmWRKY148基因的克隆及生物信息学分析

利用Phytozome(http://www.phytozome.net/)以AtWRKY44(AT2G37260.1)为探针查找大豆中与拟南芥AtWRKY44同源的基因，进行BLAST比对。结果发现同源基因数量较多，经过大豆疫霉菌P6497的诱导，选择了表达量变化较大的基因，即GmWRKY148，确定其为研究对象(图1)。设计引物，引物序列见表1。GmWRKY148蛋白三维结构分析结果显示(图2)，其内部存在由7个α-螺旋，4个β-折叠。4个β-折叠是WRKY结构域的典型特征，含有WRKYGQK基序的β链可以与长度为6bp的W-box(TTGACY)区域相互作用。进化分析表明，GmWRKY148属于大豆WRKY转录因子家族基因，与苜蓿、菜豆等植物亲缘关系十分相近(图3)。对GmWRKY148的启动子的顺式作用元件进行分析，选择距离转录起始位点上游1500bp的序列作为目标序列(图4，AAAC-motif:光应答元件；ARE:厌氧反应顺式作用元件；GARE-motif:赤霉素响应元件；GCN4-motif:胚乳表达相关的顺式作用元件；MBS:与干旱相关的MYB结合位点；MRE:与光应答相关的MYB结合位点；TC-rich repeats:参与防御与胁迫响应过程的顺式作用元件；TCA-element:水杨酸响应相关的顺式作用元件；Circadian:调节昼夜节律的顺式作用元件)。其中的关键元件包括调控类黄酮合成基因的MYB结合位点(MBS)、水杨酸和赤霉素的激素响应元件及参与防御与胁迫响应过程的顺式作用元件(TC-rich repeats)。以上分析结果表明GmWRKY148可能参与大豆对生物胁迫的应答。

表1引物序列

应用RT-PCR方法，从大豆品种Williams 82根部克隆了GmWRKY148基因。取大豆根部，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5ml EP管，充分震荡后抽提总RNA(RNAprep purePlant Kit，Tiangen,Beijing)。按照日本东洋纺公司提供的反转录试剂盒ReverTraqPCR RT Kit(TOYOBO,Japan)进行反转录，得到cDNA第一链后进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，95℃变性30秒，复兴30秒(温度根据引物而定)，72℃延伸2.5分钟，共35个循环，随后72℃保温10分钟，最后12℃恒温。随后进行PCR产物割胶纯化、连接至pMD19-simple载体后将载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑起阳性单克隆测序。

2)GmWRKY148在大豆不同组织和逆境胁迫下的表达分析

在正常田间生长条件下，取大豆根、茎、叶片、子叶，液氮速冻后于-80℃保存。将人工气候箱培养的1周大的大豆品种Williams 82和Williams进行疫霉胁迫处理，取样时间分别为处理后0,6,12,24小时，液氮速冻后于-80℃保存。

总RNA的提取及cDNA的反转同步骤1)。

以大豆组成型表达的GmActin基因为内部参照，对来自栽培大豆品种Williams 82和Williams的cDNA为模板，进行定量荧光实时定量PCR分析。结果表明，GmWRKY148在根中的表达丰度最高(图5)。GmWRKY148基因能够受到疫霉胁迫的诱导(图6，A:疫霉诱导下大豆栽培品种Williams中GmWRKY148的表达模式。B：疫霉诱导下大豆栽培品种Williams 82中GmWRKY148的表达模式)。说明该基因在疫霉胁迫中具有重要的作用。

实施例2 GmWRKY148的基因工程应用

根据GmWRKY148的cDNA序列，设计扩增出完整编码开放阅读框(ORF)的引物，并在引物中引入接头引物。所述的DNA序列，利用双酶切的方法进行载体构建，酶切位点为Kpn1和BamH1。将完整的ORF插入到表达载体pBINGFP2中,构建完成植物过表达载体35S-WRKY148::GFP(图7)。将其和空载分别通过电击转化法分别转化至发根农杆菌K599中，然后通过农杆菌介导的方法获得转基因大豆根毛。然后根据载体上的标记蛋白GFP，对获得的阳性大豆根毛进行利用荧光体视显微镜进行初步筛选，并将阳性发状根在White培养基上扩大培养(图8，a：GFP转化Williams的发状根。b：过表达GmWRKY148的Williams发状根)。为了进一步检测GmWRKY148的过表达效率，将分别扩培的OE-GmWRKY148和GFP空载体发状根提取RNA，进行荧光定量PCR检测GmWRKY148的表达情况(图9，CK为对照，OE-1,OE-2,OE-3表示转基因阳性发状根)。

将空载体GFP转入大豆Williams中，并且在大豆Williams中过表达GmWRKY148，获得转基因发状根。通过荧光显微镜筛选到阳性发状根，在发状根上接种新鲜的大豆疫霉P6497菌块，观察接种部位病斑扩展情况，病斑长度统计结果显示，GmWRKY148过表达后，发状根接种P6497后的病斑长度明显比Williams空载体对照短(图10，A:过表达GmWRKY148的Williams发状根与对照接种P6497后24hpi的病斑表型。(a):Williams中GFP空载体对照表型。(b):Williams中过表达GmWRKY148的表型。B:疫霉P6497侵染发状根24h后，大豆Williams中空载对照和OE-GmWRKY148发状根病斑长度统计。C:P6497游动孢子接种后24h和36h，过表达GmWRKY148的Williams发状根和对照中疫霉相对生物积累量的分析。疫霉的积累量使用内参基因GmEF1β来表示。)。将过表达GmWRKY148的Williams阳性发状根与对照在white培养基上扩大培养，选取根尖长势一致的发状根接种大豆疫霉游动孢子，结果显示，过表达GmWRKY148发状根中的疫霉累积量明显低于空载体对照。这些结果说明过表达GmWRKY148使得Williams对大豆疫霉菌P6497的抗性增强(图11，红色荧光标记的P6497游动孢子接种大豆发状根，接种后24、36和48h使用荧光显微镜观察菌丝的侵染过程)。

红色荧光蛋白RFP标记的P6497游动孢子接种OE-GmWRKY148和EV的发状根，利用体视显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子的萌发情况。接种后24h，对照的发状根有35％被成功侵染，15％的发状根产生了卵孢子；而OE-GmWRKY148发状根只有15％被成功侵染，且没有萌发的卵孢子。接种后36h，65％的GFP空载体的发状根被侵染，30％的的发状根能观察到萌发的卵孢子；而仅有25％OE-GmWRKY148的发状根被成功侵染，10％的阳性根能够观察到萌发的卵孢子。接种后48h，80％的GFP空载体的发状根被侵染，60％的的发状根能观察到萌发的卵孢子；而过表达GmWRKY148的发状根45％被侵染，20％的阳性根能够观察到萌发的卵孢子(表2)。以上结果说明，过表达GmWRKY148能够显著提高大豆对大豆疫霉菌的抗性。因此我们认为GmWRKY148在植物耐逆性方面发挥了重要的作用。利用GmWRKY148基因获得的具有一定耐逆性的新材料可用作于植物的育种应用。

表2受疫霉菌丝侵染及产生卵孢子的转基因发状根数目统计

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种提高大豆疫霉菌抗性的基因GmWRKY148及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

atgcctttcc gaaattccaa tatgatagta cagaaaaagc tatggagaat tgttggattt 60

ttgtcaagtg tgattggact aatctgttac gcgttgagtt cctctttcaa ccacctattt 120

ggagagtgga acttcttgaa gatcatcctt tacgcagtga taagtttctc tatcagcagc 180

atcatgttac ttttgaaaaa atggaaactt tccaagagtt tcatgctaaa agctcatgtg 240

ggtgttctgg ttttgttgat cacttctgtg tactcttttg tatccgacaa agctgtgaat 300

ggaaaaccag acatgttaag tttgatttcg tgttttgcct ttgctttcat gtctctgtgt 360

ctgtcaaagc agattgacct tgggtttgga gcagatctcc tcaatttctt ccttggatgc 420

ctaactgttc aactaatgca catccatttg atgctctcta ttgttgcagc catattttgc 480

tattgtttca tgttttttcg ttccaagttg gattctcaat cacagattgg aactgtagaa 540

gttgaagacc atgtaaacat agaaattgat gctgaagatg gaaaaagaga gtttgatgac 600

aacagaagtg acttccaagc taatcatagc caccaacaag ttccgttatt aagaatggtg 660

ggtgatgggt acaattggag aaaatatgaa gataaagtag tgaaaggaag tgcaaaccag 720

ttaagttact acaaatgcac acaacccact tgctatgtga agaaaaaagt tgagagaact 780

atagaggggg aaattgttga tatacactac cagggtactc atacacattg cgagcgtatg 840

cataatatga agagaaactc ttcatctgaa tatttatatt cagtgttacc ttcagagcct 900

gtcacctttc cagatcaatc atttgcctct cagggcaatg gagaattgga ttatcatgtg 960

cagcaacaga gaactcctca atatccaaat gaaatatga 999

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagcttcta actctggcga 20

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttattataa gtgataagat ctacaagcaa 30

Claims (9)

1.一种基因GmWRKY148，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％同源性且能够提高大豆疫霉菌抗性的基因序列。

2.一种扩增权利要求1所述基因GmWRKY148的引物：SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.3。

3.一种包含权利要求1所述基因GmWRKY148的重组表达载体。

4.一种转化体，由权利要求3所述的重组表达载体导入宿主细胞所得。

5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

6.权利要求1所述基因GmWRKY148、权利要求2所述引物、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述转化体在提高大豆疫霉菌抗性中的应用。

7.权利要求1所述基因GmWRKY148、权利要求2所述引物、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述转化体在大豆提高抗疫霉菌引起的病害中的应用。

8.权利要求1所述基因GmWRKY148、权利要求2所述引物、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述转化体在大豆育种中的应用。

9.权利要求1所述基因GmWRKY148、权利要求2所述引物、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述转化体在导入大豆后获得显著抗疫霉菌病害的品种中的应用。