CN116083437B - 大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用 - Google Patents

大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，提供了大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用，所述GmNAC56基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的GmNAC56基因通过提高PR蛋白的表达或提高SOD酶和POD酶的活性来提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。将GmNAC56基因过表达载体转入作物中可提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。本发明为抗大豆疫霉根腐病相关机制研究提供了重要的基因基础及理论支持，为推进植物防御系统的研究和应用以及培育高抗病的大豆新品种提供宝贵的基因资源，在大豆抗病基因工程育种中具有重要的应用价值。

Description

大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用。
背景技术
大豆起源于中国，是重要的植物蛋白质和食用油脂来源。大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)侵染引起的严重危害大豆生产的世界性病害之一。该病具有土传性和极强的破坏性，平均每年在全球范围内造成的经济损失高达数十亿美元。由于大豆疫霉菌的生理小种变化快，且毒力分化复杂，容易导致抗病品种的抗性丧失。因此挖掘抗病相关基因，系统解析大豆生物分子防御调控机理，可为抗病基因工程育种奠定科学的理论基础。
AP2/ERF(APETALA2/Ethylene ResponsiveFactor)转录因子是植物中特有的一类转录因子家族，最早由Jofuku于1994年首次从拟南芥中分离出，并被证实与花发育相关。AP2/ERF转录因子一般含有1-2个约由40-70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域，主要参与识别并结合下游靶基因的核心序列从而调控目的基因的表达。作为转录因子，AP2/ERFs参与调控植物发育、生物胁迫和非生物胁迫反应等多种生物学过程。
NAC(NAM/ATAF/CUC)转录因子家族是植物特有的一类转录因子，最早是从矮牵牛(Petuniahybrida)中分离出来，并证实其与植物顶端分生组织的形成有关。近些年来，越来越多的研究表明NAC转录因子在植物中起到了不可或缺的作用，其广泛参与植物生长发育、胁迫应答、激素信号传导途径和光信号通路等多种反应，在生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色。
植物防御反应的调控发生在从转录的积累和调节到蛋白的翻译和修饰等各个层面，涉及免疫反应蛋白、转录调节因子和防御相关基因等多种调节机制的参与和协调。迄今为止，大豆对大豆疫霉菌的分子防御机制尚不明晰。
发明内容
本发明的目的在于提供大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用，所述GmNAC56基因过表达可以提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性，为抗大豆疫霉根腐病相关机制研究提供了重要的基因基础及理论支持。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了大豆GmNAC56基因，所述GmNAC56基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了过表达上述大豆GmNAC56基因的表达载体，包括初始表达载体和GmNAC56基因。
进一步地，所述初始表达载体为表达载体pCAMBIA3301。
本发明提供了过表达上述大豆GmNAC56基因的表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)线性化表达载体pCAMBIA3301；
(2)将GmNAC56基因连接至pEASY-Blunt载体上，得到pEASY-Blunt-GmNAC56，以pEASY-Blunt-GmNAC56为模板，两端带有载体末端序列的特异性引物进行PCR扩增，得到GmNAC56目的片段；
(3)将步骤(2)得到的GmNAC56目的片段插入步骤(1)中的线性化后的表达载体pCAMBIA3301中得到过表达所述大豆GmNAC56基因的载体pCAMBIA3301-GmNAC56。
本发明还提供了上述大豆GmNAC56基因或上述过表达大豆GmNAC56基因的表达载体在提高大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
进一步地，大豆GmNAC56基因通过提高PR蛋白的表达来提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。
进一步地，大豆GmNAC56基因通过提高SOD酶和POD酶的活性来提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。
本发明还提供了一种提高大豆疫霉根腐病抗性的方法，将上述GmNAC56基因或上述过表达大豆GmNAC56基因的表达载体转入作物植株中。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)通过qRT-PCR、ChIP、双荧光素酶报告系统及酵母单杂交试验证明了大豆疫霉菌负调控因子GmAP2通过直接结合GmNAC56启动子区域的GCC-box元件来抑制其转录。
(2)转基因GmNAC56毛状根及对照在接种大豆疫霉菌生理1号小种的抗病性鉴定试验中，过量表达GmNAC56的毛状根提高了大豆对大豆疫霉菌的抗性。
(3)转基因GmNAC56毛状根与对照相比，病程相关蛋白基因(PR)的表达量提高，表明GmNAC56通过调控PR基因的表达来参与到植物的抗病防御反应中。
(4)转基因GmNAC56的毛状根在接种大豆疫霉菌后，SOD酶和POD酶的活性均显著高于对照毛状根，且GmSOD和GmPOD基因的表达量显著高于对照，表明GmNAC56可以通过抗氧化防御途径来提高大豆对大豆疫霉菌的抗性。
附图说明
图1为ChIP试验分析GmAP2直接结合GmNAC56启动子的能力；
图2为酵母单杂交试验验证GmAP2直接结合GmNAC56启动子；
图3为GmNAC56启动子上GCC-box的定点突变；
图4为双荧光素酶报告系统验证GmAP2抑制GmNAC56的表达；
图5为LUC/REN相对活性的检测；
图6为GmNAC56基因的cDNA扩增电泳图，其中，左侧泳道为DNAMarker，DL2000；
图7为GmNAC56基因序列分析；
图8为GmNAC56结构域分析；
图9为GmNAC56氨基酸跨膜结构分析；
图10为GmNAC56基因系统进化树分析；
图11为GmNAC56蛋白的结构分析(二级结构预测)；
图12为GmNAC56蛋白的结构分析(三级结构预测)；
图13为GmNAC56亚细胞定位；
图14为GmNAC56在高抗大豆品种“绥农10”及高感大豆品种“东农50”组织器官中的差异表达量检测；
图15为GmNAC56在高抗大豆品种“绥农10”及高感大豆品种“东农50”接种大豆疫霉菌后受诱导的差异表达分析；
图16为GmNAC56转基因大豆毛状根的抗病性鉴定；
图17为GmNAC56转基因毛状根中PR基因的表达量检测；
图18为GmNAC56转基因毛状根中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的测定，以及GmSOD和GmPOD表达量检测；
图19为GmNAC56基因受不同激素诱导的差异表达。
具体实施方式
本发明提供了大豆GmNAC56基因，所述GmNAC56基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了过表达上述大豆GmNAC56基因的表达载体，包括初始表达载体和GmNAC56基因。
在本发明中，所述初始表达载体为表达载体pCAMBIA3301。
本发明提供了过表达上述大豆GmNAC56基因的表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)线性化表达载体pCAMBIA3301；
(2)将GmNAC56基因连接至pEASY-Blunt载体上，得到pEASY-Blunt-GmNAC56，以pEASY-Blunt-GmNAC56为模板，两端带有载体末端序列的特异性引物进行PCR扩增，得到GmNAC56目的片段；
(3)将步骤(2)得到的GmNAC56目的片段插入步骤(1)中的线性化后的表达载体pCAMBIA3301中得到过表达所述大豆GmNAC56基因的载体pCAMBIA3301-GmNAC56。
本发明还提供了上述大豆GmNAC56基因或上述过表达大豆GmNAC56基因的表达载体在提高大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
在本发明中，大豆GmNAC56基因通过提高PR蛋白的表达来提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。
在本发明中，大豆GmNAC56基因通过提高SOD酶和POD酶的活性来提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性。
本发明还提供了一种提高大豆疫霉根腐病抗性的方法，将上述GmNAC56基因或上述过表达大豆GmNAC56基因的表达载体转入作物植株中。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了GmNAC56基因的验证，GmNAC56为GmAP2转录组测序下调基因，为进一步证实二者的靶向关系，首先如图1所示，预测了GmNAC56启动子区域含有AP2/ERF家族结合的GCC-box元件，其次通过ChIP试验以及图2的酵母单杂交试验证实了GmAP2可以直接结合GmNAC56的启动子。为进一步证明上述结论，将GmNAC56启动子区域的GCC-box元件进行突变(图3)，通过双荧光素酶报告系统验证了GmAP2可以通过直接结合GmNAC56启动子区域的GCC-box元件来抑制其表达(图4，图5)，具体包括如下步骤：
(1)ChIP试验分析GmAP2直接结合GmNAC56启动子的能力：
1)样品的甲醛固定
a.收集新鲜的GmAP2-OE转基因大豆毛状根和转空载体的EV毛状根的各1g，用剪刀剪成5mm的小段后放入50mL离心管中。
b.向离心管中加入37mL甲醛浓度为1％的MC缓冲液(含1％的甲醛)。
c.将离心管置于冰中，抽气泵抽真空渗透固定样品30min。
d.向离心管中加入0.41662g的甘氨酸粉末，终止反应，将离心管放置到转鼓，4℃旋转洗涤30min。
e.弃净MC缓冲液，加入新的MC缓冲液洗涤。
2)核蛋白-DNA抽提
a.配制M1缓冲液、M2缓冲液和M3缓冲液。
b.将样品沥干放入研钵，液氮研磨30min。
c.加入预冷的M1缓冲液并将样品转移到2mL的离心管中。
d.4℃，14000rpm离心5min。
e.用预冷的M2缓冲液重悬沉淀，4℃，14000rpm离心5min。去除上清，重复5-10次。
f.吸取适量的M3缓冲液反复吸打沉淀，然后将离心管放入低温冷冻离心机中离心6min，并重复该步骤6次。
3)DNA的超声破碎
a.吸取适量超声缓冲液反复吸打沉淀。
b.将上述体系放置于超声破碎仪中超声20min，随即转移至低温冷冻离心机中14000rpm低温离心10min，离心结束后将上清转移至新的离心管中。
c.吸取75μL上清作为Input样品保存备用。
4)免疫沉淀反应
a.向上清中加入30μLAnti-Myc琼脂糖珠。
b.将离心管置于转鼓，4℃旋转过夜。
c.4℃，2500rpm离心5min，收集样品。
d.用1mL高盐缓冲液轻轻重悬糖珠，将离心管放置到转鼓，4℃旋转8min，重复4次。
e.用1mL IP缓冲液轻轻重悬琼脂糖珠，将离心管放置到转鼓，4℃旋转8min，重复4次。
f.4℃，2500rpm离心5min，弃净上清。
g.用移液枪吸取洗脱缓冲液200μL到琼脂糖珠并充分混匀洗脱，将离心管置于金属浴上65℃孵育15min，13000rpm离心5min，转移上清到新的1.5mL离心管中。重复洗脱2次。
h.将收集的洗脱样品13000rpm离心5min，取上清用于后续DNA分析。
5)DNA分析
a.用移液枪吸取适量5M氯化钠到洗脱样品，将离心管置于金属浴上65℃孵育过夜。
b.用移液枪吸取适量RnaseA到离心管，充分混匀后将离心管置于水浴锅37℃孵育25min。
c.用移液枪吸取适量Proteinase K到离心管，充分混匀后将离心管置于水浴锅42℃孵育2h。
d.用移液枪吸取适量异戊醇和氯仿，充分混匀，将离心管放入离心机14000rpm室温离心8min。
e.将异丙醇提前预冷，用移液枪吸取上清到新的离心管并加入等体积异丙醇，混匀后-20℃静置2h。
f.将离心管放入离心机14000rpm室温离心15min，弃净上清，用40μL水洗脱DNA，并用于后续qRT-PCR检测。
(2)酵母单杂交试验验证GmAP2结合GmNAC56启动子能力
将GmNAC56的启动子连接至pHIS2酵母单杂交载体上，根据GmNAC56的启动子序列，pHIS2的载体序列，选择EcoRI和SacI作为酶切位点，具体引物序列见表1。
表1 pGmNAC56连接酵母单杂交载体的引物序列
(3)双荧光素酶报告系统
构建pGmNAC56-pGreenII 0800载体，并按照天根快速定点突变试剂盒的说明将GmNAC56启动子的GCC-box元件进行定点突变。将报告载体及效应载体分别转化至烟草叶片中，具体转化步骤如下：
1)农杆菌注射烟草
a.在超净工作台内取菌液至适量YEP培养基中，恒温摇床28℃、220rpm条件下培养过夜。
b.二次扩繁菌液至OD600约为0.6。
c.将菌液转移至50mLEP管中，8000×g离心10min，倒掉废液。
d.取10mL农杆菌侵染液(10mM MES，150mM乙酰丁香酮，10mM MgCl2)重悬菌体并调整OD600约为0.8，然后将体系避光25℃条件下平衡4h。
e.选择生长至6-7片叶片的烟草植株，将相应载体的农杆菌共注射至烟草叶片中，同时设置好阳性对照和阴性对照。
2)将烟草植株放在室温暗培养3d后放入化学发光成像系统成像。
实施例2
本实施例提供了大豆GmNAC56基因的克隆方法和载体构建方法，从高抗大豆疫霉根腐病生理1号小种“绥农10”(购自黑龙江省龙科种业集团有限公司)中分离克隆了GmNAC56基因(图6)，并将其连接到了过表达植物表达载体pCAMBIA3301以及干扰植物表达载体pFGC5941上，具体包括如下步骤：
(1)引物设计
根据GmNAC56的编码区序列，用Primer Premier 5设计引物扩增该基因的CDS全长序列，引物序列如下：
GmNAC56 F(SEQ ID NO.4)：5’-ATGGAAAGCACCGACTCATC-3’；
GmNAC56 R(SEQ ID NO.5)：5’-CTAAGCATACCAATTCATTC-3’。
(2)RNA提取
取高抗大豆品种“绥农10”的叶片样品，在液氮中磨成粉末，按照如下方法进行RNA抽提：
1)取100mg上述样品粉末于1.5mL的离心管中，加入1mL Trizol试剂(Takala公司，日本)，立即震荡20s使其充分裂解并放置于冰上5min。
2)向上述EP管中加入200μL氯仿，充分混匀并静置8min。
3)将EP管加入低温冷冻离心机中，在4℃，12000×g下离心15min，离心结束后吸取500μL上清到新的AXgen无酶EP管。
4)取等量异丙醇到EP管中混匀，随后置于冰上静止8min。
5)4℃，12000×g离心10min，弃上清，使用由DEPC水配制的75％乙醇清洗沉淀。
6)弃上清，待沉淀干燥后，加入适量DEPC水溶解RNA。
(3)RNA的反转录
RNA的反转录参照ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司，日本)说明书的使用说明进行。
(4)PCR反应
以上述得到的cDNA为模板，使用已合成好的扩增引物序列，配制如表2所示的PCR反应体系，克隆GmNAC56的CDS序列(1128bp)。反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火5s，68℃延伸5s，变性、退火、延伸进行35个循环；68℃最终延伸10min。将PCR扩增得到的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后切胶回收目的片段连接至pEASY-Blunt载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后进行测序比对。
表2 GmNAC56克隆的PCR反应体系，50μL
(5)重组表达载体的构建
1)载体的线性化
载体质粒的提取方法参照AXgen质粒提取说明书(AXgen公司，美国)的使用说明进行。
2)用移液枪吸取洗脱质粒进行双酶切，酶切体系如表3所示：
表3载体双酶切体系，10μL
3)胶回收
参照OMEGA公司的胶回收试剂盒说明书对酶切后的载体进行胶回收。
4)GmNAC56目的片段的扩增
按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(全式金公司，中国)说明书，利用Vazyme官网引物设计软件CE Design V1.04分别设计两端带有载体末端序列的特异性引物，以pEASY-Blunt-GmNAC56为模板，PCR扩增出GmNAC56的目的片段。
5)重组反应
a.利用超微量核酸蛋白分析仪检测胶回收产物的浓度，并做稀释，确保重组反应加样符合线性化载体和插入片段的最佳使用量。
b.冰上配置以下重组反应体系，具体如表4所示：
表4重组表达载体的反应体系，20μL
6)大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞的转化
a.用移液枪将PCR管中的反应液转移到100μLTrans1-T1感受态细胞中，轻柔混匀。
b.将混合体系置于冰上25min，然后转移到到42℃水浴锅热激45s，再立刻冰浴2min。
c.在超净工作台内用移液枪取LB液体培养基500μL，恒温摇床37℃、150rpm条件下复苏1h。
d.室温条件下5000×g离心2min，在超净工作台内用移液枪取出适量上清并将剩余上清重悬菌体，取复苏菌液200μL于LB平板培养基(含50mg/mLKana)涂布均匀，接下来将其放置于37℃培养箱恒温培养过夜。
7)菌液PCR
a.在培养平板上挑取若干单菌落于适量LB筛选培养基(含50mg/mLKana)，恒温摇床37℃、220rpm条件下培养过夜。
b.在超净工作台内取2μL培养菌液进行PCR扩增，PCR反应体系如表5所示：
表5重组表达载体菌液PCR鉴定体系，25μL
在PCR仪上进行扩增反应，PCR设置为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；变性、退火、延伸进行30个循环；72℃最终延伸10min。
c.PCR反应结束后从PCR反应管中取20μL反应液进行电泳。
d.选择目的条带扩增成功的样品对应菌液保存为甘油菌，并提取质粒转化至农杆菌K599感受态中。
实施例3
本实施例提供了大豆GmNAC56基因的生物信息学分析，其CDS全长为1128bp(图7)，含有一个NAC结构域(图8)，用TMHMM软件预测GmNAC56的氨基酸跨膜结构，发现其不是膜上的受体(图9)，且与天鹅绒豆MpNAC56的同源率最高(图10)。二级结构预测结果表明其包括15.47％的α-螺旋(h)，15.73％的扩展长链(e)，2.13％的β转角(t)和66.67％的无规则卷曲(c)(图11)。进一步的三级结构预测结果表明其包含3个α-螺旋结构和7个β-折叠结构(图12)，且其定位于细胞核(图13)，具体分析软件如表6所示：
表6具体生物信息学的网站及数据库
实施例4
本实施例提供了大豆GmNAC56基因的表达模式分析，待高抗大豆品种“绥农10”及高感大豆品种“东农50”(分别购自黑龙江省龙科种业集团有限公司和黑龙江省广民种业有限责任公司)幼苗长至V1期，分别进行组织差异性分析及疫霉菌处理分析。结果表明，GmNAC56在子叶中表达量最高，其次是叶、茎、根，并且在大豆抗病品种“绥农10”中相应器官的相对表达量均极显著高于“东农50”(图14)。此外，在“绥农10”接种P.sojae后，GmNAC56的表达量逐步上升，在9h时达到峰值，接下来迅速下降，在72h时表达量降到最低，而在“东农50”中GmNAC56的表达量无显著变化。以上结果说明GmNAC56能够受P.sojae的诱导表达，且在“绥农10”中的表达量显著高于“东农50”(图15)。具体步骤如下：
(1)不同组织器官的差异性表达：挑选长势良好的东农50及绥农10幼苗，分别取其根、茎、叶和子叶样品速冻于液氮中，提取其RNA并反转录成cDNA，具体提取方法详见前述，接下来以cDNA为模板利用qRT-PCR的试验方法分析GmNAC56在不同品种的不同组织器官中的差异表达。
(2)疫霉菌处理：将黑龙江省优势生理小种大豆疫霉菌生理1号小种(由中国微生物菌种保藏中心提供)接种于东农50和绥农10的下胚轴，随后将处理组和对照组分别于相应时间点取样，用液氮将取得的样品速冻，并存于-80℃备用。
实施例5
本实施例提供了GmNAC56基因在提高大豆对大豆疫霉根腐病胁迫抗性中的应用，结果如图16所示，与EV毛状根接种P.sojae 48h相比，GmNAC56-OE的转基因阳性毛状根发病较轻，无明显发病症状。而GmNAC56-RNAi的转基因阳性毛状根发病严重，接种部位及四周呈黑褐色并伴有一定程度的软腐。进一步的PR蛋白基因表达量检测结果表明，在GmNAC56-OE的转基因阳性毛状根中，PR1、PR3、PR4、PR10的表达量极显著高于EV(**P<0.01)，而PR2的表达量和EV相比无显著差异。而在GmNAC56-RNAi的转基因阳性毛状根中，PR1、PR3、PR4、PR10的表达量极显著低于EV(**P<0.01)，PR2的表达量和EV相比无显著变化(图17)，以上结果表明，GmNAC56可以正调控PR1、PR3、PR4、PR10的表达，从而提高大豆对大豆疫霉菌的抗性。相应的SOD酶及POD酶生理指标测定结果表明，过表达GmNAC56可以提高SOD酶和POD酶的活性，进而提高大豆毛状根对大豆疫霉菌的抗性。上述结果表明，GmNAC56是响应P.sojae侵染的正调控因子，具体步骤如下：
(1)GmNAC56转基因大豆阳性毛状根的获得
1)培养基和侵染液的配制
萌发培养基(1L)：6-BA 1.0mg，B5混合盐3.21g，蔗糖20g，琼脂8g，PH:5.8；
侵染液(1L)：MgCl210mM，乙酰丁香酮150mM；
根诱导培养基(1L)：羧苄250mg，头孢250mg，MS盐2.215g，MES 0.6g，蔗糖20g。
2)大豆种子的萌发：
选取生长健康、颗粒饱满、大小均匀的东农50大豆种子，氯气消毒过夜。接下来在超净工作台内用高温灭菌的镊子将消毒后的大豆种子种于种豆培养基上，并置于光照培养架上室温光下培养6d。
3)农杆菌侵染：
a.吸取100μL含p35S:GmNAC56-Flag和GmNAC56-RNAi重组质粒的K599发根农杆菌至10mL的YEP培养基(含50mg/L Kana)中，恒温摇床28℃、220rpm条件下培养过夜。
b.在超净工作台内吸取800μL扩繁菌液，二次接种活化至OD600约为0.6。
c.将上述菌液在离心机中8000×g离心15min，倒掉废液，用侵染液重悬活化后的含p35S:GmNAC56-Flag和GmNAC56-RNAi重组质粒的K599发根农杆菌菌体。
d.在超净工作台内用高温灭菌后的手术刀在子叶外部打一个凹陷伤口，然后将子叶均匀的排布在配制的根诱导培养基上。
e.吸取适量重悬菌体到子叶伤口处。
f.将根诱导培养基置于光照培养架上室温培养20d。
g.获取大豆毛状根。
(2)GmNAC56转基因大豆阳性毛状根的检测
1)过表达GmNAC56转基因大豆阳性毛状根的检测
a.参照Biosharp GUS染色试剂盒(兰杰柯科技有限公司，北京)的说明书对获得的GmNAC56-OE和EV(pCAMBIA3301)大豆毛状根进行染色鉴定，具体方法如下：用刀片截取约为2mm的大豆毛状根，放置于PCR管中。将事先配制的GUS染色工作液加入到PCR管中，将试验材料充分覆盖。待加完GUS染色工作液后，将样品用锡纸避光保存，并在室温条件下过夜，第二天观察根部组织的染色情况。
b.提取GmNAC56-OE和EV毛状根的蛋白，以Anti-Flag为抗体进行Western Blot检测。
c.利用qRT-PCR检测GmNAC56-OE毛状根中GmNAC56的表达量。
2)干扰GmNAC56转基因大豆阳性毛状根的检测
a.提取GmNAC56-RNAi大豆毛状根的DNA，对转GmNAC56-RNAi的大豆毛状根进行外源bar基因检测。
b.利用qRT-PCR检测GmNAC56-RNAi毛状根中GmNAC56的表达量。
(3)GmNAC56转基因大豆毛状根的抗性分析
选取生长状态及长度一致的单条毛状根，置于湿润的白色医用纱布上，其中一端对齐垫于凹槽载玻片上，用于滴加接种大豆疫霉菌游动孢子。接菌48h后观察并用尼康D7000照相机拍照。随后取样液氮中速冻提取毛状根RNA，利用qRT-PCR检测疫霉菌的生物量积累。
(4)病程相关蛋白基因(PR)的表达量检测
利用qRT-PCR检测GmNAC56毛状根中PR基因的表达量，具体引物序列见表7：
表7 PR基因的qRT-PCR引物序列
(5)GmNAC56转基因大豆毛状根生理指标的测定
根据苏州科铭生物技术公司的SOD和POD试剂盒说明，测定GmNAC56转基因大豆毛状根的SOD和POD活性。
综合现有试验结果，通过大豆疫霉菌负调控因子GmAP2的转录组测序结果筛选出其直接调控的下游靶基因GmNAC56，并发现过量表达GmNAC56基因可以提高大豆对大豆疫霉菌的抗性，主要表现在GmNAC56的抗病性表型鉴定、病程相关蛋白基因PR的表达量提高以及SOD酶和POD酶活性的提高等特征(见图16、图17及图18)。此外，GmNAC56还可受到水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸不同程度的诱导表达，表明其可能作为生物及非生物胁迫的交联因子在逆境胁迫中发挥重要作用(图19)。
由以上实施例和实验例可知，本发明提供了大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用，所述GmNAC56基因过表达可以提高作物对大豆疫霉根腐病的抗性，为抗大豆疫霉根腐病相关机制研究提供了重要的基因基础及理论支持。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.过表达GmNAC56基因在提高大豆对大豆疫霉根腐病抗性中的应用，其特征在于，所述GmNAC56基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
2.过表达GmNAC56基因的表达载体在提高大豆对大豆疫霉根腐病抗性中的应用，其特征在于，所述GmNAC56基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，大豆GmNAC56基因通过提高PR蛋白的表达来提高大豆对大豆疫霉根腐病的抗性。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，大豆GmNAC56基因通过提高SOD酶和POD酶的活性来提高大豆对大豆疫霉根腐病的抗性。
5.一种提高大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于，将GmNAC56基因转入大豆植株中，所述GmNAC56基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
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