CN110499325B - TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种TRV‑based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。包括：A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；B、将DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；C、将pTRV1、重组载体分别转化农杆菌，所得转化子共同侵染植株。本发明首次证明TRV可成功应用于小报春基因沉默和功能验证，为报春花属植物的基因功能验证奠定了基础。本发明方法简单、研究周期短、无需基因全长和转化体系，获得目的表型效率高，可实现大量基因的快速功能验证。与现有的VIGS体系相比，本发明表型持续时间长，且在植株的不同部位均出现表型变化，对报春花属异型自交不亲和的遗传学研究具有重要意义。

Description

TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。

背景技术

基因沉默(Gene silencing)是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后的基因沉默(PTGS)，由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因一致或高度同源的植物内源mRNA序列的特异性降解。VIGS技术与转基因技术相比具有操作简单和快速有效的优点，是一种较好的用于基因功能验证的反向遗传学工具。

经人工改良后的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)是目前应用最为广泛的VIGS载体。与其他病毒载体相比，TRV载体能有效地将沉默信号传递到植物的生长点，还具有沉默效率高、持续性好、寄主植物病毒症状轻等诸多优点。

小报春(Primulaforbesii)所属的报春花属中约有91％的物种都存在有异型自交不亲和(hetermorphic self-incompatibility)的特性。该性状引起了科学家的兴趣。研究表明，异型自交不亲和是由S位点控制的，S位点上包含至少3个紧密连锁的基因G、P、A，其中G控制花柱高度、P控制花粉大小、A控制花药位置。由于小报春尚未建立起遗传转化体系，限制了对S位点上基因功能的研究。因此，在小报春中建立一套快速、高效的VIGS体系十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法，包括以下步骤：

A、根据报春花属植物目标基因，设计引物并扩增出该目标基因的DNA片段；

B、将上述DNA片段连接到pTRV2载体上，得到重组载体；

C、将上述重组载体、pTRV1载体分别转化农杆菌，得到的转化子共同侵染植株，经检测具有病毒载体且目的基因表达量显著降低的植株，即为目标基因沉默的植株。

所述报春花属植物包括但不限于小报春。

所述目标基因包括但不限于八氢番茄红素脱氢酶基因(Phytoenedesaturase，PDS)。

例如，所述DNA片段是以小报春cDNA基因组为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增得到的；

所述引物F和R分别为：5’-TTAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’和5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’。(SEQ ID NO:1-2)

第二方面，本发明提供TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法，包括以下步骤：

1)重组载体构建：利用基因工程的方法将扩增后的小报春八氢番茄红素脱氢酶(PfPDS)基因片段连接到pTRV2载体中，得到重组载体pTRV2-PfPDS；

2)农杆菌转化及培养：将载体pTRV1、pTRV2-PfPDS分别转化农杆菌，得到转化子TRV1、TRV2-PfPDS，进行增殖培养；

3)小报春叶背注射侵染：用注射器将含有TRV1和TRV2-PfPDS的侵染液混合后注射入小报春的叶背中；

4)将侵染后的幼苗培养成植株。

前述的方法，步骤3)所述小报春采用培养至6-9片真叶的小苗。

步骤1)具体如下：

a.提取小报春叶片总mRNA，反转录成第一链cDNA；

b.以第一链cDNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增得到小报春PDS基因片段；

c.将上述小报春PDS基因片段构建到pTRV2载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，即得重组载体pTRV2-PfPDS。

步骤3)所述的侵染液中含有200μM乙酰丁香酮、10mM氯化镁和10mM吗啉乙磺酸，pH＝5.6。其中，TRV1和TRV2-PfPDS按等比例混合。

前述的方法，步骤4)包括：将侵染后的幼苗暗处理一天，第二天正常光周期养护；恒温培养条件：光照16h，22℃；黑暗8h，18℃。

第三方面，本发明提供一种TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默系统，所述基因沉默系统包括载体pTRV1以及含有小报春目标基因DNA片段的pTRV2重组载体。

在本发明的一个具体实施方式中，TRV病毒载体介导的小报春基因沉默的方法，具体步骤如下：

1、实验材料的获得：在MS培养基上播种，培养至6-9片真叶的小苗后出瓶，出瓶后小苗在人工气候室内培养，备用。培养条件：光照300μmol·m^-2·s^-1，16h，黑暗8h，白天温度22℃，黑暗18℃，湿度为60％。

2、重组载体构建：用基因工程的方法将扩增后的小报春八氢番茄红素脱氢酶(PfPDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组子pTRV2-PfPDS。具体步骤如下：

cDNA的准备：按Trizol的方法提取小报春叶片总mRNA，按天根反转录试剂盒操作说明进行总mRNA的反转录，获得小报春cDNA，稀释20倍后，-20℃备用。

小报春PDS基因片段(PfPDS)的扩增：引物设计参考In-fusion引物设计原则设计PCR引物，参见网址：http://bioinfo.clontech.com/infusion/。上游引物：5’-TAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’，下游引物：5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’，PCR产物为302bp的小报春PDS基因片段。以小报春第一链cDNA为模板，用全式金2×EasyTaq PCR SuperMix(货号：ASⅢ)进行目的片段PCR，采用50μl体系扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR产物进行电泳检测，并进行胶回收cDNA，-20℃备用。

pTRV2-PfPDS重组载体的构建：经胶回收的cDNA与经过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切并且胶回收后的线性pTRV2质粒用In-fusion酶进行连接(参见TaKaRa公司In-Fusion HDCloning Kits说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素抗生素的LB平板培养基，37℃倒置培养12h，挑取单克隆菌斑至含有100mg/L卡那霉素抗生素的液体LB中，37℃，200r/min震荡培养12h，提取质粒，测序正确的重组质粒，-20℃保存备用。

3、农杆菌转化及培养；具体步骤如下：

3.1将pTRV2-PfPDS、pTRV2、pTRV1载体分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV2-PfPDS、pTRV2、pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV2-PfPDS、TRV2和TRV1，甘油保菌，-80℃保存备用。其中，液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态的过程为：农杆菌感受态GV3101购自博迈德公司，取5μl重组质粒(上步获得)加入冰上融化的50μl GV3101中，冰浴30min，液氮速冻3min，37℃金属浴5min，冰浴2min，后加入500μl无抗生素液体LB培养基中复活培养4h，培养条件为，28℃，200r/min。

3.2将3.1中保存的带有外源质粒的菌液涂到含100mg/L卡那霉素+100mg/L庆大霉素+50mg/L利福平三种抗生素的LB平板培养基上长出单克隆菌斑。

3.3分别挑取3.2中的单克隆放于含有100mg/L卡那霉素+100mg/L庆大霉素+50mg/L利福平三种抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；然后以1:20体积比转入诱导LB(100mg/L卡那霉素+100mg/L庆大霉素+50mg/L利福平+10mmol/L吗啉乙磺酸+20μmol/L乙酰丁香酮)中进行诱导培养12h。

3.4侵染液的配置，以无菌水为母液，并加入200μmol/L乙酰丁香酮，10mmol/L氯化镁，10mmol/L吗啉乙磺酸，pH调至5.6，现用现配。

3.5将3.3得到的TRV1、TRV2、TRV2-PfPDS单克隆菌体离心获得菌体，分别用3.4配置的侵染液稀释至OD₆₀₀＝1.0，静置1h后，将TRV1与TRV2、TRV1与TRV2-PfPDS分别以体积比1:1混匀。

4、小报春叶背注射侵染

用1ml注射器将3.5获得的含有菌体的混合侵染液注入小报春真叶的叶背中，用手指拖住叶片，将不带针头的注射器对准叶背远轴端向内注射含菌体的侵染液，注射后黑暗处理一天，第二天正常光周期养护。恒温培养条件：光照16h，22℃；黑暗8h，18℃，湿度60％。

5、结果统计及验证

侵染17天后，陆续出现光漂白现象，对其进行统计，并采集叶片进行RNA提取、通过RT-PCR检测病毒载体，以及qRT-PCR检测目的基因表达量，验证基因沉默效果。

第四方面，本发明提供小报春PfPIN5基因(SEQ ID NO:5)在控制植株花柱长短中的应用。弱化小报春植株中PfPIN5基因，可导致花柱缩短。所述弱化包括敲除或降低基因的表达。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次证明TRV可成功应用于小报春基因沉默和功能验证，为报春花属植物的基因功能验证奠定了良好的基础。本发明方法简单、研究周期短、无需基因全长和转化体系，并且获得目的表型效率高，因此可以实现对大量基因快速进行功能验证。与现有的基于其他病毒载体的VIGS体系相比，本发明表型持续的时间较长，从营养生长一直持续至生殖生长阶段。在小报春植株的不同部位均出现表型变化，适合于生长发育相关基因的研究，对报春花属异型自交不亲和的遗传学研究具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中小报春刚出瓶幼苗状态(左)，注射后状态(右)。

图2为本发明实施例1中TRV2-PfPDS侵染后不同时期白化现象。侵染后第17天(上-左)、侵染后第23天(上-右)、侵染后第40天(下-左)与侵染后第70天(下-右)。

图3为本发明实施例1中未侵染植株和侵染植株对比图。CK：未侵染植株(上-左)、TRV2空载侵染后叶片无白化现象(上-右)与TRV2-PfPDS：携带PfPDS基因侵染后出现白化现象(下)的对比图。

图4为本发明实施例1中侵染后新萌发叶片PCR检测病毒，TRV1与TRV2病毒检测。

图5为本发明实施例1中PDS基因表达量检测结果。CK：未侵染植株叶片，TRV2：空载侵染植株叶片，TRV2-PfPDS：携带PfPDS基因侵染出现光漂白的植株叶片。

图6为本发明实施例1中PfPDS基因沉默后小报春开花后整株状态(左)与各部位白化现象(右)。

图7为本发明实施例1中小报春开花后PDS基因在不同部位表达量检测结果。CK：未侵染植株，TRV2：空载侵染植株，TRV2-PfPDS：携带PfPDS基因侵染出现光漂白的植株。叶：叶片，梗：花梗，萼：萼片。

图8为本发明实施例2中未侵染植株和侵染植株对比图。CK：未侵染植株花柱(左)、TRV2空载侵染后花柱无表型变化出现(中)，以及TRV2-PfPIN5：携带PfPIN5基因侵染后花柱出现缩短现象(右)的对比图。

图9为本发明实施例2中侵染后雌蕊PCR检测病毒，TRV1与TRV2病毒检测。

图10为本发明实施例2中PIN5基因表达量检测结果。CK：未侵染植株雌蕊，TRV2：空载侵染植株雌蕊，TRV2-PfPIN5：携带PfPIN5基因侵染出现花柱缩短的植株雌蕊。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法

1、实验材料的获得：在MS培养基上播种，培养至6-9片真叶的小苗后出瓶，出瓶后小苗在人工气候室内培养，备用。培养条件：光照300μmol·m^-2·s^-1，光照16h，黑暗8h，白天温度22℃，黑暗18℃，湿度为60％。

2、重组载体构建：用基因工程的方法将扩增后的小报春八氢番茄红素脱氢酶(PfPDS)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组子pTRV2-PfPDS。具体步骤如下：

cDNA的准备：按Trizol的方法提取小报春叶片总mRNA，按天根反转录试剂盒操作说明进行总mRNA的反转录，获得小报春cDNA，稀释20倍后，-20℃备用。

小报春PDS基因片段(PfPDS)的扩增：引物设计参考In-fusion引物设计原则设计PCR引物，参见网址：http://bioinfo.clontech.com/infusion/。上游引物：5’-TAAGGTTACCGAATTCATACCGGCTTGTGAC-3’，下游引物：5’-GCTCGGTACCGGATCCGCAAATCGATGCACT-3’，PCR产物为302bp的小报春PDS基因片段。以小报春第一链cDNA为模板，用全式金2×EasyTaq PCR SuperMix(货号：ASⅢ)进行目的片段PCR，采用50μl体系扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR产物进行电泳检测，并进行胶回收cDNA，-20℃备用。

pTRV2-PfPDS重组载体的构建：经胶回收的cDNA(SEQ ID NO:3)与经过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切并且胶回收后的线性pTRV2质粒用In-fusion酶进行连接(参见TaKaRa公司In-Fusion HD Cloning Kits说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那抗生素的LB平板培养基，37℃倒置培养12h，挑取单克隆菌斑至1ml含有100mg/L卡那霉素抗生素的液体LB中，37℃，200r/min震荡培养12h，提取质粒，测序正确的重组质粒，-20℃保存备用。

3、农杆菌转化及培养；具体步骤如下：

3.1将pTRV2-PfPDS、pTRV2、pTRV1载体分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态中，经菌液PCR鉴定正确后，得到分别含有质粒pTRV2-PfPDS、pTRV2、pTRV1的农杆菌GV3101阳性菌株，记为TRV2-PfPDS、TRV2和TRV1，甘油保菌，-80℃保存备用。

其中，液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态的过程为：农杆菌感受态GV3101购自博迈德公司，取5μl重组质粒(上步获得)加入融化的50μl GV3101中，冰浴30min，液氮速冻3min，37℃金属浴5min，冰浴2min，后加入500μl无抗生素液体LB培养基中复活培养4h，培养条件为，28℃，200r/min。

3.2将3.1中复活的菌液，5000r/min离心2min后，吸掉上清，留50μl，吸打混匀菌体后涂到含100mg/L卡那霉素+100mg/L庆大霉素+50mg/L利福平三种抗生素的LB平板培养基上长出单克隆菌斑。

3.3分别挑取3.2中的单克隆放于含有100mg/L卡那霉素+100mg/L庆大霉素+50mg/L利福平三种抗生素的LB液体培养基培养，以实现单克隆的增殖；对菌液进行PCR检验后，将带有重组子的单克隆菌液以1:20体积比转入诱导LB(100mg/L卡那霉素+100mg/L霉素庆大+50mg/L利福平+10mmol/L吗啉乙磺酸+20μmol/L乙酰丁香酮)中进行诱导培养12h。

3.4侵染液的配置，以无菌水为母液，并加入200μmol/L乙酰丁香酮，10mmol/L氯化镁，10mmol/L吗啉乙磺酸，PH调制5.6，先用现配。

3.5将3.3得到的TRV1、TRV2、TRV2-PfPDS单克隆菌体离心获得菌体，分别用3.4配置的侵染液稀释至OD₆₀₀＝1.0，静置1h后，将TRV1与TRV2、TRV1与TRV2-PfPDS分别以体积比1:1混匀。

4、小报春叶背注射侵染

用1ml注射器将3.5获得的含有菌体的混合侵染液浸入小报春真叶的叶背中，用手指拖住叶片，将不带针头的注射器对准叶背远轴端向内注射含菌体的侵染液，注射后黑暗处理一天，第二天正常光周期养护。恒温培养条件：光照16h，黑暗8h，光照温度22℃；黑暗温度18℃，湿度60％。

5、结果统计及验证

对小报春组培苗出瓶后进行侵染(图1)。侵染17天后，新生叶片开始出现光漂白现象(图2和图3)，采集叶片进行RNA提取、通过RT-PCR检测病毒载体，以及qRT-RCR检测目的基因表达量，验证基因沉默效果。分别采集未侵染植株CK、TRV2空载侵染植株和带有标记基因TRV2-PfPDS侵染植株的新叶，检测TRV2-PfPDS、TRV2和TRV1是否成功侵染了植株，本发明结果表明病毒均成功侵染了小报春植物体(图4)；以叶片中表达稳定的PfEIF5A为内参基因，检测TRV2-PfPDS、TRV2和TRV1对目的基因表达量的影响，确认是否出现了目的基因沉默，结果发现，TRV2-PfPDS重组质粒成功降低了小报春叶片PDS基因的表达量(图5)，达到了基因沉默的效果。最后，统计侵染成功的植株，经计算小报春叶片VIGS侵染成功效率可达60％。继续培养至开花，发现整个花序从花葶到花梗再至萼片均出现白化现象(图6)。分别取各部位样品检测PfPDS基因的表达量，发现该基因在不同部位均被沉默(图7)。说明本发明可以用于研究小报春的花部性状。所涉及的PCR及荧光定量引物分别为：

TRV1-F：5’-TTACAGGTTATTTGGGCTAG-3’

TRV1-R：5’-CCGGGTTCAATTCCTTATC-3’

TRV2-F：5’-TGTTTGAGGGAAAAGTAGAGAACGT-3’

TRV2-R：5’-TTACCGATCAATCAAGATCAGTCGA-3’

qPCR-PfPDS-F：5’-CTGCACATTTGGGTAAG-3’

qPCR-PfPDS-R：5’-TGTCTTAGGTGGAAAGG-3’

qPCR-PfEIF5A-F：5’-CTCATGTCAACCGTACTGAC-3’

qPCR-PfEIF5A-R：5’-GCCTCAAATCATCCTTGGT-3’

本发明利用小报春PDS基因片段来沉默注射部位及新萌发的小报春叶片中的PDS基因，能够快速高效地实现小报春PDS基因沉默，新萌发出的叶片及花序均呈现出光漂白现象。本发明首次在小报春中成功建立TRV介导的病毒沉默系统，并成功地沉默了小报春中的标记基因，VIGS侵染成功效率可达60％。本发明方法简便、快捷、低成本、不需要基因全长和遗传转化体系，且本发明沉默效率高，为在小报春中进行基因功能验证提供了可靠的技术手段。

实施例2利用VIGS分析小报春中生长素外输蛋白基因功能

生长素参与调节植物生长发育的各个过程，例如细胞分裂和细胞伸长。在组织、器官和整个植株水平上都表现出生理多效性。而生长素在细胞间的运输依赖于细胞膜定位的载体。生长素外输蛋白PIN-FORMED(PIN)是一类重要的向细胞外跨膜运输生长素的蛋白。有报道称沉默小麦中的TaPIN1基因会使植株变矮(Kanwardeep,2011)，而PtPIN8基因则与枸橘的根毛长度负相关(Liu et al.，2108)。PIN基因可能通过影响生长素的转运与再分配从而影响到细胞的伸长或分裂,最终影响整个植物或器官的高度或长度。本发明前期从小报春转录组数据中(卢婉佩，2018)筛选到在长花柱小报春和短花柱小报春的雌蕊中差异表达的基因PfPIN5，猜测该基因与小报春花柱的长短有关。本实施例利用TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法，沉默小报春长花柱型植株的PIN5基因，并通过观察小报春花柱性状表型变化来对PIN5基因进行功能性分析。

利用本发明所述的TRV-based病毒诱导的小报春基因沉默的方法，沉默小报春PIN5基因的具体步骤如下：

1、实验材料的获得：八月中旬播种于粒径为0-10mm的草炭土上，待长至5-6片真叶后上盆，上盆基质为草炭土：珍珠岩＝3:1(体积比)。在温室中培养至花芽分化完成，花葶尚未抽出时。

2、重组载体构建：用基因工程的方法将扩增后的小报春生长素外输蛋白(PfPIN5)基因片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组子pTRV2-PfPIN5。具体步骤如下：

cDNA的准备：按Trizol的方法提取小报春长花柱类型植株雌蕊的总mRNA，按天根反转录试剂盒操作说明进行总mRNA的反转录，获得小报春cDNA，稀释20倍后，-20℃备用。

小报春PIN5基因片段(PfPIN5)的扩增：引物设计参考In-fusion引物设计原则设计PCR引物，参见网址：http://bioinfo.clontech.com/infusion/。上游引物：5’-TAAGGTTACCGAATTCATGATTGGGTGGGAGGAA-3’，下游引物：5’-GCTCGGTACCGGATCCCTAAGTCGACGCCCAT-3’，PCR产物为400bp(SEQ ID NO:4)的小报春PIN5基因片段。以小报春第一链cDNA为模板，用全式金2×EasyTaq PCR SuperMix(货号：ASⅢ)进行目的片段PCR，采用50μl体系扩增。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR产物进行电泳检测，并进行胶回收cDNA，-20℃备用。

pTRV2-PfPIN5重组载体的构建：经胶回收的cDNA与经过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切并且胶回收后的线性pTRV2质粒用In-fusion酶进行连接(参见TaKaRa公司In-Fusion HDCloning Kits说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那抗生素的LB平板培养基，37℃倒置培养12h，挑取单克隆菌斑至1ml含有100mg/L卡那霉素抗生素的液体LB中，37℃，200r/min震荡培养12h，提取质粒，测序正确的重组质粒，-20℃保存备用。

农杆菌转化及培养和叶背侵染，采用的方法同实施例1。

3、结果统计及验证

侵染小报春长花柱型植株一个月后对已经开放的花朵进行统计，有19.4％的花朵出现了花柱缩短的表型变化(图8)。分别采集未侵染植株CK、TRV2空载侵染植株和带有标记基因TRV2-PfPIN5侵染植株出现表型变化的雌蕊，提取RNA并反转为cDNA。通过RT-PCR检测病毒载体，以雌蕊中表达稳定的PfEIF5A为内参基因，检测三组处理PfPIN5基因的表达量。结果发现，TRV1和TRV2病毒载体均成功侵入植物体内(图9)，且TRV2-PfPIN5重组质粒成功降低了小报春雌蕊中PIN5基因的表达量(图10)，达到了基因沉默的效果。以上结果表明PfPIN5基因与小报春花柱的长短有关，也证明了本发明构建的VIGS体系能在花部器官有效工作，可用于花部性状的研究。所用PCR及荧光定量引物分别为：

病毒载体检测及内参引物同实施例1。

qPCR-PfPIN5-F：5’-TCCACAATCCATCACTT-3’

qPCR-PfPIN5-R：5’-GAAGGGAAGCCATCATA-3’

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

[1]Kanwardeep S.Identification,characterization and functionalanalysis of auxin efflux carrier gene TaPIN1 in Wheat[D].Ludhiana：PunjabAgricultural University,2011.

[2]Liu C Y,Wang P,Zhang D J,et al.Mycorrhiza-induced change in roothair growth is associated with IAA accumulation and expression of,EXPs,intrifoliate orange under two P levels[J].Scientia Horticulturae,2018,234:227-235.

[3]卢婉佩.胭脂花和小报春花柱二型自交不亲和关键基因的挖掘[D].北京：北京林业大学,2018.

序列表

<110> 北京林业大学

<120> TRV-based病毒诱导的报春花属植物基因沉默的方法

<130> KHP191112986.8

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taaggttacc gaattcatac cggcttgtga c 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcggtacc ggatccgcaa atcgatgcac t 31

<210> 3

<211> 302

<212> DNA

<213> 小报春(Primulaforbesii)

<400> 3

ataccggctt gtgacctgca tctgccaaat attttgctgt ggacaaacca gccaatcctg 60

caccagcaat aacaattttc aacggcttat ccggacgggg agaagctcga aaagacgatg 120

aaaattgacc agcttccaaa aaattgacag tactctcaag gtctggtctg ggatagtcaa 180

tgcaaaccac ctgcaaacgg cctacgccct tcctttgttg atttccagca gcatgtgcaa 240

tggtatcttt aaatctaaca cccatggaac catttgcccc aaatgatagt gcatcgattt 300

gc 302

<210> 4

<211> 400

<212> DNA

<213> 小报春(Primulaforbesii)

<400> 4

atgattgggt gggaggaaat ttacaaagtg gtggtggcaa tggcacctct ctatttagcc 60

ctatttttag ggtacggatc ggttaaatgg tggcacataa tcacaacgcc cgaacaatgt 120

gacgcgataa accgcatggt ttgttacttc actctccctc tcttcacttt tgagtttgcg 180

gctcatatcg acccttttca aatgaactac cggttcatag ccgcagatgc tatagccaaa 240

gtccttatag tggttgtatt agccttttgg gctaagtgta gaggcaaaga gagctattgt 300

tggtcaatca caagcttttc actcaccacc ttgactaact ctttggtcgt cggggttcca 360

ttattgaaac ccatgtatgg ccaaatgggc gtcgacttag 400

<210> 5

<211> 1074

<212> DNA

<213> 小报春(Primulaforbesii)

<400> 5

atgattgggt gggaggaaat ttacaaagtg gtggtggcaa tggcacctct ctatttagcc 60

ctatttttag ggtacggatc ggttaaatgg tggcacataa tcacaacgcc cgaacaatgt 120

gacgcgataa accgcatggt ttgttacttc actctccctc tcttcacttt tgagtttgcg 180

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ttattgaaac ccatgtatgg ccaaatgggc gtcgacttag tcgtgcagtt gtccgtggtt 420

caagcgatcg tctggtatac actgcttttg ttcgtgttgg aaattaggag aaatgggaaa 480

aaaaattata tgcaaaaagt tgtcggagat aatatggaga aagacttaga aggaataagt 540

gataatgatg ttgtggtgag tgatagggcg tcgttttggt acttgatgaa aattgtattg 600

atgaaacttg ctatgaatcc taacacttac ggttgtgttg ctgggattac ttgggcattt 660

gtgtcgaata gatggcattt tcaaatgcct agtataatcg aaggatcggt cctgatcatg 720

tctagagccg gaacgggaac cgccatgttc agtatgggtc tattcatggc atgccaagaa 780

aaagtgatcg catgtggtac aagcctaact ttgtttggta tggttttgaa gttcatagct 840

ggacctttag cctctgtaat tggtgctatt gttgttgggc taaggggtga tgttcttcgc 900

gttgcgatca tcacggcagc ccttccacaa tccatcactt ccttcatatt tgctaaagaa 960

tatggcctgc atgctgaagt gcttagcact gcggtaattt tcggtatgat ggcttccctt 1020

ccgatattga taggttatta tgcagttttg gagcttcttc atcgaaaatg ttaa 1074

Claims (1)

1.降低小报春植株中PfPIN5基因的表达在缩短小报春植株花柱中的应用；其中，PfPIN5基因序列如SEQ ID NO:5所示。

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