CN114752597B - 一种植物保卫细胞特异性表达的干旱诱导型启动子pscbv-chn2及应用 - Google Patents

一种植物保卫细胞特异性表达的干旱诱导型启动子pscbv-chn2及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种植物保卫细胞特异性干旱诱导型启动子及其应用，所述启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明通过检测转基因拟南芥中GUS基因的表达情况，证实了所述启动子具有植物保卫细胞特异性，并且在干旱胁迫下能增加GUS基因在植物保卫细胞中的表达量。因此，所述启动子可用于制备转基因植物和进行植物转基因育种，能有效提高转基因植物的抗旱能力，在植物抗旱基因工程育种方面具有广阔的应用。

Description

一种植物保卫细胞特异性表达的干旱诱导型启动子PSCBV-CHN2 及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和植物遗传育种技术领域，具体涉及一种植物保卫细胞特异性表达的干旱诱导型启动子PSCBV-CHN2及应用。
背景技术
基因工程为植物遗传改良和基因功能验证提供了一种重要手段，但基因的稳定表达却常常受到转录基因沉默或转录后沉默的制约。基因的表达受到顺式作用元件和反式作用因子的共同调控，顺式作用元件包括启动子、增强子和沉默子等DNA序列，其中，启动子是影响基因表达水平的关键因素之一。启动子的调控具有时空表达特性，按调控方式可以分为组成型启动子、诱导型启动子、特异性启动子等。组织或器官特异性启动子的调控受特定的组织细胞结构和化学、物理信号诱导调节，因此，基因的表达往往局限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中过度表达，对植物生长发育产生不利影响。诱导型启动子是指其转录活性保持在低水平甚至停止表达，而当在某些特定的生物、物理或化学信号的刺激下，该类型启动子可以大幅度提高基因的转录表达水平。由于诱导型启动子可以避免组成型启动子的不足之处，选择响应逆境胁迫的诱导型启动子构建植物表达载体，用以驱动目的基因在特定逆境条件下高效表达，是提高植物抗逆能力的一个重要策略，对于植物抗逆能力的调控具有重要意义。因此，近年来，组织特异表达启动子和诱导型启动子已成为植物基因工程研究的热点。
高等植物的气孔由一对保卫细胞包围形成，保卫细胞能够灵敏而准确地响应一系列外源和内源的刺激，如光、干旱以及植物激素等，并通过复杂的信号转导网络改变其膨压使气孔处于最适宜的开闭状态，进而调节植物与环境间的水分和气体交换，因此，对于保卫细胞的研究就变得至关重要。一种在保卫细胞中特异表达的启动子，有利于研究保卫细胞的结构及功能，也为其他相关研究奠定基础。同源的启动子在转基因植株中容易产生启动子甲基化，导致外源基因表达活性降低，甚至基因沉默。挖掘更多的不同来源的启动子，为基因工程提供更多可供选择的启动子具有重要的理论和实践意义。
甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform viruses，SCBV)隶属于花椰菜花叶病毒科，杆状DNA病毒属，是侵染甘蔗的重要病原物之一。SCBV群体存在高度遗传变异，不同SCBV基因型编码的启动子表达模式差异较大，目前已报道的3个SCBV启动子分别来自SCBMOV-MOR、SCBIMV-QLD和SCBV-TX分离物，由于序列存在明显的差异，SCBMOV-MOR启动子在单、双子叶植物转基因植株中呈现组织特异表达启动子或组成型启动子的特性；SCBIMV-QLD启动子在甘蔗转基因植株中呈现的叶片、顶端分生组织和根部中高效表达；而SCBV-TX分离物启动子(SCBV21)在甘蔗转基因植株的蔗茎中的表达活性明显高于蔗叶和根部，尤其在蔗茎维管束和薄壁细胞上高效表达，多样性的功能导致该启动子家族应用前景较为广阔，挖掘SCBV启动子及其功能对现代遗传育种技术具有十分重要的意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种来源于SCBV的启动子，发明人经过研究发现其是一种兼具组织特异性和诱导表达的启动子，能特异表达在植物叶片的保卫细胞中，且在干旱胁迫条件下能提高目标基因的表达，在植物抗旱基因工程育种方面具有广阔的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段在作为植物保卫细胞特异性干旱诱导型启动子中的应用。
本发明还提供了含有如SEQ ID N O：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组表达载体在调控目的基因在植物保卫细胞中表达的应用。
在其中一些实施例中，所述表达盒包括以可表达的方式彼此连接的含有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的DNA片段、由含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段驱动表达的目的基因和终止子。。
在其中一些实施例中，所述重组表达载体为PSCBV-CHN2:GUS载体。所述PSCBV-CHN2:GUS载体为将pCAMBIA1305载体中GUS基因的CaMV 35S启动子序列替换为上述启动子序列后获得的重组载体。
在其中一些实施例中，所述目的基因选自杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因或报告基因。
在其中一些实施例中，所述报告基因为黄色荧光蛋白基因(EYFP基因)或β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)。
本发明还提供了含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组表达载体在提高植物抗旱性能中的应用。
本发明还提供了含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组表达载体在提高植物抗旱性能育种中的应用。
本发明还提供了一种提高植物抗旱能力的方法，包括将含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组载体导入植物中，并通过筛选获得转基因植物。
在其中一些实施例中，将上述的启动子或表达盒或重组载体导入植物中的方法为农杆菌侵染法或基因枪法。
在其中一些实施例中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
在其中一些实施例中，所述植物为甘蔗。
在其中一些实施例中，所述植物为拟南芥。
本发明还提供了一种引物对，其包括如SEQ ID NO：4所示的上游引物和SEQ IDNO：5所示的下游引物。
本发明还提供了扩增如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：以SCBV基因组DNA为模板，利用上述引物对通过PCR扩增获得。
在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix(2×)25.0μL，10μM SEQ ID NO：4所示的上游引物2.0μL，10μM SEQ ID NO：5所示的下游引物2.0μL，H2O 20.0μL。
在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共35个扩增循环；72℃延伸7min。
本发明经过大量的研究和生物信息学分析发现所述如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列存在1个启动区PPR，同时含有启动子所必有的基础表达调控元件TATA-box和转录起始位点TSS。此外，还在其中预测到3个TAAAG元件(TAAAG元件是保卫细胞特异表达启动子所必需的一个重要元件，是保卫细胞特异表达转录因子Dof蛋白的结合位点)和1个与响应干旱有关的顺式元件C-repeat/DR。为此，发明人预测其是一种植物保卫细胞特异性启动子，且能受到干旱条件的诱导，并通过实验进行了验证。
本发明经过研究首次发现，如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段是一种兼具植物保卫细胞组织特异性和干旱诱导表达特性的启动子，可作为构建植物表达载体的元件﹐将其以可表达的方式与目的基因进行连接，可驱动目的基因在植物叶片保卫细胞中表达，且在干旱胁迫下能增加目的基因在保卫细胞中的表达量。因此，可将含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段用于制备转基因植物和植物转基因育种，能有效提高转基因植物的抗旱能力。本发明所述的DNA片段来源于侵染甘蔗的SCBV病毒基因组，由于其与植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生，对于多种作物的抗旱基因工程育种具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为PSCBV-CHN2启动子序列分析图，包括推测的转录起始位点TSS、TATA盒(TATAAAT)、假定的TAAAG元件和C-repeat/DRE元件。
图2为PSCBV-CHN2:GUS植物重组表达载体构建图。
图3为PCaMV 35S:GUS、PUbi1:GUS和PSCBV-CHN2:GUS转基因拟南芥根、茎、叶GUS染色图，比例尺为2mm或100μm。
图4为PSCBV-CHN2:GUS转基因拟南芥在25％PEG6000处理下GUS基因的表达分析，处理6h后的基因表达丰度达到峰值，随后回落。其中，a与b代表两组数据之间具有显著性差异，而a与ab或ab与b之间显著性差异不明显(P<0.05)。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排它的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明首先以感染了SCBV-CHN2甘蔗品种CZ66-70的叶片DNA为模板克隆获得含SCBV基因组序列的质粒，然后以其为模板进行PCR扩增，将扩增产物纯化后连接到Cloning Vector上，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆进行测序，获得了核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
所述DNA分子全长673bp，经过生物信息学分析，发现其存在1个启动区PPR，同时含有启动子所必有的基础表达调控元件TATA-box和转录起始位点TSS。此外，还在其中预测到3个TAAAG元件(TAAAG元件是保卫细胞特异表达启动子所必需的一个重要元件，是保卫细胞特异表达转录因子Dof蛋白的结合位点)和1个与响应干旱有关的顺式元件C-repeat/DR。发明人预测其是一种植物保卫细胞特异性启动子，且能受到干旱条件的诱导，并将其命名为PSCBV-CHN2。
发明人进一步构建获得了含有PSCBV-CHN2的植物双元表达载体PSCBV-CHN2:GUS，并将其转化农杆菌GV3101，筛选获得阳性菌株，然后侵染拟南芥，利用GUS组织化学染色检测发现PSCBV-CHN2:GUS转基因植株中的GUS蛋白主要在叶片气孔的保卫细胞中表达，而在根和茎组织中几乎检测不到GUS表达，说明PSCBV-CHN2是一种植物保卫细胞特异表达启动子。
然后，发明人对转基因拟南芥进行干旱胁迫处理，通过实时荧光定量PCR技术检测PSCBV-CHN2:GUS转基因植株在25％PEG6000渗透胁迫处理3h后，GUS表达量出现上调，在6h后达到最高，为PEG渗透胁迫处理0h对照组的3.8倍，表明PSCBV-CHN2启动子在双子叶植物中具有响应干旱胁迫诱导的能力，在干旱胁迫下能提高目的基因的表达，是一种干旱胁迫诱导型启动子。
SEQ ID NO：1：
AAGAACCAACTCTGCTATGTGGATGCAGAAAGCCTGCAATAAAGCTCACATCCGGCACAAGGCTTAATCCAAGCAGAAGATTTTACAAGTGTGCTATGAACATCTGCCACTGCTGGTATTGGGCAGACTTGCTCGAAGATTACGTACAAGAAAGAATTGAAGAATTCATGTGCGACAACTTCGACAAGAAGATGGGAATGAATGAGGCAAGCTCATCAAACCAAGAACGTTCAAGCATCATTGATAGGCCAAGACCTACTGATGATCATTTCAGACCATGGGGCGATGTTTCATTCTGGCTGAGTAAGGAGGAAGAACGCCACACAGAGGTGAATGACACAGAAGACGCAATAGATCTCGCTGACGCATGCAATGACGACCAATGGAGGAGATCGTAAGCAGTGACGTATGGAGCGTGGAGGACCCATAAGAAGCACTCAGAAGGAATCTCAACTTTCGGTGTGTCAGTGCGCATCCTGTGCGATGCTTTGTATCTTTTTCTTTGGTGTGTGTCTTTAGCATCTTTACCCTTGTCGGCCACGTTGCCTTTGCTTAGCATGGACGCAAAGCATAGCGCTCGGCTGGTGTGTGTGCCCTCTGCCTATATAAGGCATGGTTGTAAGACTCTTACACTCATCGGTAGTTCACCACATGAGTATTTGAGTCAAGTTTG
本领域技术人员应当理解，对如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，例如，在非应答元件或作用元件，替换一个或几个碱基，获得具有相同功能的核苷酸序列，属于本发明的保护范围。
本发明构建的植物双元表达载体PSCBV-CHN2:GUS是通过将PUbi1:GUS载体中GUS基因的Ubi1启动子序列(PUbi1)替换为SCBV-CHN2启动子序列(PSCBV-CHN2)后构建而成的重组载体。所述PUbi1:GUS载体是将pCAMBIA1305载体(PCaMV 35S:GUS)中的CaMV 35S原始启动子序列(PCaMV 35S)用内切酶BamHI和HindIII进行双酶切后替换为PUbi1而构建成的重组载体。其中P35S和PUbi1均为序列已知的组成型强启动子序列，PCaMV 35S:GUS和PUbi1:GUS载体在本发明中作为基本载体骨架及双对照使用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1 SCBV-CHN2启动子核苷酸序列的克隆
1-1实验材料
采集感染SCBV-CHN2甘蔗品种CZ66-70叶片样品。叶片采自蔗田甘蔗+1叶(最高可见肥厚带叶片)，带回实验室后，经75％酒精清洁消毒处理后，置于自封袋中，于-80℃超低温冰箱保存。
1-2甘蔗叶片总DNA提取
甘蔗叶片总DNA提取方法采用改良CTAB法(Sun et al.,2016)。总DNA吸光度和浓度通过美国NanoVue超微量分光光度计(GE Healthcare)蛋白质核酸分析仪测定，并电泳检测总DNA完整性。
1-3 SCBV-CHN2基因组克隆
依据Genbank数据库目前已公布的两条SCBV基因组序列，通过Primer Premier 5软件设计一对简并引物SCBV-F5603：5’-GAAGAGYGGSTTTCATCAAGT-3’(SEQ ID NO：2)和SCBV-R1002：5’-CTCCGCTTCAGGTATTCCA-3’(SEQ ID NO：3)，用于克隆SCBV基因组序列，预期目的片段大小约为3000bp。以200ng总DNA为模板，采用LA Taq试剂盒(TaKaRa，中国)进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg2+Plus)5.0μL，dNTP Mixture(各2.5mM)8.0μL，SCBV-F5603(10μM)2.0μL，SCBV-R1002(10μM)2.0μL，LA Taq(5U/μL)0.5μL，Pure H2O31.5μL，DNA 1.0μL。PCR反应程序如下：94℃预变性6min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸5min，共35个扩增循环；最终72℃延伸10min。
PCR扩增反应后，取PCR反应产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物通过E.Z.N.Gel Extraction Kit(Omega，美国)试剂盒进行纯化后，连接至pMD19-T克隆载体中，并转化至大肠杆菌宿主菌DH5α感受态细胞中。取100μL转化菌液涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上，经37℃避光培养过夜后，挑取若干白色单菌落分别接种到含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，于37℃避光震荡培养6～8h，分别取菌液0.5μL进行菌液PCR检测，反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4.0μL，SCBV-F5603(10μM)1.0μL，SCBV-R1002(10μM)1.0μL，LA Taq(5U/μL)0.25μL，Pure H2O 15.75μL，菌液0.5μL。反应程序如下：94℃预变性6min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸5min，共30个扩增循环；最终72℃延伸10min。经菌液PCR检测确定，挑选3个阳性克隆子进行测序验证。
1-4 PSCBV-CHN2启动子克隆
根据获得的SCBV-CHN2基因组片段序列，通过生物信息软件进行预测，选取启动子同源核苷酸序列片段，设计启动子片段克隆引物PSCBV-CHN2-F：5’-AAGAGCCAACTCTACTATGTGGATG-3’(SEQ ID NO：4)和PSCBV-CHN2-R：5’-CAAAGAGCTCAAATGATCAGCTG-3’(SEQ ID NO：5)，片段大小为673bp。以100ng的SCBV-CHN2基因组片段质粒为模板，采用Max DNA Polymerase试剂盒(TaKaRa，中国)进行PCR扩增。PCR反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix(2×)25.0μL，PSCBV-CHN2-F(10μM)2.0μL，PSCBV-CHN2-R(10μM)2.0μL，Pure H2O 20.0μL。PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共35个扩增循环；最终72℃延伸7min。
PCR扩增反应后，取PCR反应产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物通过E.Z.N.Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化后，通过/>Simple CloningKit(全式金，中国)连接到/>Cloning Vector上，连接反应体系为5μL，包含回收产物4.0μL和/>Cloning Vector载体1.0μL。将连接反应液转化到DH5α感受态细胞中，经含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板筛选，获得单克隆菌落。经菌液PCR鉴定后，送3个阳性克隆子进行测序，经过测序，该连接产物具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，本发明的SCBV-CHN2分离物的启动子序列与SCBMOV-MOR、SCBIMV-QLD和SCBV-TX分离物的启动子序列核苷酸一致性差异显著，分别为49.9％、77.0％和60.3％，将其命名为PSCBV-CHN2。
实施例2 PSCBV-CHN2启动子序列的生物信息学分析
通过启动子在线分析软件Proscan Version 1.7和Neural Network PromoterPrediction分别预测PSCBV-CHN2启动子的TATA-box和转录起始位点，顺式作用元件预测通过在线分析软件PlantCARE和New PLACE完成。
结果如图1所示，该启动子存在1个启动区PPR，位于启动子序列3’端(593～643bp)位置，含有启动子所必有的基础表达调控元件TATA-box和转录起始位点TSS。通过NEWPLACE和PlantCARE软件预测，在该启动子上预测到3个TAAAG元件，分别位于启动子序列上40～45bp、514～518bp和523～527bp位置，TAAAG元件是保卫细胞特异表达启动子所必需的一个重要元件，是保卫细胞特异表达转录因子Dof蛋白的结合位点。有研究报道Dof转录因子可受干旱胁迫诱导表达，过表达该基因可提高ROS清除系统相关基因的表达和脯氨酸的积累量，从而增强转基因植物的耐旱性。此外，该启动子还含有1个与响应干旱有关的顺式元件C-repeat/DR。因此，推测启动子PSCBV-CHN2具有在保卫细胞中特异表达和响应干旱诱导表达的特性。
实施例3 PSCBV-CHN2:GUS启动子植物重组表达载体构建
植物重组表达载体骨架的制备：利用快速限制性内切酶HindШ和BamHΙ(Fermentas，美国)线性化PUbi1:GUS载体，25μL酶切反应体系包含2.5μL 10×FastDigestBuffer，0.5μL HindШ，0.5μL BamHΙ和1μg目的质粒。37℃水浴30min后，于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，回收大片段即目的载体骨架，置于-20℃冰箱保存备用。
PCR扩增：通过无缝克隆引物设计工具(http://123.56.75.195/)设计扩增启动子PSCBV-CHN2序列的GUS载体连接引物IF-GUS-CHN2-F：5’-GGCCAGTGCCAAGCTTAAGAACCAACTCTGCTATGTGGATG-3’(SEQ ID NO：6)和IF-GUS-CHN2-R：5’-GACCACCCGGGGATCCCAAACTTGACTCAAATACTCATGTG-3’(SEQ ID NO：7)，通过Max DNA Polymerase试剂盒扩增获得加有接头的PSCBV-CHN2启动子片段，退火温度为60℃，琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段；PCR体系及反应程序同实施例1中1-4。
载体连接：通过In-Fusion试剂盒(TaKaRa，中国)进行连接，将加有接头的PSCBV-CHN2启动子序列连接到上述经过双酶切后的GUS基因表达载体中。10μL连接反应体系包含2μL5×In-Fusion HD enzyme Premix，2μL线性化质粒载体和4μL PCR产物。将上述连接混合液轻弹混匀，50℃水浴15min，后置于冰上，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃暗培养12h，挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定后，送3个阳性克隆子进行测序，获得重组质粒PSCBV-CHN2:GUS，将该质粒进行扩培，置于-20℃备用，PSCBV-CHN2:GUS质粒图谱如图2所示。
实施例4 拟南芥遗传转化和干旱胁迫下的GUS基因实时荧光定量PCR检测
4-1 PSCBV-CHN2:GUS质粒转化农杆菌感受态细胞
将上述实施例3提取保存的重组质粒PSCBV-CHN2:GUS进行农杆菌感受态细胞GV3101的转化，并以含组成型启动子PCaMV 35S和PUbi1的重组质粒PCaMV 35S:GUS和PUbi1:GUS作为对照组。转化步骤如下：(1)取1μg质粒DNA加入到200μL制备好的GV3101感受态细胞中，轻弹混匀；(2)将混合液置于液氮中10min，冰上放置5min；(3)取200μL无抗LB液体培养基加入到混合液中，28℃摇床，200rpm/min活化2h；(4)将活化好的转化液置于无菌的超净工作台中，取100μL涂布于含50μg/mL的卡那霉素和利福平的LB固体平板培养基上，28℃倒置培养2天；(5)挑取单菌落，摇菌后进行菌液PCR，跑胶检测是否有目的条带，挑选具有目的质粒的阳性农杆菌菌液进行扩大培养，-80℃冰箱保存备用。
4-2拟南芥转化及转基因苗筛选
具体步骤如下：(1)取上述阳性农杆菌菌液10μL到10mL LB液体培养基(50μg/mL的卡那霉素和利福平)中，28℃，200rpm/min过夜活化；(2)将10mL农杆菌菌液接种到200mL LB液体培养基(50μg/mL的卡那霉素和利福平)中，28℃，200rpm/min活化至OD6000.8～1.0，5000rpm/min室温离心5min，收集菌体；(3)弃上清，加入10mL侵染液(1/2MS，2.215mg/mL；蔗糖，5％(W/V)；Silwet 77，0.02％(W/V))重悬菌体，5000rpm/min室温离心5min，收集菌体；(4)弃上清，加入200mL侵染液重悬菌体；(5)选取盛花期的健壮拟南芥，去除果荚，仅保留未盛开的花序，平放植株使花序完全浸入侵染液中，浸泡1min后将植株平放于新的托盘中，用保鲜膜覆盖并于暗室培养24h；(6)黑暗处理1天后，取出植株置于人工气候培养室进行正常培养，大约一个月植株成熟，收获T0代种子进行转基因植株筛选；(7)配制抗性板，将消毒后的T0代种子平铺在板上，4℃黑暗春化2～4天后取出，23℃恒温培养箱中培养2～3周，取阳性苗移栽到营养土中，PCR再次鉴定阳性苗，继续培养至得到T3纯合种子用于后续实验。
4-3 GUS组织化学染色
GUS染色缓冲液：50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，0.5mM K3Fe(CN)6，0.5mM K4Fe(CN)6，10mM Na2EDTA，0.1％(v/v)Triton X-100和1mg/mL X-Gluc，其中X-Gluc应先溶于DMSO中再加入，-20℃避光保存。
GUS终止反应液：0.2M Na2CO3。
GUS反应液：50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，10mM Na2EDTA(pH＝8.0)，0.1％(v/v)Triton X-100，0.07％(v/v)β-巯基乙醇和1mM 4-甲基伞形酮-β-D葡萄苷酸(4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide，4-MUG)，现配现用。
GUS组织化学染色参考Jefferson等(1987)的方法进行：将转基因拟南芥浸泡于GUS染色缓冲液中，37℃染色6～12h，70％乙醇脱色直至褪绿完全，观察并照相。
如图3所示，PSCBV-CHN2:GUS转基因植株主要在叶片气孔的保卫细胞中检测到GUS表达，而根和茎组织几乎检测不到GUS表达，而对照组成型启动子PCaMV 35S:GUS和PUbi1:GUS转基因植株根、茎、叶组织中均能检测到GUS蛋白，这表明PSCBV-CHN2是一种保卫细胞特异表达启动子。
4-4转基因拟南芥干旱胁迫处理
(1)干旱处理：将转基因拟南芥种子消毒后，点种于1/2MS培养基中，4℃春化2天后，于培养箱培养7天，将转基因幼苗分别移到含有25％PEG6000的1/2MS液体培养基上培养2天，以1/2MS液体培养基为对照，分别于0h、3h、6h、12h和24h进行取样，每个样品3个生物学重复，冻于液氮后，于-80℃保存备用。
4-5实时荧光定量PCR检测
(1)通过TRIzol方法提取干旱胁迫处理的转基因拟南芥RNA，具体步骤参看TRIzol试剂(Invitrogen，美国)说明书。
(2)去除总RNA中残留的DNA。反应体系10μL，包含2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser和1μg总RNA。反应条件为42℃、2min。
(3)以提取的总RNA为模板，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒(TaKaRa，中国)进行反转录获得cDNA。在上述经步骤(2)处理后的反应液中加入10μL逆转录液，包含1.0μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0μL RT Primer Mix和2.0μL 5×PrimeScript Buffer 2和4.0μL RNase Free dH2O。反应条件为37℃，15min；85℃，5s。反应完后将产物稀释5倍，直接进行下一步试验或将产物置于-20℃保存备用。
(4)使用QuantStudio 3定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)进行实时荧光定量PCR实验，采用TBPremix Ex TaqTM荧光试剂盒(TaKaRa，中国)进行qRT-PCR检测，选择拟南芥Actin2为内参基因对GUS基因的表达量进行定量分析。GUS定量引物qGUS-F：5’-AGCGTTGAACTGCGTGAT-3’(SEQ ID NO：8)和qGUS-R：5’-TTGCCAGAGGTGCGGATT-3’(SEQ IDNO：9)，Actin2定量引物qactin-F：5’-TGTTCCCATCAGAACCGTGA-3’(SEQ ID NO：10)和qactin-R：5’-CACCTGTCTTTGGGTCAACAA-3’(SEQ ID NO：11)。qRT-PCR反应体系包含TBGreen Premix Ex Taq(2×)，0.2μM上下游引物，0.4μL ROX Reference Dye II和1.0μLcDNA模板。混匀后稍离心，放入QuantStudio 3定量PCR仪中，进行实时荧光PCR反应。反应程序为：95℃预变性30s；95℃反应15s，60℃反应34s，40个循环。实验设置3次生物学重复和3个技术重复。
定量结果显示PSCBV-CHN2:GUS转基因植株在25％PEG6000渗透胁迫处理3h后，GUS转录表达量明显上升，在6h后达到最高，为PEG渗透胁迫处理0h实验组的3.8倍；在12h后，GUS表达量下降，但在24h后又轻微上升(图4)。这些结果表明PSCBV-CHN2启动子在双子叶植物中具有响应干旱胁迫诱导的能力，在干旱胁迫下能调高基因的表达，为一种干旱胁迫诱导型启动子。
本实施例仅公布了在拟南芥中外源GUS基因受启动子PSCBV-CHN2的驱动表达，且在干旱胁迫下能进一步诱导表达，本发明也可延伸至其它功能基因，例如杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因等，以及延伸至其它单子叶植物，例如甘蔗，并应用于植物基因工程中应对干旱胁迫条件下功能基因的诱导表达。本发明所述的启动子来源于侵染甘蔗的SCBV病毒基因组，由于其与植物基因组序列没有同源性，所以能够有效避免基因沉默现象的发生，对于多种作物的抗旱基因工程育种具有广阔的应用前景。本发明也可应用于改造适应于干旱逆境的植物生物反应器，以期获得在干旱胁迫条件下目标蛋白高产量的转基因植物生物反应器。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省科学院南繁种业研究所
<120> 一种植物保卫细胞特异性表达的干旱诱导型启动子PSCBV-CHN2及应用
<130> 2022-02-19
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 673
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aagaaccaac tctgctatgt ggatgcagaa agcctgcaat aaagctcaca tccggcacaa 60
ggcttaatcc aagcagaaga ttttacaagt gtgctatgaa catctgccac tgctggtatt 120
gggcagactt gctcgaagat tacgtacaag aaagaattga agaattcatg tgcgacaact 180
tcgacaagaa gatgggaatg aatgaggcaa gctcatcaaa ccaagaacgt tcaagcatca 240
ttgataggcc aagacctact gatgatcatt tcagaccatg gggcgatgtt tcattctggc 300
tgagtaagga ggaagaacgc cacacagagg tgaatgacac agaagacgca atagatctcg 360
ctgacgcatg caatgacgac caatggagga gatcgtaagc agtgacgtat ggagcgtgga 420
ggacccataa gaagcactca gaaggaatct caactttcgg tgtgtcagtg cgcatcctgt 480
gcgatgcttt gtatcttttt ctttggtgtg tgtctttagc atctttaccc ttgtcggcca 540
cgttgccttt gcttagcatg gacgcaaagc atagcgctcg gctggtgtgt gtgccctctg 600
cctatataag gcatggttgt aagactctta cactcatcgg tagttcacca catgagtatt 660
tgagtcaagt ttg 673
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaagagyggs tttcatcaag t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctccgcttca ggtattcca 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aagagccaac tctactatgt ggatg 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caaagagctc aaatgatcag ctg 23
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggccagtgcc aagcttaaga accaactctg ctatgtggat g 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaccacccgg ggatcccaaa cttgactcaa atactcatgt g 41
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
agcgttgaac tgcgtgat 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ttgccagagg tgcggatt 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tgttcccatc agaaccgtga 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cacctgtctt tgggtcaaca a 21

Claims (11)

1.如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段在作为植物保卫细胞特异性干旱诱导型启动子中的应用。
2.如SEQ ID N O：1所示的核苷酸序列的DNA片段在调控目的基因在植物保卫细胞中表达的应用。
3.含有如SEQ ID N O：1所示的核苷酸序列的DNA片段的表达盒或重组表达载体在调控目的基因在植物保卫细胞中表达的应用， 所述目的基因为杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因或报告基因。
4.含有如SEQ ID N O：1所示的核苷酸序列的DNA片段重组表达载体在调控目的基因在植物保卫细胞中表达的应用， 所述目的基因为杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因或报告基因。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组载体为PSCBV-CHN2:GUS；所述PSCBV-CHN2:GUS载体为将pCAMBIA1305载体中GUS基因的CaMV 35S启动子序列替换为如权利要求1所述启动子序列后获得的重组载体。
6.如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段在提高植物抗旱性能中的应用，所述植物为甘蔗或拟南芥。
7.如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段在提高植物抗旱性能育种中的应用，所述植物为甘蔗或拟南芥。
8.含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段的表达盒或重组表达载体在提高植物抗旱性能中的应用，所述植物为甘蔗或拟南芥。
9.含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段的表达盒或重组表达载体在提高植物抗旱性能育种中的应用，所述植物为甘蔗或拟南芥。
10.一种提高植物抗旱能力的方法，其特征在于，所述方法包括将如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段导入植物中，并通过筛选获得转基因植物；
或所述方法包括将含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的DNA片段的表达盒或重组载体导入植物中，并通过筛选获得转基因植物；
所述植物为甘蔗或拟南芥。
11.如权利要求10所述的提高植物抗旱能力的方法，其特征在于，所述将含有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的DNA片段或表达盒或重组载体导入植物中的方法为农杆菌侵染法或基因枪法。
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