CN114672487B

CN114672487B - 一种来自甘蔗杆状病毒的维管束组织特异性启动子pscbv-gt127及应用

Info

Publication number: CN114672487B
Application number: CN202210359841.6A
Authority: CN
Inventors: 王竹青; 孙生仁; 王勤南; 吴建涛; 常海龙; 陈俊吕; 王建强
Original assignee: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy Of Sciences
Current assignee: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy Of Sciences
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-04-06
Also published as: CN114672487A

Abstract

本发明提供了一种来自甘蔗杆状病毒的植物维管束组织特异性启动子及其应用，所述启动子具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明通过检测转基因洋葱、转基因甘蔗、转基因拟南芥中外源EYFP和GUS基因的表达情况，证实了所述启动子是一种维管束组织特异性启动子，能启动外源基因在植物根、茎、叶维管束组织中特异性表达。因此，所述启动子可用于制备转基因植物和进行植物转基因育种，可作为构建植物重组表达载体的元件，在植物基因工程育种方面具有广阔的应用前景。

Description

一种来自甘蔗杆状病毒的维管束组织特异性启动子PSCBV-GT127 及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和植物遗传育种技术领域，具体涉及一种来自甘蔗杆状病毒的维管束组织特异性启动子P_SCBV-GT127及应用。

背景技术

植物生产关乎人类生存和发展，开发植物新品种，提高植物产量和质量，获得高产优质的植物品种有益于国民经济的健康发展和社会稳定。分子生物学技术的快速发展为现代农业的发展提供了巨大的助力，植物基因工程和植物遗传育种相结合成为当下育种新方式，极大地推动了优质、高产、高抗病抗逆性和其它特殊性状的植物品系的获得。生物遗传性状的加速改造离不开转基因技术，转基因技术就是将人工分离和修饰过的外源基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物性状的目的。

基因工程为植物遗传改良和基因功能验证提供了一种重要手段，但基因的稳定表达却常常受到转录基因沉默或转录后沉默的制约。基因的表达受到顺式作用元件和反式作用因子的共同调控，顺式作用元件包括启动子、增强子和沉默子等DNA序列，启动子是影响基因表达水平的关键因素之一。启动子的调控具有时空表达特性，按调控方式可以分为组成型启动子、诱导型启动子、特异性启动子等。组织或器官特异性启动子的调控受特定的组织细胞结构和化学、物理信号诱导调节，因此，基因的表达往往局限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中表达造成的负面效应，比如维管束组织特异启动子。所以，利用维管束组织特异启动子控制目的基因的特异表达具有重要的理论和实践意义。

同源的启动子在转基因植株中容易产生启动子甲基化，导致外源基因表达活性降低，甚至基因沉默。挖掘更多的不同来源的启动子，为基因工程提供更多可供选择的启动子具有重要的理论和实践意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种植物维管束组织特异性启动子，所述启动子来自甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform viruses，SCBV)，在转基因植物中具有强启动子活性，可以为目的基因在不同作物的维管束组织中的表达提供有效途径。

实现上述目的的技术方案如下。

一种植物维管束组织特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列为：

(1)含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的序列；或

(2)与含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列完全互补的序列；或

(3)含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个的核苷酸，且具有相同功能的序列；或

(4)由SEQ ID NO：4所示的上游引物和SEQ ID NO：5所示的下游引物通过PCR扩增获得的序列。

本发明还提供了一种植物表达盒，所述表达盒包括以可表达的方式彼此连接的上述启动子、由上述启动子驱动表达的目的基因和终止子。

在其中一些实施例中，所述目的基因为杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因或报告基因。

在其中一些实施例中，所述报告基因为EYFP或GUS基因。

本发明还提供了含有上述启动子或表达盒的重组载体。

在其中一些实施例中，所述重组载体为P_SCCBV-GT127:GUS或P_SCCBV-GT127:EYFP；

所述P_SCCBV-GT127:GUS载体为将pCAMBIA1305载体中GUS基因的CaMV 35S启动子序列替换为上述启动子序列后获得的重组载体；

所述P_SCCBV-GT127:EYFP载体为将pTEM12载体中EYFP基因的Ubi1启动子序列替换为上述启动子序列后获得的重组载体。

本发明还提供了含有上述启动子或表达盒或重组载体的宿主细胞。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为重组微生物。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为重组菌。

在其中一些实施例中，所述重组菌为大肠杆菌。

在其中一些实施例中，所述重组菌为农杆菌。

在其中一些实施例中，所述重组菌为GV3101农杆菌。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为植物转基因细胞。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为洋葱表皮细胞。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为拟南芥原生质体。

在其中一些实施例中，所述宿主细胞为甘蔗嫩叶组织细胞。

本发明还提供了上述启动子或表达盒或重组载体的以下任一应用：

(1)调控目的基因在植物维管束组织特异性表达中的应用；

(2)在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能中的应用；

(3)在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能育种中的应用。

在其中一些实施例中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

在其中一些实施例中，所述植物为禾本科植物。

在其中一些实施例中，所述植物为甘蔗。

在其中一些实施例中，所述植物为洋葱。

在其中一些实施例中，所述植物为拟南芥。

本发明还提供了一种在植物维管束组织中特异性表达外源基因的方法，包括将上述启动子或表达盒或重组载体导入植物中，并通过筛选获得转基因植物。

在其中一些实施例中，将上述的启动子或表达盒或重组载体导入植物中的方法为农杆菌侵染法。

在其中一些实施例中，将上述的启动子或表达盒或重组载体导入植物中的方法为基因枪法。

本发明还提供了一种引物对，其包括如SEQ ID NO：4所示的上游引物和SEQ IDNO：5所示的下游引物。

本发明还提供了上述启动子的制备方法，包括以下步骤：以SCBV-GT127基因组DNA为模板，利用上述引物对通过PCR扩增获得。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系如下：2×PrimeSTAR Max Premix25.0μL，10μM PSCBV-GT127-F 2.0μL，10μM PSCBV-GT127-R 2.0μL，H₂O 20.0μL。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共35个扩增循环；最终72℃延伸7min。

本发明经过研究首次从SCBV基因组中分离获得了一种DNA分子，并经过生物信息学分析发现所述DNA分子可能具有启动子活性，与SCBMOV-MOR、SCBIMV-QLD和SCBV-TX分离物的启动子序列核苷酸一致性差异显著，分别为49.7％、80.2％和62.0％，为此，发明人通过实验研究其启动子活性和表达类型，证实了其是一种维管束组织特异性表达的启动子。

本发明提供了一种维管束组织特异表达启动子，其来源于SCBV，该病毒部分基因组核酸序列，包含RT/RNase H和全长启动子，是一种维管束组织特异性表达的启动子，可作为构建植物重组表达载体的元件，将其连接在目的基因(包括杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因等农作物相关功能基因)之前，可以高效驱动目的基因在植物维管束组织(包括根、茎、叶中的维管束)中表达，从而提高植物的抗病、抗虫害、抗逆境胁迫性能或提高植物的营养价值(例如，可以与抗病毒结构融合，控制叶病毒在维管组织中繁殖和转移；或通过驱动苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的表达，提高植物对茎部害虫的耐受性；或者增强茎秆中高值重组蛋白的表达；或在茎杆中高表达营养相关蛋白，增强农作物的附加营养价值)。本发明提供的启动子来源于侵染甘蔗的SCBV病毒基因组，由于与植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生。将本发明启动子应用于多种农作物的基因转化，制备转基因植物和进行转基因植物育种，对推动优质、高产、高抗病抗逆性和其它特殊性状的植物品系的获得具有重要价值，能有效推动现代遗传育种技术的发展。

附图说明

图1为P_SCBV-GT127:EYFP(A)和P_SCBV-GT127:GUS(B)的植物重组表达载体构建图；

图2为启动子P_{CaMV 35S}、P_Ubi1和P_SCBV-GT127驱动的EYFP基因在洋葱表皮细胞、拟南芥原生质体和甘蔗嫩叶组织中瞬时表达图，图中比例尺分别表示100μm，25μm和250μm；

图3为P_{CaMV 35S}:GUS、P_Ubi1:GUS和P_SCBV-GT127:GUS转基因拟南芥根、茎、叶中GUS染色图，比例尺为2mm或100μm。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本发明首先以感染了SCBV-GT127的甘蔗品种GT88-127的叶片DNA为模板克隆获得含SCBV-GT127基因组片段序列的阳性克隆质粒，然后以其为模板进行PCR扩增，将扩增产物纯化后连接到Cloning Vector上，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆进行测序，获得了核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子。

所述DNA分子全长694bp，经过生物信息学分析其可能具有启动子活性，与SCBMOV-MOR、SCBIMV-QLD和SCBV-TX分离物的启动子序列核苷酸一致性差异显著，分别为49.7％、80.2％和62.0％。发明人预测其是一种维管束组织特异性表达的启动子，并将其命名为P_SCBV-GT127。

发明人进一步构建获得了含有所述P_SCBV-GT127的植物双元表达载体P_SCBV-GT127:EYFP和P_SCBV-GT127:GUS。并利用基因枪法将P_SCBV-GT127:EYFP重组表达载体转入洋葱表皮细胞、拟南芥原生质体和甘蔗嫩叶组织中，结果显示在P_SCBV-GT127:EYFP转基因洋葱表皮细胞、拟南芥原生质体和甘蔗嫩叶组织中均能检测到黄色荧光，表明启动子P_SCBV-GT127能驱动EYFP基因在洋葱表皮细胞、拟南芥原生质体和甘蔗嫩叶组织中表达。

发明人还将P_SCBV-GT127:GUS重组表达载体转化农杆菌GV3101，筛选获得阳性菌株，然后侵染拟南芥，利用GUS染色和GUS蛋白活性分析实验发现P_SCBV-GT127:GUS转基因植株的GUS仅表达在根、茎和叶的维管束组织中，表明P_SCBV-GT127启动子为维管束组织特异表达启动子。

SEQ ID NO：1：

5’-AAGAGCCAACTCTACTATGTGGATGCAGGAGGCCTGCAATAATGCTCACTTCAGGGACAAGATGGAACCCTAGGAGAAAATTTTTCAAGTGTGCCTTGAACAATTGCCACTGTTGGTATTGGGCAGATCTACTTGAAGAATACGTGCAAGAGAGGATCGAAGATTTCATGGCAGAAAACTTCGACAGGAAACTGGGACTTGACGATCCTAGTTCATCAACGCCTTACCCAGAGCTTGAAGATCACCGTTCAAGTGTCATTGATAGGCCAAGGCCTACTGATGATCATTTCAGACCATGGGGAGATGTTGCATATGTGCTATGCAATGAAGAGGAAGAATGCCACACGCAGGATGACAGGGTTGAAGATGCAATCGATCTTACTGACGCAAGCAATGACGATCAATGGAGAAGGTCGTAAGCAGTGACGTATGGAGCGTGGAGGACCCATAAGAGCACTCAGAAGGTACCTCAACTTTCGGTGTGTCGGTGCGCATCCTATGCGATGCTTTGTATCGTGTGTGTCTTTTTCGGCATCTGTGCCACTTTACCTTTGTCGGCCACGTTGCCTTTGCTTAGCATGGACGCAAAGCATAGCGCTCGGCTGGTGTGTGTGCCCTCTGCCTATATAAGGCATGGTTGTAAGACTCTTACACTCATCGGTAGTCCACCACATGAGTATTTGAGTCAAGTTTG-3’

本领域技术人员应当理解，对如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，例如，在非应答元件或作用元件，替换一个或几个碱基，获得具有相同功能的核苷酸序列，属于本发明的保护范围。

本发明构建的植物双元表达载体P_SCBV-GT127:GUS是通过将P_Ubi1:GUS载体中GUS基因的Ubi1启动子序列替换为SCBV-GT127启动子序列(P_SCBV-GT127)后构建而成的重组载体。所述P_Ubi1:GUS载体是将pCAMBIA1305载体(P_{CaMV 35S}:GUS)中GUS基因的CaMV 35S原始启动子序列(P_{CaMV 35S})用内切酶BamHI和HindIII进行双酶切后替换为Ubi1启动子序列(P_Ubi1)而构建成的重组载体。

本发明构建的植物双元表达载体P_SCBV-GT127:EYFP是通过将P_{CaMV 35S}:EYFP载体中EYFP基因的CaMV 35S启动子序列(P_{CaMV 35S})替换为SCBV-GT127启动子序列(P_SCBV-GT127)后构建而成的重组载体。所述P_{CaMV 35S}:EYFP载体是将pTEM12载体(P_Ubi1:EYFP)中的Ubi1原始启动子序列(P_Ubi1)用内切酶XhoI和NcoI进行双酶切后替换为P_{CaMV 35S}而构建成的重组载体。

本发明中P_35S和P_Ubi1均为序列已知的组成型强启动子序列，P_Ubi1:GUS、P_{CaMV 35S}:GUS、P_Ubi1:EYFP和P_{CaMV 35S}:EYFP载体在本发明中作为基本载体骨架及双对照使用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1 P_SCBV-GT127启动子核苷酸序列的克隆

1-1实验材料

采集感染SCBV-GT127甘蔗品种GT88-127叶片样品。叶片采自蔗田甘蔗+1叶(最高可见肥厚带叶片)，带回实验室后，经75％酒精清洁消毒处理后，置于自封袋中，于-80℃超低温冰箱保存。

1-2甘蔗叶片总DNA提取

甘蔗叶片总DNA提取方法采用改良CTAB法(Sun et al.,2016)。总DNA吸光度和浓度通过美国NanoVue超微量分光光度计(GE Healthcare)蛋白质核酸分析仪测定，并电泳检测总DNA完整性。

1-3 SCBV-GT127基因组克隆

依据Genbank数据库目前已公布的两条SCBV基因组序列，通过Primer Premier 5软件设计1对简并引物SCBV-F5603：5’-GAAGAGYGGSTTTCATCAAGT-3’(SEQ ID NO：2)和SCBV-R1002：5’-CTCCGCTTCAGGTATTCCA-3’(SEQ ID NO：3)，用于克隆SCBV基因组序列，预期目的片段大小约为3000bp。以200ng总DNA为模板，采用LA Taq试剂盒(TaKaRa，中国)进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Plus)5.0μL，dNTP Mixture(各2.5mM)8.0μL，SCBV-F5603(10μM)2.0μL，SCBV-R1002(10μM)2.0μL，LA Taq(5U/μL)0.5μL，Pure H₂O31.5μL，DNA 1.0μL。PCR反应程序如下：94℃预变性6min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸5min，共35个扩增循环；最终72℃延伸10min。PCR扩增反应后，取PCR反应产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物通过Gel Extraction Kit试剂盒(Omega，美国)进行纯化后，连接至pMD19-T克隆载体中，并转化至大肠杆菌宿主菌DH5α感受态细胞中。取100μL转化菌液涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上，经37℃避光培养过夜后，挑取若干白色单菌落分别接种到含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，于37℃避光震荡培养6～8h，分别取菌液0.5μL进行菌液PCR检测，反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4.0μL，SCBV-F5603(10μM)1.0μL，SCBV-R1002(10μM)1.0μL，LA Taq(5U/μL)0.25μL，Pure H₂O 15.75μL，菌液0.5μL。反应程序如下：94℃预变性6min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸5min，共30个扩增循环；最终72℃延伸10min。选择经菌液PCR检测后，挑选3个阳性克隆子进行测序验证。

1-4 SCBV-GT127启动子克隆

根据获得的SCBV-GT127基因组片段序列，通过生物信息软件进行预测，选取启动子同源核苷酸序列片段，设计启动子片段克隆引物PSCBV-GT127-F：5’-AAGAGCCAACTCTACTATGTGGATG-3’(SEQ ID NO：4)和PSCBV-GT127-R：5’-CAAACTTGACTCAAATACTCATGTG-3’(SEQ ID NO：5)，片段大小为694bp。以100ng的SCBV-GT127基因组片段质粒为模板，采用Max DNA Polymerase试剂盒(TaKaRa，中国)进行PCR扩增。PCR反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix(2×)25.0μL，PSCBV-GT127-F(10μM)2.0μL，PSCBV-GT127-R(10μM)2.0μL，Pure H₂O 20.0μL。PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共35个扩增循环；最终72℃延伸7min。PCR扩增反应后，取PCR反应产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物通过/>Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化后，通过/>Simple Cloning Kit(全式金，中国)连接到/>Cloning Vector上，连接反应体系为5μL，包含回收产物4.0μL和/>Cloning Vector载体1.0μL。将连接反应液转化到DH5α感受态细胞中，经含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板筛选，获得单克隆菌落。经菌液PCR鉴定后，送3个阳性克隆子进行测序，经过测序，该连接产物具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸，将其命名为P_SCBV-GT127。

实施例2 P_SCBV-GT127启动子植物重组表达载体构建

2-1 EYFP重组表达载体构建

植物表达载体骨架的制备：利用快速限制性内切酶XhoI和NcoI(Fermentas，美国)对P_{CaMV 35S}:EYFP载体进行酶切，25μL双酶切反应体系包含2.5μL 10×FastDigest Buffer，0.5μLXhoI，0.5μL NcoI和1μg目的质粒。37℃水浴30min后，于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，回收大片段即目的载体骨架，置于-20℃冰箱保存备用。

PCR扩增：通过无缝克隆引物设计工具(http://123.56.75.195/)设计扩增启动子P_SCBV-GT127序列的引物IF-EYFP-GT127-F：5’-CGGGCCCCCCCTCGAGAAGAGCCAACTCTACTATGTGGATG-3’(SEQ ID NO：6)和IF-EYFP-GT127-R：5’-CCCTTGCTCACCATGGCAAACTTGACTCAAATACTCATGTG-3’(SEQ ID NO：7)。通过Max DNA Polymerase试剂盒扩增获得加有接头的P_SCBV-GT127启动子片段，退火温度为60℃，琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，置于-20℃冰箱保存备用，PCR体系及反应程序同实施例1-4。

载体连接：通过In-Fusion试剂盒(TaKaRa，中国)进行连接，将加有接头的P_SCBV-GT127启动子序列连接到上述经过双酶切后的EYFP基因表达载体骨架中。10μL连接反应体系包含2μL 5×In-Fusion HD enzyme Premix，2μL线性化质粒载体和4μL PCR产物。将上述连接混合液轻弹混匀，50℃水浴15min，后置于冰上，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃暗培养12h，挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定后，送3个阳性克隆子进行测序，获得重组质粒P_SCBV-GT127:EYFP，将该质粒进行扩培，置于-20℃备用，P_SCBV-GT127:EYFP质粒图谱如图1(A)所示。

2-2 GUS表达载体构建

利用快速限制性内切酶HindШ和BamHΙ(Fermentas，美国)线性化P_Ubi1:GUS载体；通过无缝克隆引物设计工具(http://123.56.75.195/)设计扩增启动子P_SCBV-GT127序列的GUS载体连接引物IF-GUS-GT127-F：5’-GGCCAGTGCCAAGCTTAAGAGCCAACTCTACTATGTGGATG-3’(SEQ ID NO：8)和IF-GUS-GT127-R：5’-GACCACCCGGGGATCCCAAACTTGACTCAAATACTCATGTG-3’(SEQ ID NO：9)，通过Max DNA Polymerase试剂盒扩增获得加有接头的P_SCBV-GT127启动子片段，退火温度为60℃，琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段；通过In-Fusion试剂盒进行连接，将加有接头的P_SCBV-GT127序列连接到上述经过双酶切后的GUS基因表达载体中，获得重组质粒P_SCBV-GT127:GUS，将该质粒进行扩培，置于-20℃备用，具体步骤参考2-1，P_SCBV-GT127:GUS质粒图谱如图1(B)所示。

实施例3 P_SCBV-GT127:EYFP质粒在洋葱表皮细胞、拟南芥原生质体和甘蔗嫩叶组织的瞬时表达

3-1洋葱鳞片表皮制备和质粒转化

洋葱用无菌水洗净，在75％酒精中浸泡1min；去除洋葱顶部与基部切及两层外层洋葱鳞片；将洋葱对半切四次，取外面三层，撕下洋葱鳞片内表皮，切成约2cm²方片状，将其光滑面朝上，内表面朝下置于MS渗透培养基(4.4g/L MS培养基基盐(含维生素)，36.4g/L甘露醇，0.6mg/L 2,4-D，6g/L琼脂粉，pH 5.8～6.2)。将放置洋葱鳞片表皮的渗透培养基置于暗处，28℃培养4h备用。将P_SCBV-GT127:EYFP质粒包被于钨粉中(1.1μm)，并用P_CaMV35S:EYFP和P_Ubi1:EYFP质粒作为对照，具体操作步骤参考Gao等(2013)，基因枪轰击参数1300psi，轰击距离6cm，以P_{CaMV 35S}:EYFP和P_Ubi1:EYFP作为阳性对照。基因枪轰击完后在渗透培养基中28℃过夜暗培养，然后将洋葱表皮细胞置于MS培养基(4.4g/L MS培养基基盐(含维生素)，0.6g/L 2,4-D，6g/L琼脂粉，pH 5.8～6.2)，室温暗培养24～48h，于荧光显微镜(YFP荧光滤片)中进行观察拍摄，如图2所示，与对照P_{CaMV 35S}:EYFP和P_Ubi1:EYFP洋葱表皮细胞中观察到的一样，在P_SCBV-GT127:EYFP洋葱表皮细胞中观察到黄色荧光，表明启动子P_SCBV-GT127能驱动EYFP基因在洋葱表皮细胞中表达。

3-2拟南芥原生质体制备和P_SCBV-GT127:EYFP质粒转化

野生型拟南芥叶片原生质体制备和PEG-CaCl₂渗透法转化具体步骤如下：

(1)取大小合适的叶片，切成0.5～1.0mm的细条，浸没在配制好的酶解液中，常温黑暗条件下进行酶解，约3～4h，期间进行轻微摇晃，充分酶解；

(2)加入等体积4℃预冷的W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl₂，2mM MES(pH 5.7))，终止反应；

(3)利用75μm大小的尼龙网过滤到50mL的圆底离心管中；

(4)1400rpm水平离心2min后，迅速倒掉上清液，避免原生质体的损失；

(5)加入10mL W5溶液(4℃预冷)，清洗沉淀；

(6)1400rpm水平离心2min后，迅速倒出上清，加入10mL W5溶液(4℃预冷)，避光冰浴30min；

(7)用移液枪轻轻吸去上清液后，加入10mL MMG溶液(0.4M Mannitol，15mMMgCl₂，4mM MES(pH 5.7))，轻轻混匀原生质体；

(8)另取2.0mL离心管，加入20μL(1000ng/μL)P_SCBV-GT127:EYFP和对照P_{CaMV 35S}:EYFP和P_Ubi1:EYFP质粒后，加入200μL的原生质体；

(9)加入220μL的PEG/Ca²⁺溶液(40％(w/v)PEG 4000，0.2M Mannitol，100mMCaCl₂)，用手轻轻弹匀(每个样品混匀20～30s)；

(10)静置5min后，加入5倍体积(原生质体+质粒体积的5倍)的W5溶液，轻柔混匀；

(11)1400rpm水平离心2min后，吸去上清液，加入150μL的W5溶液后，轻柔混匀。

(12)用5％溶度的BSA封闭晾干6个孔的酶标板(进口的细胞培养板不用事先加入BSA润洗和封闭)，之后，加入1mL WI溶液和150μL上述步骤的质粒转化原生质体溶液到酶标板中；

(13)将上述酶标板置于白纸上，于室温下进行孵育培养16～18h；

(14)在激光共聚焦显微镜(蔡司LSM880，德国Zeiss公司)下观察转P_SCBV-GT127:EYFP质粒的拟南芥原生质体荧光表达情况。如图2所示，与对照P_CaMV _35S:EYFP和P_Ubi1:EYFP拟南芥原生质体一样，在P_SCBV-GT127:EYFP拟南芥原生质体中也观察到黄色荧光蛋白，表明启动子P_SCBV-GT127能驱动EYFP基因在拟南芥原生质体中表达。

3-3甘蔗嫩叶组织制备和基因枪轰击

(1)甘蔗嫩叶组织制备

取生长正常且无病虫害的甘蔗(ROC22)植株梢部，去除梢部叶片和蔗茎，留20～30cm长的组织，用体积比75％酒精溶液消毒后，移入无菌的超净工作台。剥去-1和-2叶及以外的叶片，取-3和-4嫩叶，去除中脉后将基部幼嫩叶片切成2cm×2cm的小方块，平铺于MS固体诱导培养基上，上表面朝下。小方块幼嫩叶片在28℃条件下暗培养3～5天后，即可作为甘蔗转基因瞬时表达叶片受体材料。

(2)基因枪轰击

将P_SCBV-GT127:EYFP质粒包被于钨粉中(1.1μm)，具体操作步骤参考Gao等(2013)，基因枪轰击参数1300psi，轰击距离6cm，以P_{CaMV 35S}:EYFP和P_Ubi1:EYFP质粒作为阳性对照。轰击后的甘蔗嫩叶在60h时间点用体视荧光显微镜(SteREO Lumar.V12，ZEISS，德国)EYFP滤光片25倍数下观察EYFP基因表达情况。如图2所示，与对照P_{CaMV 35S}:EYFP和P_Ubi1:EYFP甘蔗嫩叶组织中的一样，在P_SCBV-GT127:EYFP甘蔗嫩叶组织中观察到黄色荧光蛋白，表明启动子P_SCBV-GT127能驱动EYFP基因在甘蔗嫩叶组织中表达。

以上结果表明，启动子P_SCBV-GT127具有较强的启动子活性，在单双子叶细胞中均能高效驱动外源基因的表达。

实施例4拟南芥稳定表达材料制备和GUS蛋白活性测定方法

4-1质粒转化农杆菌感受态细胞

将上述提取保存的质粒P_SCBV-GT127:GUS、P_{CaMV 35S}:GUS和P_Ubi1:GUS进行农杆菌感受态细胞GV3101的转化，转化步骤如下：(1)取1μg各组质粒DNA分别加入到200μL制备好的GV3101感受态细胞中，轻弹混匀；(2)将混合液置于液氮中10min，冰上放置5min；(3)取200μL无抗LB液体培养基加入到混合液中，28℃摇床，200rpm/min活化2h；(4)将活化好的转化液置于无菌的超净工作台中，取100μL涂布于含50μg/mL的卡那霉素和利福平的LB固体平板培养基上，28℃倒置培养2天；(5)挑取单菌落，摇菌后进行菌液PCR，跑胶检测是否有目的条带，挑选具有目的质粒的阳性农杆菌菌液进行扩大培养，-80℃冰箱保存备用。

4-2拟南芥转化及转基因苗筛选

具体步骤如下：(1)取上述各组阳性农杆菌菌液10μL到10mL LB液体培养基(50μg/mL的卡那霉素和利福平)中，28℃，200rpm/min过夜活化；(2)将10mL农杆菌菌液接种到200mL LB液体培养基(50μg/mL的卡那霉素和利福平)中，28℃，200rpm/min活化至OD₆₀₀＝0.8～1.0，5000rpm/min室温离心5min，收集菌体；(3)弃上清，加入10mL侵染液(1/2MS，2.215mg/mL；蔗糖，5％(W/V)；Silwet 77，0.02％(W/V))重悬菌体，5000rpm/min室温离心5min，收集菌体；(4)弃上清，加入200mL侵染液重悬菌体；(5)选取初果期的健壮拟南芥，去除果荚，仅保留未盛开的花序，平放植株使花序完全浸入侵染液中，浸泡1min后将植株平放于新的托盘中，用保鲜膜覆盖并于暗室培养24h；(6)黑暗处理1天后，取出植株置于人工气候培养室进行正常培养，大约一个月植株成熟，收获T0代种子进行转基因植株筛选；(7)配制抗性板，将消毒后的T0代种子平铺在板上，4℃黑暗春化2-4天后取出，23℃恒温培养箱中培养2-3周，取阳性苗移栽到营养土中，PCR再次鉴定阳性苗，继续培养至得到T₃纯合种子用于后续实验。

4-3 GUS染色方法

GUS染色缓冲液：50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，0.5mM K₃Fe(CN)₆，0.5mM K₄Fe(CN)₆，10mM Na₂EDTA，0.1％(v/v)Triton X-100和1mg/mL X-Gluc，其中X-Gluc应先溶于DMSO中再加入，-20℃避光保存。

GUS终止反应液：0.2M Na₂CO₃。

GUS反应液：50mM磷酸缓冲液(pH＝7.0)，10mM Na₂EDTA(pH＝8.0)，0.1％(v/v)Triton X-100，0.07％(v/v)β-巯基乙醇和1mM 4-甲基伞形酮-β-D葡萄苷酸(4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide，4-MUG)，现配现用。

GUS组织化学染色参考Jefferson等(1987)的方法进行：将转基因拟南芥浸泡于GUS染色缓冲液中，37℃染色6～12h，70％乙醇脱色直至脱色完全，观察并照相。如图3所示，对照组成型启动子P_{CaMV 35S}:GUS和P_Ubi1:GUS转基因植株在根、茎、叶组织中均检测到GUS表达，而P_SCBV-GT127:GUS转基因植株的GUS仅表达在根、茎和叶的维管束组织中，表明P_SCBV-GT127启动子为维管束组织特异表达启动子。

4-4GUS蛋白活性分析

(1)溶液配制：4-甲基伞形酮(4-MU)1mM的母液：称取0.04404g 4-MU用GUS终止反应液定容到250mL；4-MU 1μM的母液：将0.5mL 1mM的4-MU母液稀释至500mL。

(2)GUS蛋白的提取：植物粗蛋白的提取通过植物蛋白提取试剂盒(索莱宝，北京)完成，将拟南芥组织材料用液氮研磨成粉后，加入1mL的提取液混匀，冰上放置20min，期间每隔5min震荡1次，于4℃，14000rpm离心30min，吸取上清至新的离心管中备用。

(3)蛋白浓度的测定：采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝，北京)完成。配制不同浓度梯度的BSA(0μg/μL、0.0625μg/μL、0.125μg/μL、0.5μg/μL、1μg/μL以及2μg/μl梯度液)，每浓度梯度吸取20μL到96孔板中，分别加入200μL BCA工作液(BCA:Cu²⁺＝50:1)，混匀，37℃孵育15～30min，并于酶标仪中测定595nm光吸收值，每个浓度梯度3次重复，根据吸收值与对应的蛋白浓度绘制蛋白浓度标准曲线；取20μL样品蛋白粗提液，加入200μL BCA工作液，混匀后37℃孵育15～30min，于酶标仪中测定595nm光吸收值，根据蛋白浓度标准曲线计算样品的蛋白质含量。

(4)GUS荧光测定：以1μM 4-MU作为荧光标准物，配置不同浓度梯度的4-MU(0nM、50nM、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM和1000nM)，每浓度梯度吸取200μL至酶标板中，去除气泡后，利用酶标仪在激发光365nm，发射光455nm的条件下测定不同浓度梯度下4-MU的荧光值，每个浓度梯度3次重复，根据荧光值与对应的浓度绘制4-MU的标准曲线。取20μL样品粗提蛋白液，加入480μL GUS反应液，混匀后于37℃孵育，分别在0min和60min各取100μL反应液，迅速加入到0.9mL的GUS终止反应液中终止反应，取200μL至酶标板中，去除气泡后，利用酶标仪在激发光365nm，发射光455nm的条件下测定样品荧光值。根据4-MU的标准曲线计算样品的中GUS蛋白的活性。

GUS酶活性测定结果如表1所示：

表1不同SCBV启动子驱动GUS在转基因拟南芥各组织上蛋白表达活性

结果表明，P_SCBV-GT127:GUS转基因植株中根组织的GUS蛋白活性最高，显著高于茎和叶中的GUS酶活性。而对照P_{CaMV 35S}:GUS和P_Ubi1:GUS转基因植株中GUS酶活性在根、茎、叶中无显著性差异(P>0.05)，表明启动子P_SCBV-GT127虽是维管束组织特异性启动子，但在根、茎、叶中的表达也具有一定的差异性。

综上，本发明的启动子P_SCBV-GT127仅在拟南芥维管束中特异性表达，因此可用于启动目的基因在维管束中特异性表达。

以上实施例仅公布了在洋葱、甘蔗、拟南芥中外源EYFP和GUS基因在维管束组织中受启动子P_SCBV-GT127的驱动表达，本发明也可延伸至其他功能基因，例如杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因等，以及延伸至其他单子叶植物和双子叶植物，并应用于植物基因工程中高效驱动目的基因在植物维管束组织中表达。本发明也可应用于植物生物反应器，以期获得在维管束组织中目标蛋白高产量的转基因植物生物反应器。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省科学院南繁种业研究所

<120>一种来自甘蔗杆状病毒的维管束组织特异性启动子PSCBV-GT127及应用

<130> 2022-02-19

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 694

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aagagccaac tctactatgt ggatgcagga ggcctgcaat aatgctcact tcagggacaa 60

gatggaaccc taggagaaaa tttttcaagt gtgccttgaa caattgccac tgttggtatt 120

gggcagatct acttgaagaa tacgtgcaag agaggatcga agatttcatg gcagaaaact 180

tcgacaggaa actgggactt gacgatccta gttcatcaac gccttaccca gagcttgaag 240

atcaccgttc aagtgtcatt gataggccaa ggcctactga tgatcatttc agaccatggg 300

gagatgttgc atatgtgcta tgcaatgaag aggaagaatg ccacacgcag gatgacaggg 360

ttgaagatgc aatcgatctt actgacgcaa gcaatgacga tcaatggaga aggtcgtaag 420

cagtgacgta tggagcgtgg aggacccata agagcactca gaaggtacct caactttcgg 480

tgtgtcggtg cgcatcctat gcgatgcttt gtatcgtgtg tgtctttttc ggcatctgtg 540

ccactttacc tttgtcggcc acgttgcctt tgcttagcat ggacgcaaag catagcgctc 600

ggctggtgtg tgtgccctct gcctatataa ggcatggttg taagactctt acactcatcg 660

gtagtccacc acatgagtat ttgagtcaag tttg 694

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaagagyggs tttcatcaag t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctccgcttca ggtattcca 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aagagccaac tctactatgt ggatg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caaacttgac tcaaatactc atgtg 25

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cgggcccccc ctcgagaaga gccaactcta ctatgtggat g 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cccttgctca ccatggcaaa cttgactcaa atactcatgt g 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggccagtgcc aagcttaaga gccaactcta ctatgtggat g 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaccacccgg ggatcccaaa cttgactcaa atactcatgt g 41

Claims

1.一种植物维管束组织特异性启动子的以下任一应用：

（1）调控目的基因在植物维管束组织特异性表达中的应用；

（2）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能中的应用；

（3）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能育种中的应用；其特征在于，所述启动子的核苷酸序列为：

（1）含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的序列；或

（2）由SEQ ID NO：4所示的上游引物和SEQ ID NO：5所示的下游引物通过PCR扩增获得的序列；所述植物为甘蔗、洋葱、或拟南芥。

2.一种植物表达盒的以下任一应用：

（1）调控目的基因在植物维管束组织特异性表达中的应用；

（2）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能中的应用；

（3）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能育种中的应用，其特征在于，所述表达盒包括以可表达的方式彼此连接的如权利要求1中的所述启动子、由如权利要求1中所述启动子驱动表达的目的基因和终止子；

所述植物为甘蔗、洋葱、或拟南芥。

3.如权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述目的基因为杀虫基因、抗病基因、抗逆基因、除草基因或报告基因。

4.如权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述报告基因为EYFP或GUS基因。

5.含有如权利要求1中的所述启动子或权利要求2~4任一项中的所述表达盒的重组载体的以下任一应用：

（1）调控目的基因在植物维管束组织特异性表达中的应用；

（2）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能中的应用；

（3）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能育种中的应用；

所述植物为甘蔗、洋葱、或拟南芥。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为P_SCCBV-GT127:GUS或P_SCCBV-GT127:EYFP；

所述P_SCCBV-GT127:GUS载体为将pCAMBIA1305载体中GUS基因的CaMV 35S启动子序列替换为如权利要求1中的所述启动子序列后获得的重组载体；

所述P_SCCBV-GT127:EYFP载体为将pTEM12载体中EYFP基因的Ubi1启动子序列替换为如权利要求1中的所述启动子序列后获得的重组载体。

7.含有如权利要求1中的所述启动子，或权利要求2~4中的任一项所述的表达盒，或权利要求5~6任一项中的所述的重组载体的宿主细胞的以下任一应用：

（1）调控目的基因在植物维管束组织特异性表达中的应用；

（2）在提高植物抗病、抗虫害或抗逆境胁迫性能中的应用；

所述植物为甘蔗、洋葱、或拟南芥。

8.一种在植物维管束组织中特异性表达外源基因的方法，其特征在于，包括将权利要求1中的所述启动子，或权利要求2~4任一项中所述表达盒，或权利要求5~6中的任一项所述重组载体导入植物中，并通过筛选获得转基因植物，所述植物为甘蔗、洋葱、或拟南芥。