CN107290533A - 甘蔗杆状病毒Dot‑ELISA检测方法及其试剂盒与应用 - Google Patents

甘蔗杆状病毒Dot‑ELISA检测方法及其试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘蔗杆状病毒Dot‑ELISA检测试剂盒，主要包括兔抗的甘蔗杆状病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体和辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔lgG标准液。据此，发明人还建立了相应的Dot‑ELISA检测方法，并将之用于甘蔗中甘蔗杆状病毒检测。与现有技术相比，本发明具有灵敏度高、特异性好、成本低、高通量、检测快速等优点。

Description

甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法及其试剂盒与应用
技术领域
本发明属于甘蔗杆状病毒检测领域，尤其涉及一种甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法及其试剂盒与应用。
背景技术
甘蔗是世界上最重要的糖料作物，也是最具潜力的可再生能源作物。甘蔗生长过程中会受到病毒的危害，且经过长期无性繁殖，多种病毒会积累在不同甘蔗品种及种质材料中，导致其种性退化，产量和品质下降，给甘蔗产业造成巨大的损失。
甘蔗杆状病毒病是由甘蔗杆状病毒(Sugarcane bacilliform virus，SCBV)感染引起的一种病害，该病害于1985年首次在古巴的甘蔗上发现，迄今为止世界上主要的甘蔗种植区均报道了该病的发生。近年来，我国大陆地区陆续在广东、广西和云南的甘蔗上检测到SCBV核酸同源序列。SCBV属于花椰菜病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)，目前共分为8个种和13个种群。该病毒粒体为杆状，其基因组为双链环状松弛DNA。SCBV主要通过甘蔗种茎进行远距离传播，近距离可通过蔗茎红粉蚧进行传播，但难以通过机械传播。甘蔗受到SCBV侵染后可产生多种症状，一些品种出现叶片雀斑和斑驳，发病严重的植株叶片出现不同程度的褪绿条纹和矮缩，但症状表现不稳定，有时会出现隐症侵染。
目前检测病毒常用的方法大致分为分子检测技术和血清学检测技术两类。分子检测技术是一种基于核酸水平的检测，具有准确高效、灵敏快速的特点，但操作比较复杂，成本很高。常见的SCBV检测方法为PCR检测技术，首先需要对甘蔗提取总DNA，再进行PCR扩增，最后进行电泳分析，甚至还要进行基因组序列测定。PCR技术操作过程繁琐、耗时长，并且该技术完全依赖于PCR仪器和商业化的试剂，所以实验成本较高，不利于田间病毒病的大规模检测。此外，PCR技术假阳性较高，整个过程需要专业人员操作，难以普及推广。以单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术是较为简便的检测方法，它具有操作方便、灵敏度高等优点。但常用的血清学方法----ELISA需要在96孔酶联反应板进行，实验步骤多，各步骤反应时间长，数据要借助酶标仪读取；其材料成本高和对仪器高度依赖的特点不利于大规模样品的检测。
斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)是以硝酸纤维素膜(nitro cellulosemembrane，NCM)为载体而发展起来的一种酶联免疫吸附方法，具有试剂用量少、操作简便、反应快速、不需要特殊仪器设备辅助、结果直观等特点。此外，Dot-ELISA检测还具有灵敏度高、特异性强、成本低等优势，适于大批量样品检测。然而，至今未见将Dot-ELISA检测技术应用于甘蔗病毒检测，因缺乏标准化的试剂和材料，难以在非实验室环境下进行，不能进行田间检测，更难以实现大规模样品的快速检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性好、成本低、高通量、检测快速的甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法及其试剂盒与应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒，主要包括兔抗的甘蔗杆状病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。
制备按以下操作进行：从NCBI网站获得SCBV的CP基因序列，预测CP蛋白的氨基酸序列，选取暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。
多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法，以兔抗的甘蔗杆状病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液作为二抗对甘蔗中的甘蔗杆状病毒进行Dot-ELISA检测。
上述甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法，按以下步骤进行操作：
A.PVDF膜的活化：将画方格的PVDF膜用甲醇活化2min；
B.样品处理：取约0.2-0.5g待测甘蔗样品将其制成匀浆，离心或静置沉淀，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用；
C.样品包被：取20μl所测样品或SCBV抗原标准液滴在经甲醇活化了的PVDF膜点样孔中，在室温条件下包被1-2h；
D.洗涤：将已包被好的PVDF膜放置在培养皿中，加入PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.封闭：将PVDF膜取出浸入封闭液中，室温条件下孵育1h，期间震荡3-4次，取出后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.抗体孵育：将PVDF膜浸入1：40000稀释的兔抗的SCBV CP蛋白抗血清标准液中，室温条件下孵育45min，漂洗3次；再将PVDF膜浸入1：8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液中，室温条件下孵育30min，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
G.底物显色及终止反应：将PVDF膜浸入沉淀型TMB底物显色液中，室温条件下避光显色10min，取出在蒸馏水中漂洗2次以终止反应，把PVDF膜置于滤纸上干燥，记录试验结果并避光保存；
H.结果判定：观察PVDF膜上的颜色，并与阳性和阴性结果比较，比阴性对照颜色深即为阳性；反之则为阴性。
甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒用于甘蔗中甘蔗杆状病毒的Dot-ELISA检测。
甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法用于甘蔗中甘蔗杆状病毒的Dot-ELISA检测。
针对现有甘蔗中甘蔗杆状病毒检测缺乏有效检测措施的问题，发明人设计并制备了甘蔗中的甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒，主要包括兔抗的甘蔗杆状病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。据此，发明人还建立了相应的Dot-ELISA检测方法，并将之用于甘蔗中甘蔗杆状病毒检测。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
(1)本发明采用PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)作为载体，吸附效果比NC膜好，其灵敏度比NC膜的高。此外，在实验条件优化中采用病毒积累量低的嫩叶作为实验材料，从而使该试剂盒的灵敏度再次提高。
(2)本发明既适用于田间对少量样品的快速检测，和田间甘蔗杆状病毒发病率调查，以及检测甘蔗种苗的带毒情况；若与样品处理系统连用可实现该病毒的快速、高通量检测，因此也适用于实验室内的大量样品的高通量快速检测。
(3)本发明提供的各种试剂的浓度和参数配比均是经上百次实验精细调试优化所得。所用抗体能特异性的识别甘蔗杆状病毒，对高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒等其他病毒均不能识别。各项指标的综合运用实现了样品需要量少、检测灵敏度高，特异性强、耗时短、成本低的特点，并且具有操作简单快速，无需专业技术人员，对仪器的依赖性低，实用性强等优势。一个人只需要5-6小时就能完成几百份甘蔗样品的检测，并且样品越多优越性越明显，利于田间和甘蔗种公司的大规模推广应用，可用于田间甘蔗杆状病毒携带情况的调查研究，也可用于甘蔗种苗带毒情况的统计分析，解决了大量样品检测耗时耗力，成本高昂的缺点。
附图说明
图1是验证本发明中一抗特异性的Western blotting图，图中：M是蛋白Marker，1是带高粱花叶病毒的甘蔗的总蛋白，2是健康甘蔗的总蛋白。
图2是本发明实施例中所述的样品处理系统图。
图3是本发明实施例一中SCBV的Dot-ELISA检测结果图。
图4是本发明实施例二中SCBV的Dot-ELISA检测结果图。
具体实施方式
实施例一 甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒在田间的运用
A.PVDF膜的活化：将画方格的PVDF膜用甲醇活化2min。
B.样品处理：取约0.5g待测甘蔗样品放入研钵中，加入适量的石英砂，再加入2-5mlPBS缓冲液；研磨至样品呈匀浆状，静置沉淀15min，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用。
C.样品包被：取20μl所测样品或SCBV抗原标准液滴在经甲醇活化了的PVDF膜点样孔中，在室温条件下包被1-2h；
D.洗涤：将已包被好的PVDF膜放置在培养皿中，加入PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.封闭：将PVDF膜取出浸入封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBST溶液)中，室温条件下孵育1h，期间震荡3-4次，取出后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.抗体孵育：将PVDF膜浸入1∶40000稀释的兔抗的SCBV CP蛋白抗血清标准液中，室温条件下孵育45min，漂洗3次；再将PVDF膜浸入1∶8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液中，室温条件下孵育30min，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
G.底物显色及终止反应：将PVDF膜浸入沉淀型TMB底物显色液中，室温条件下避光显色10min，取出在蒸馏水中漂洗2次以终止反应，把PVDF膜置于滤纸上干燥，记录试验结果并避光保存。
H.结果判定：观察PVDF膜上的颜色，并与阳性和阴性结果比较，比阴性对照颜色深即为阳性；反之则为阴性。
结果：田间检测只能采用手工磨样，难以进行大批量样品检测。因未经离心处理，研磨液中色素含量较高，使结果颜色较深，会对检测结果造成干扰。检测结果如图3所示，阴阳性颜色区别显著，肉眼即可判断检测结果。与RT-PCR检测符合率为89％，检测可信度很高，可以大批量推广使用。
实施例二 甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒在实验室内的运用
A.PVDF膜的活化：将画方格的PVDF膜用甲醇活化2min。
B.样品处理：取约0.2g待测甘蔗样品装到2ml的EP管中，加入2颗小钢珠并加入0.5-1.5ml包被缓冲液。经样品处理系统(美国MP Biomedicals公司FastPrep-24)处理1-3min即可将样品打呈匀浆状，8000-12000r/min离心2min，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用。
C.样品包被：取20μl所测样品或SCBV抗原标准液滴在经甲醇活化了的PVDF膜点样孔中，在室温条件下包被1-2h；
D.洗涤：将已包被好的PVDF膜放置在培养皿中，加入PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.封闭：将PVDF膜取出浸入封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBST溶液)中，室温条件下孵育1h，期间震荡3-4次，取出后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.抗体孵育：将PVDF膜浸入1∶40000稀释的兔抗的SCBV CP蛋白抗血清标准液中，室温条件下孵育45min，漂洗3次；再将PVDF膜浸入1∶8000稀释的辣根氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液中，室温条件下孵育30min，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
G.底物显色及终止反应：将PVDF膜浸入沉淀型TMB底物显色液中，室温条件下避光显色10min，取出在蒸馏水中漂洗2次以终止反应，把PVDF膜置于滤纸上干燥，记录试验结果并避光保存。
H.结果判定：观察PVDF膜上的颜色，并与阳性和阴性结果比较，比阴性对照颜色深即为阳性；反之则为阴性。
结果：在实验室内可采用样品处理系统磨样，适于大批量样品检测。研磨液经离心色素含量较低，不会干扰检测结果。结果如图4所示，阴阳性颜色区别显著，肉眼即可完成检测结果判断。与RT-PCR检测符合率为92％，检测可信度很高，可以大批量推广使用。实施例三甘蔗杆状病毒Dot-ELISA高通量快速检测试剂盒的组装应用
为方便使用，参照前述发明内容及实施例组装检测试剂盒(100次)如下：
<1>试剂盒组分
以上试剂均-20℃保存
以上试剂均4℃保存
2ml EP管 100个
直径为0.2-0.7cm的小钢珠 50颗
以上材料均室温保存。
其中，SCBV-CP多克隆抗体的制备如下：从NCBI网站获得SCBV的CP基因序列，预测CP蛋白的氨基酸序列，选取暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽CGIIRRTGQDHARGA(SEQ.ID.No.1)，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。
<2>试剂盒使用注意事项
①不可用手直接触摸PVDF膜；
②研磨样品时量不能过多，否者样品处理不足，病毒不能充分释放到缓冲液中。
③包被后若色素较深，可用甲醇浸泡PVDF膜，从而消除色素干扰。
④离心时速度为8000-12000r/min，时间为3-10min，最大程度的去除上清液中的色素，防止色素干扰。
⑤PVDF膜点样一面为正面，在整个实验中要朝上；用笔在PVDF膜的保护层上画0.8cmx0.8cm的方格，使膜上有清晰的印子，作为点样孔；每张膜上均设有阴阳性点样孔。
⑥抗体在使用前15min内稀释；
⑦试剂盒反应温度为4-40℃，最佳反应温度为35℃。
⑧试剂盒内抗体为-20℃保存，其余试剂和耗材均2-8℃保存，该试剂盒有效期为6个月。
应用本例制备的病毒检测试剂盒，参照实施例二并采用相应发病症状的甘蔗样品，其检测结果与实施例二相同，且检测快速、结果可靠，表明该病毒检测试剂盒可以大批量推广使用。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法及其试剂盒与应用
<130> 甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法及其试剂盒与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Cys Gly Ile Ile Arg Arg Thr Gly Gln Asp His Ala Arg Gly Ala
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒，其特征在于主要包括兔抗的甘蔗杆状病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔1gG标准液。
2.根据权利要求1所述的甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒，其特征在于所述制备按以下操作进行：从NCBI网站获得SCBV的CP基因序列，预测CP蛋白的氨基酸序列，选取暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法及其试剂盒与应用，其特征在于：所述多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
4.一种甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法，其特征在于以兔抗的甘蔗杆状病毒外壳蛋白制备的多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液作为二抗对甘蔗中的甘蔗杆状病毒进行Dot-ELISA检测。
5.根据权利要求5所述的甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法，其特征在于按以下步骤进行操作：
A.PVDF膜的活化：将画方格的PVDF膜用甲醇活化2min；
B.样品处理：取约0.2-0.5g待测甘蔗样品将其制成匀浆，离心或静置沉淀，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用；
C.样品包被：取20μL所测样品或SCBV抗原标准液滴在经甲醇活化了的PVDF膜点样孔中，在室温条件下包被1-2h；
D.洗涤：将已包被好的PVDF膜放置在培养皿中，加入PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.封闭：将PVDF膜取出浸入封闭液中，室温条件下孵育1h，期间震荡3-4次，取出后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.抗体孵育：将PVDF膜浸入1：40000稀释的兔抗的SCBV CP蛋白抗血清标准液中，室温条件下孵育45min，漂洗3次；再将PVDF膜浸入1：8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液中，室温条件下孵育30min，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
G.底物显色及终止反应：将PVDF膜浸入沉淀型TMB底物显色液中，室温条件下避光显色10min，取出在蒸馏水中漂洗2次以终止反应，把PVDF膜置于滤纸上干燥，记录试验结果并避光保存；
H.结果判定：观察PVDF膜上的颜色，并与阳性和阴性结果比较，比阴性对照颜色深即为阳性；反之则为阴性。
6.权利要求1所述甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测试剂盒用于甘蔗中甘蔗杆状病毒的Dot-ELISA检测。
7.权利要求5所述甘蔗杆状病毒Dot-ELISA检测方法用于甘蔗中甘蔗杆状病毒的Dot-ELISA检测。
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