CN109852588A - 一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用，本发明的抗罗非鱼IgM的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2018244的杂交瘤细胞株Ti‑IgM‑B6分泌产生的，抗体效价大于1:10000，杂交瘤细胞株活性高，特异性高；而且利用单克隆抗体建立了检测罗非鱼湖病毒的间接ELISA方法，对罗非鱼疾病流行病学调查、病原诊断、疫病防控等具有较高的价值，为其他养殖鱼类疾病的防治提供参考。

Description

一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用。

背景技术

罗非鱼产业是我省渔业发展和渔民增收的支柱品牌之一。但是，近年来罗非鱼病害频繁发生，如罗非鱼链球菌病、罗湖病毒病等，对全球罗非鱼养殖产业造成了巨大的经济损失，成为罗非鱼产业可持续发展的主要制约因素之一。疫病诊断是防控这些病害的重要工具和前提，目前，针对罗非鱼的主要病害，缺乏有效的现场快速检测方法。

抗体是脊椎动物的免疫系统在抗原的刺激下，由淋巴细胞所产生的可与相应的抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，硬骨鱼类中已经报道的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ和IgT，其中IgM(免疫球蛋白M)是一类存在于所有有颌类脊椎动物中的抗体。

罗非鱼湖病毒的分离操作过程较为复杂，所需条件和技术也要求较高，难于广泛应用。现有方法检测是否存在病毒核酸，方法单一，经常导致假阳性和假阴性结果，难做到定量检测与确诊。因此，亟需建立一种罗非鱼湖病毒的高效快速的检测方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一株杂交瘤细胞株B6，已于2018年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： C2018244。生物材料样品的分类命名是Ti-IgM-B6，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2018244。

本发明的另一个目的是提供一种由上述保藏编号为CCTCC C2018244的杂交瘤细胞株分泌产生的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种罗非鱼湖病毒间接ELISA检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一株杂交瘤细胞株B6于2018年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2018244。

一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，是由上述保藏编号为CCTCCC2018244的杂交瘤细胞株分泌产生。

上述的单克隆抗体在制备检测罗非鱼免疫球蛋白IgM的产品中的应用。

上述的单克隆抗体在制备用于检测罗非鱼湖病毒的产品中的应用。

进一步的，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片或试纸。

一种罗非鱼湖病毒间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的单克隆抗体。

进一步的，该试剂盒还包括：包被液、标准血清、洗涤液、HRP标记羊抗鼠抗体、TMB

显色液、终止液、阳性对照品和阴性对照品。

一种罗非鱼湖病毒间接ELISA检测方法，包括如下步骤：

(1)将样品加在包被有罗非鱼湖病毒的ELISA酶标板中；

(2)封板后孵育；

(3)洗涤样品；

(4)将上述的单克隆抗体稀释后加到酶标板中；

(5)孵育、洗涤；

(6)稀释HRP标记羊抗鼠抗体，加到酶标板中孵育；

(7)孵育、洗涤；

(8)加入酶的底物显色液，避光显色；

(9)加入酶的终止液终止显色反应，读取OD_450nm吸光度值；

(10)根据吸光度值判断阴阳性；

上述方法不用于疾病的诊断与治疗。

进一步的，步骤(4)中所述的稀释倍数为2000～5000倍。

进一步的，步骤(4)中孵育条件为35～38℃孵育0.5～1.5h。

本发明的有益效果是：

本发明的杂交瘤细胞株及所分泌的抗罗非鱼IgM单克隆抗体具有以下优点：

1)本发明的杂交瘤细胞株由SP2/0细胞骨髓瘤细胞与免疫了罗非鱼免疫球蛋白IgM的小鼠脾细胞融合而获得；

2)本发明的杂交瘤细胞株，能够无限增殖并持续产生抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体；

3)本发明的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体效价高于1:10000，可以特异性识别罗非鱼免疫球蛋白IgM。

附图说明

图1为纯化的罗非鱼免疫球蛋白的SDS-PAGE胶检测图，其中1为纯化的罗非鱼IgM，2为Marker；

图2为抗IgM单克隆抗体的Western Blot特异性检测图，其中1为Marker；2为单克隆抗体检测罗非鱼血清。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备和纯化

实验材料：

试验罗非鱼来源于中国水产科学研究院珠江水产研究所，体长15-20cm；其他化学试剂为分析纯，由广州威佳科技有限公司提供。

1.罗非鱼IgM纯化

1.1断尾采取罗非鱼血液，置于玻璃管中，于室温下凝固，先于37℃下放置2h，再于4℃放置过夜，待血清充分析出后，3000g/min离心10min,取其上清。

1.2纯化：将鱼血清12000rpm离心20min，取上清；测量上清液的体积；边搅拌边将饱和硫酸铵溶液缓慢加入到上清液，至最终饱和度为33％。将溶液放在磁力搅拌器上搅拌过夜 (4℃)，使蛋白质充分沉淀；蛋白质溶液10000rpm离心30min(4℃)，将上清移至干净管中，沉淀用适量的1×PBS溶解，放入透析袋(8000-14000kd)在1×PBS透析24-48小时(4℃)，每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底去除硫酸铵沉淀；透析后溶液5000rpm离心10min，上清转到干净的试管中，留取小样A备用；在之前的硫酸铵沉淀离心上清溶液中，继续缓慢添加饱和硫酸铵至饱和度为50％；将溶液放在磁力搅拌器上搅拌过夜(4℃)，使蛋白质充分沉淀；蛋白质溶液10000rpm离心30min(4℃)，将上清移至干净管中，沉淀备用；将沉淀溶于少量1×PBS中，沉淀溶解后放入透析袋在1×PBS透析24-48小时(4℃)，每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵；透析之后的溶液5000rpm离心10min，取上清转到干净管中，并取小样B备用；对两次饱和度的留取小样A和B进行电泳检测；之后将50％硫酸铵沉淀的透析上清过Protein A柱进行纯化(通过填料和上清混合后于摇床上摇晃反应 4h)。

1.3纯化后IgM的检测：通过SDS-PAGE电泳检测血清中IgM的纯化效果，将样品和样品缓冲液等体积混合后，100℃沸水水浴3-5min，经离心后上样。分离胶浓度为12％，电泳电压为100V，电泳时间为1h，电泳后用考马斯亮蓝染色。

检测结果表明，经Protein A亲和层析柱纯化的样品进行SDS-PAGE检测，得到大小约为 75kD与25kD的两条带，分别与罗非鱼IgM重链和轻链分子量相近(见图1)。

2.IgM单克隆抗体的特异性分析

如图2的Western Blot检测图所示，本发明制备的抗罗非鱼IgM单克隆抗体，能够与罗非鱼IgM特异性反应，说明了本发明的单克隆抗体是特异性地识别罗非鱼IgM。

3.动物免疫

以步骤1获得的纯化的罗非鱼IgM作为特异性抗原免疫6周龄BALB/c小鼠，取6只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原，第一次免疫将抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，100ug/只；两周后进行第二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，50ug/只；两周后进行第三次免疫，免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠断尾采血测其效价，第三次免疫两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

4.小鼠融合

3.1小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞融合

将生长状态良好的SP2/0细胞，吹打下来后，1000rpm离心5min；弃去上清，用20-40ml 预热的1640培养液重悬，1000rpm离心5min；重复上述步骤；弃去上清，加入适量预热的1640培养液重悬沉淀；取50ul细胞悬液与150ul台盼蓝混匀后，于显微镜下检活计数；每个融合取1×10⁷个细胞，与处理好的1×10⁸个脾细胞在进口的50ml离心管中混合均匀后，1350rpm 离心7min；用抽液泵抽干上清；有节奏的在超净台桌面上敲打离心管底部，使沉淀松动呈糜状；沿着离心管底部的管壁，缓慢加入1ml预热的PEG，并用枪头顺时针方向搅拌，同时离心管保持逆时针方向转动。该步骤需在60-90s内完成；将离心管静置30-60s；沿管壁缓慢滴加5ml预热的1640培养液，再逐渐加快速度，加入15ml预热的1640培养液，再加入20ml SP2/0 骨髓瘤细胞培养液；1200rpm离心5min；弃去上清，将细胞重悬至100ml预热的含15％FBS 1*HAT的1640细胞培养液中，100ul/孔的量将混合细胞悬液铺到96孔细胞培养板上。然后将培养板置37℃、5％CO₂培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d 后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。

HAT培养基的配制：将50倍浓缩的HAT(2ml，GIBCO公司)及特级胎牛血清(20ml，GIBCO公司)加入到高糖DMEM培养基(80ml，hyclone公司)中混匀。

3.2多克隆细胞株的ELISA检测

方法：包板：用Coating buffer稀释抗原至1ug/ml，以50ul/孔的量铺到酶标板上，轻轻振摇使包被液铺满孔底，4℃包被过夜；次日弃去包被液，用PBST以200ul/孔洗1遍，在吸水纸上拍干；

封闭：以60ul/孔加入1％BSA，37℃封闭1h；

一抗(加样)：将稀释好的样品以50ul/孔加入到酶标板上，同时设置好阳性对照与阴性对照(对照组需做复孔)，37℃作用1h；用PBST以200ul/孔清洗2遍；

二抗：用1％BSA稀释HRP(辣根过氧化酶)标记的羊抗鼠二抗，1:10000稀释，以50ul/ 孔加入到酶标板上，37℃作用45min；用PBST以200ul/孔清洗3遍；

显色：每孔加入100ul的TMB显色液(现配现用)；37℃孵育15min；

终止反应：每孔加入100ul的2M H₂SO₄以终止反应；

读数：在酶标仪上测定OD _450nm读数，分析所得数据。一般ELISA>0.3，P/N比值大于2.1则认为是阳性，如果阳性值较多的，则会从高挑选，一般会选ELISA>1.0的阳性值。

结果：筛选出32个阳性细胞株；对其中6个利用Western Blot检测方法进一步筛选多克隆细胞株，根据结果选择条带最亮的3个细胞株进一步挑选单克隆细胞株。

5.单细胞克隆株的筛选

4.1单克隆细胞株的ELISA检测

ELISA检测方法与3.2多克隆细胞株的ELISA检测相同。

结果筛选出23个阳性细胞株；对其中6个利用Western Blot检测方法进一步筛选单克隆细胞株，根据结果选择条带最亮两个单克隆细胞株制备腹水(其中一株为B6单克隆细胞株)。

4.2单细胞克隆株的亚型分析

方法：包板：用Coating buffer稀释抗原至1ug/ml，以50ul/孔的量铺到酶标板上，轻轻振摇使包被液铺满孔底，4℃包被过夜；次日弃去包被液，用PBST以200ul/孔洗1遍，在吸水纸上拍干；封闭：以60ul/孔加入1％BSA，37℃封闭1h；将稀释好的羊抗鼠分型二抗以50ul/孔加入到酶标板上，37℃作用1h；用PBST以200ul/孔清洗2遍；加二抗：用1％BSA 稀释羊抗鼠HRP二抗1:10000稀释，以50ul/孔加入到酶标板上，37℃作用45min；用TBST 以200ul/孔清洗3遍；显色：每孔加入100ul的TMB显色液(现配现在用)；37℃孵育15min；终止反应：每孔加入100ul的2M H₂SO₄以终止反应；读数：在酶标仪上测定OD 450nm读数。

结果：B6单克隆细胞株大亚型为IgG2a型，γ重链。

杂交瘤细胞株B6，已于2018年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC C2018244。

4.3单细胞克隆株的腹水效价分析

ELISA检测方法与3.2多克隆细胞株的ELISA检测一样。

结果发现将腹水稀释比例为1:10000时的吸光值都大于1。

6.单抗纯化

取4只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)重悬于无血清培养基中，按1×10⁶个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞约 7-14d后收集腹水。用50mM PBS预处理protein G亲和层析柱；将腹水样品上柱，收集流穿液；加入pH3.0、0.1M甘氨酸-HCl洗脱，通过SDS-PAGE胶检测纯化后抗体的纯度。结果表明，通过protein G亲和柱纯化的抗体，其效价高于1:10000(表1)。

表1单抗效价分析

实施例2罗非鱼湖病毒间接ELISA检测试剂盒

检测罗非鱼湖病毒的间接ELISA试剂盒的组成为：实施例1制备的单克隆抗体；包被液；辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体(购自武汉博士德生物技术公司)；酶的底物反应液；阳性对照；阴性对照(标准血清)；洗涤液；TMB显色液和反应终止液。

阳性对照为纯化罗非鱼湖病毒，阴性对照为未感染的正常罗非鱼血清。

实施例3罗非鱼湖病毒间接ELISA检测方法的建立

1.抗原工作浓度的确定

将纯化的罗非鱼湖病毒用包被液(pH8.6)稀释为50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL浓度梯度，包被96孔酶标板，每孔加入100uL，4℃湿盒包被过夜。每孔加入300μL 10％的脱脂乳进行封闭，37℃温箱中孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3-5min。将抗TiLV(罗非鱼湖病毒)阳性血清、罗非鱼阴性血清进行1：300倍稀释，每孔加入100uL进行ELISA方阵试验，37℃温箱中孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3-5min。将上述制备的鼠抗罗非鱼IgM 抗体1:2000，每孔100uL，37℃温箱中孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3-5min。加入50μL 显色底物(TMB)，37℃避光显色10min。用50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。测定各孔OD₄₅₀nm 值，确定抗原工作浓度。

方阵滴定结果表明，当抗原包被浓度为30μg/mL P/N值最大，阳性血清OD_450nm值高于 1.0，阴性血清OD_450nm值小于0.2。因此，确定抗原的最适包被浓度为30μg/mL。

2.最佳封闭液和封闭时间的确定

分别选择1％脱脂奶粉、2.5％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉和1％BSA为封闭液进行封闭试验。选择最佳封闭液在37℃温箱中分别封闭30min、60min、90min、120min，确定最佳封闭时间。

结果表明，用5％脱脂奶粉作为封闭液的P/N值最高，而且阳性血清OD_450nm值大于1.0，阴性血清OD_450nm值小于0.2，封闭效果最好。在37℃条件下封闭60min时P/N值最高。

3.罗非鱼湖病毒间接ELISA检测方法的建立

(1)包被：采用包被液将纯化的TiLV病毒稀释到30μg/mL，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃湿盒包被过夜。

(2)封闭：每孔加入300μL 5％的脱脂乳进行封闭

(3)样品准备：用一次性注射器采取罗非鱼血液，置于离心管中，于室温下凝固，先于 37℃下放置2h，再于4℃放置过夜，待血清充分析出后，3000g/min离心10min,取其上清，作为检测样品。纯化的罗非鱼湖病毒作为阳性对照，以未免疫的正常罗非鱼血清作为阴性对照。

(4)加样：将上述步骤(3)制备的检测样品用PBST(pH7.4)按1:300进行稀释，将稀释好的样品按100μL/孔的量加入上述步骤封闭好的酶标板中。

(5)温育：用封板膜封板后置37℃温箱中孵育1h。

(6)洗涤：将样品从每个孔中吸出，用PBST洗涤3次，每次3-5min。

(7)鼠抗罗非鱼IgM抗体的稀释：将鼠抗罗非鱼IgM抗体，即本发明制备的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，用PBST(pH7.4)作1:2000稀释。

(8)加入鼠抗罗非鱼IgM抗体：将稀释好的鼠抗罗非鱼IgM抗体按100uL/孔的量加入上述步骤(6)中洗涤好的酶标板中。

(9)温育：同步骤(5)。

(10)洗涤：同步骤(6)。

(11)酶标二抗的稀释：将酶标二抗用PBST(pH7.4)作1:5000稀释。

(12)加入二抗：将稀释好的酶标二抗按100μL/孔的量加入上述步骤(10)中洗涤好的酶标板中。

(13)温育：同步骤(5)。

(14)洗涤：同步骤(6)。

(15)显色：加入新鲜配制的底物溶液(TMB:H₂O₂＝1:1)50μL/孔,用封板膜封板后置37℃避光显色10min。

(16)终止：加入50uL/孔2M的H₂SO₄终止液，终止反应。

(17)测定：采用波长450nm的酶标仪测定OD值。

(18)结果判断：OD_450nm≥0.20时判定为阳性。

4.罗非鱼湖病毒间接ELISA检测方法的特异性检验

将罗非鱼湖病毒利用本发明建立的间接ELISA试剂盒进行检测。

表2间接ELISA方法的特异性检测结果

抗原	鲤春病毒	草鱼呼肠孤病毒	阴性对照	阳性对照
					OD<sub>450</sub>	0.186	0.192	0.179	0.835

从表2可知，本发明的ELISA方法只与罗非鱼湖病毒阳性血清反应为阳性(0.835，大于0.20)，说明本发明ELISA方法特异性好。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明任何技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

Claims (10)

1.一株杂交瘤细胞株B6于2018年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018244。

2.一种抗罗非鱼的免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，是由权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO：C2018244的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测罗非鱼免疫球蛋白IgM产品中的应用。

4.权利要求3所述的单克隆抗体在制备检测罗非鱼湖病毒产品中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片或试纸。

6.一种罗非鱼湖病毒的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求2所述的单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的罗非鱼湖病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：包被液、标准血清、洗涤液、HRP标记羊抗鼠抗体、TMB显色液、终止液、阳性对照品和阴性对照品。

8.一种罗非鱼湖病毒的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将样品加在包被有罗非鱼湖病毒的ELISA酶标板中；

(2)封板后孵育；

(3)洗涤样品；

(4)将权利要求2的单克隆抗体稀释后加到酶标板中；

(5)孵育、洗涤；

(6)稀释HRP标记羊抗鼠抗体，加到酶标板中孵育；

(7)孵育、洗涤；

(8)加入酶的底物显色液，避光显色；

(9)加入酶的终止液终止显色反应，读取OD_450nm吸光度值，进行结果判断；

上述方法不用于疾病的诊断与治疗。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的稀释倍数为2000～5000倍。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中孵育条件为35～38℃孵育0.5～1.5h。