CN104198741A

CN104198741A - 罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒

Info

Publication number: CN104198741A
Application number: CN201410351849.3A
Authority: CN
Inventors: 吴斌; 樊海平; 张新艳; 郑磊; 钟全福
Original assignee: FUJIAN PROV INST OF FRESHWATER FISHERY
Current assignee: FUJIAN PROV INST OF FRESHWATER FISHERY
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-07-23
Also published as: CN104198741B

Abstract

本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒。该抗罗非鱼IgM特异性单克隆抗体，是由保藏号为CCTCCNO:C201277，抗罗非鱼IgM杂交瘤细胞株2H5/B5分泌产生的。该试剂盒包括已包被所述的单克隆抗体的酶标板、抗原罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白和SIP融合蛋白兔多克隆抗体的IgG-HRP酶标记物，以及抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。本发明的抗罗非鱼IgM特异性单克隆抗体效价和特异性高。所述的试剂盒操作简单，灵敏度高，特异性强，可用于罗非鱼无乳链球菌IgM抗体检测，具有很高的应用价值。

Description

罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于鱼类疫病特异性血清学检测技术领域，具体涉及罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒及专用单克隆抗体。

背景技术

链球菌病被我国列为三类疫病，是鱼类重要致病菌之一，也是人畜共患的病原菌之一。罗非鱼链球菌病近年在福建、广东、广西、海南等省的罗非鱼养殖中大规模暴发，造成了严重的经济损失。大量研究表明无乳链球菌(Streptococcus agalactiae )是引起罗非鱼链球菌病的致病体。

疫苗免疫是鱼类病害防控的有效方法，在鱼类的体液免疫应答过程中，免疫球蛋白是重要的免疫效应分子。目前硬骨鱼类中已经分离到的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ 和IgT、IgG 等。IgM 是一类存在于所有有颌类脊椎动物中的抗体，由两条轻链（L链）和两条重链（H链）所组成，通过连接链将4个单体连接成一个四聚体，分子量为700～850 kD。

罗非鱼作为我国主要的淡水鱼养殖品种之一，2006年以来，罗非鱼链球菌病给罗非鱼产业带来严重危机，免疫防治将成为控制该疾病的主要方向，为了明确罗非鱼免疫机制，吴铁军（2009）克隆、获得罗非鱼免疫球蛋白（IgM）重链的cDNA序列，全长1885bp，有一个长1770bp的完整ORF阅读框，编码588个氨基酸，分子量为41453.94 Da，为罗非鱼IgM重链基因功能的鉴定工作奠定了基础。黄婷（2010）采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼免疫球蛋白（IgM），并制备其兔抗血清。结果表明罗非鱼血清IgM重链和轻链分子量分别为88.0 kDa、21.0 kDa，制备的兔多抗效价为1∶32000。由于罗非鱼免疫球蛋白（IgM）兔多抗成分复杂，应用于罗非鱼免疫血清特异性抗体检测存在灵敏度不足、特异性差的问题。因此，制备特异性强的罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体对于罗非鱼免疫血清特异性抗体检测显得尤为重要。

无乳链球菌细胞壁多糖类Ｃ物质属于Lancefield抗原结构分类中的B群，所以又称为B群链球菌（group B Streptococcus,GBS）。B群链球菌表面免疫相关蛋白（surface immunogenic protein,SIP）是位于B群链球菌表面的一种蛋白。Maione等(1992)用多菌株基因组分析的方法，从589个编码表面蛋白的基因中筛选出具有免疫保护作用的表面蛋白基因，其中sip基因被证实是具有保守性的４大编码Ｂ群链球菌的表面蛋白基因之一，SIP蛋白是应用于疫苗制备和病原检测的优选蛋白。

本发明制备了罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体、罗非鱼无乳链球菌表面免疫相关蛋白SIP（surface immunogenic protein）的融合蛋白、HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体，并组装完成罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，可应用于罗非鱼无乳链球菌病疫苗免疫效果评价、免疫应答水平监测，以及罗非鱼无乳链球菌病的快速诊断。同时，制备的罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体可应用于罗非鱼免疫球蛋白（IgM）的结构分与功能分析、免疫应答模式研究等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，可应用于罗非鱼无乳链球菌病疫苗免疫效果评价、免疫应答水平监测，以及罗非鱼无乳链球菌病的快速诊断。同时，制备的罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体可应用于罗非鱼免疫球蛋白（IgM）的结构分与功能分析、免疫应答模式研究等。

针对罗非鱼IgM产生单克隆抗体的单克隆抗体细胞株2H5/B5已于2012年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学校内，其保藏号为CCTCC NO:C201277。

由保藏号为CCTCC NO:C201277的罗非鱼IgM单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体2H5/B5。

为解决上述技术问题，本发明采取了如下技术方案：

一种罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，包括所述的单克隆抗体的酶标板、罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白、以及HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。

包括以下步骤：

（1）罗非鱼IgM的制备与纯化：采集健康罗非鱼血清，用IgM纯化试剂盒纯化，分离获得罗非鱼血清中的IgM；

（2）罗非鱼IgM单克隆抗体的制备：纯化后的罗非鱼IgM作为抗原腹腔注射免疫Balb/C小鼠，利用杂交瘤筛选技术，制备罗非鱼IgM单克隆抗体2H5/B5；

（3）罗非鱼无乳链球菌表面免疫相关蛋白SIP（surface immunogenic protein）融合蛋白的制备：根据罗非鱼无乳链球菌SIP蛋白全长基因，序列编号GB00051，设计引物，PCR扩增获取与GeneBank上公布的sip基因序列DQ914264、AF151357同源性达99.0%以上的序列；构建重组表达质粒SIP-pET32a（+），然后将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中，0.5mM IPTG 诱导重组蛋白表达，经纯化后获得无乳链球菌SIP融合蛋白；

（4）HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体的制备：SIP融合蛋白为抗原，浓度为200 mg/L，于四肢肌肉、皮下多点注射免疫新西兰兔，4次免疫后，于第7 d采用颈动脉放血，收集血液于5000 r/min离心10 min，获取SIP融合蛋白兔多克隆抗体血清；兔多克隆抗体血清经饱和硫酸铵沉淀后，HiTrap MabSelect SuRe亲和柱分离纯化，凝胶过滤层析脱盐处理后冻干备用；使用高碘酸纳氧化的HRP偶联兔抗SIP蛋白多克隆抗体，乙醇胺还原偶联物并淬灭活化的HRP，通过亲和层析去除未反应的酶，分子排阻层析分离偶联物（兔抗SIP IgG-HRP），冻干后用1 mL含50%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解。

（5）阳性对照与阴性对照：阳性对照为灭活无乳链球菌注射免疫罗非鱼7d后，分离纯化的罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体蛋白；阴性对照为健康罗非鱼血清IgM。

（6）试剂盒的组装：将步骤（2）的罗非鱼特异性IgM单克隆抗体2H5/B5包被固体载体、步骤（3）的SIP融合蛋白、步骤（4）的HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照组装成ELISA试剂盒。

单克隆抗体2H5/B5在制备罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒中的应用。

罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒在检测罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体和罗非鱼无乳链球菌疾病中的应用。

本发明制备的罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体效价高，可应用于罗非鱼免疫球蛋白（IgM）的结构分与功能分析、免疫应答模式研究等。

本发明的优点在于：本发明组装的罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，检测灵敏度高，特异性强，可应用于罗非鱼无乳链球菌病疫苗免疫效果评价、免疫应答水平监测，以及罗非鱼无乳链球菌病的快速诊断。

附图说明

图1.罗非鱼IgM抗体分离纯化（泳道1：蛋白 marker；泳道2：20%PEG 6000；泳道3：HiPrep 16/10 Sephacryl S-200 HR洗脱液；泳道4：Hitrap IgM Purification 洗脱液）。

图2.兔抗SIP多克隆抗体的分离纯化（泳道1：蛋白 marker；泳道2：洗脱液; 泳道3：纯化蛋白样品）。

图3. 实施例子4的临床样本检测结果图。

具体实施方式

实施例1

保藏号为CCTCC NO:C201277的罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株2H5/B5的制备

1.罗非鱼血清制备

健康罗非鱼心脏采血，5000 r/min离心10 min，取上清即为罗非鱼血清。

2.IgM分离纯化

罗非鱼血清经20% PEG 6000沉淀后，HiPrep 16/10 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析，收集第一个峰的组分，Hitrap IgM Purification精细纯化，SDS-PAGE电泳分析纯化样品。纯化后获得较纯的IgM，SDS-PAGE可见75kD和25kD的条带，如附图1。

3.Balb/c小鼠的免疫

8周龄的Balb/c雌性小鼠5只（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司），将纯化的罗非鱼IgM与等体积弗氏完全佐剂乳化后，以0.2 mL／只腹腔注射免疫小鼠，一免后于第14 d，28 d，35 d分别用罗非鱼IgM与等体积弗氏不完全佐剂乳化后再次加强免疫,四免后尾部采血，检测鼠血清效价。

4.罗非鱼IgM杂交瘤细胞株的建立和McAb制备

当免疫小鼠血清效价达到1.0×10^-5后，取脾细胞进行细胞融合，筛选阳性细胞孔，进行单细胞克隆化，建立、保存单克隆抗体杂交瘤细胞株，并制备单克隆抗体细胞株小鼠腹水。

在罗非鱼IgM McAb杂交瘤细胞株系的建立过程共进行5次细胞融合，融合率均达55.8％以上。检测到阳性杂交瘤细胞孔后，对细胞孔中的细胞进行3次以上的单克隆化，获得能稳定分泌McAb的阳性细胞株，命名为：2H5/B5。

5.罗非鱼IgM McAb效价及细胞株亚类测定

McAb的效价测定按间接ELISA法进行，酶标板包被罗非鱼IgM（20μg/mL）；BSA蛋白封闭，检测小鼠腹水或细胞培养上清液，分别设阳性对照（免疫小鼠多抗血清）和阴性对照（Sp2/0细胞培养上清）液，37℃、孵育1 h，PBST洗涤液洗涤三次；加HRP标记抗鼠二抗， 37℃、孵育1 h，PBST洗涤液洗涤三次；加底物液（TMB），室温避光显色10～20 min；加终止液(浓硫酸)，静置10 min；用酶标仪检测450nm的OD值；空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍为阳性。

罗非鱼IgM McAb细胞株Ig亚类鉴定参照Ig亚类鉴定试剂盒步骤进行。

罗非鱼IgM McAb细胞株2H5/B5亚型与效价测定结果如表1：

表1 McAb亚型及效价测定

实施例2

罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒

1.罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒的组成

将罗非鱼IgM单克隆抗体2H5/B5包被酶标板、SIP融合蛋白、HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照组装成ELISA试剂盒。

（1）酶标板包被罗非鱼IgM单克隆抗体蛋白

将罗非鱼IgM McAb用磷酸缓冲液PBS（pH7.2）稀释至浓度为20μg/mL，加入 96 孔酶标板反应孔中，每孔100 μL，4℃包被过夜；磷酸缓冲液PBS（pH7.2）+0.1wt.%吐温-20（PBST）洗涤，每次 2 min，洗三次；每个反应孔加入 120 μL用PBS配制的5%牛血清白蛋白，37℃封闭3 h；PBST 洗涤，每次 2 min，洗三次，于-20℃保存备用。

（2）SIP融合蛋白

sip基因PCR扩增引物设计：根据Genbank报道的罗非鱼无乳链球菌SIP蛋白全长基因序列（GB00051）设计引物。上游引物：5’-GC CCA GAT CTG ATG AAA ATG AAT AAA AAG GTA CTA TTG-3’，在5’端加入Bgl II酶切位点(见下划线)；下游引物：5’-CG GGA AGC TTA TTA TTT GTT AAA TGA TAC GTG AAC A-3’，在5’端加入Hind Ⅲ酶切位点(见下划线)和终止密码子TAA。

sip基因的扩增与测序：PCR扩增的sip基因产物片段在1%的琼脂糖凝胶中电泳分析，根据相对分子质量marker标示，扩增得到的DNA条带约1300 bp，大小与预计相符，该片段测序后，与GeneBank上公布的sip基因序列DQ914264、AF151357同源性达99.0%以上。

SIP-pET32a（+）表达载体的构建：将PCR扩增的sip基因产物片段回收纯化，与原核表达载体pET32a经Bgl II和HindⅢ双酶切后用T₄ DNA连接酶进行连接，反应产物转化BL21（DE3）菌株，含氨苄青霉素固体培养基蓝白斑筛选阳性重组子。

SIP原核表达工程菌的培养和诱导：在含有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基中，37℃振荡培养至600 nm吸光度值A₆₀₀0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，诱导培养4～6 h后，离心收集菌体。

SIP融合蛋白的纯化：菌体经超声裂解破碎，高速离心后收集上清，用于金属鳌合层析。

SIP融合蛋白SDS-PAGE分析：90V恒压电泳2h，柯达凝胶成像分析系统扫描记录结果。经SDS-PAGE分析，SIP融合蛋白在大肠杆菌中已实现了表达，并经金属鳌合层析柱分离纯化，表达产物相对分子质量约为66 kD，与预期的相符。

（3）HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体

兔抗SIP融合蛋白多克隆抗体血清制备：调整SIP蛋白浓度为200 mg/L，加等体积弗氏完全佐剂乳化，取0.5 mL于四肢腋下肌肉、皮下多点注射免疫，14 d后耳静脉同量追加免疫，而后每间隔7 d耳静脉同法免疫1次，自第二次起，SIP蛋白使用等体积弗氏不完全佐剂乳化。第4次免疫后7 d由耳静脉采血0.5 mL，检测血清效价，效价达到要求后，采用颈动脉放血，5000 r/min离心10 min，取上清，-20℃分装保存备用。

血清性质鉴定：采用间接ELISA法， 20 mg/L的SIP融合蛋白包被酶标板，加入稀释成不同浓度（1∶10⁰、1∶10¹、1∶10²、1∶10³、1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶）的兔抗血清，37℃孵育后加羊抗兔IgG-HRP，H₂SO₄终止反应后，测定结果。

经间接ELISA检测分析，兔抗SIP蛋白多克隆抗体的效价为1∶10⁶。

多克隆抗体的纯化：兔血清经饱和硫酸铵沉淀后，HiTrap MabSelect SuRe亲和柱分离纯化多克隆抗体，凝胶过滤层析脱盐处理后冻干备用。

SDS-PAGE电泳分析SIP兔多克隆抗体分子量及纯度（如附图2），仅有两条约50 kD和25 kD的条带，结果表明，SIP兔多克隆抗体经分离纯化获得较纯的IgG。

兔抗SIP蛋白多克隆抗体HRP标记物的制备：使用高碘酸纳氧化的HRP偶联兔抗SIP蛋白多克隆抗体，乙醇胺还原偶联物并淬灭活化的HRP，通过亲和层析去除未反应的酶，分子排阻层析分离偶联物（兔抗SIP IgG-HRP），冻干后用1 mL含50wt.%甘油的PBS溶解，间接ELISA方法测酶标抗体的效价。调整SIP融合蛋白浓度为100 mg/L，倍比稀释后，包被酶标板，经1wt.% BSA封闭后，加入最适浓度的酶标抗体检测抗体的检测灵敏度。

经间接ELISA检测分析，经HRP酶标记的兔抗SIP蛋白多克隆抗体效价为1：10⁴（表2），检测灵敏度为3.125 mg/L。

表2 兔抗SIP蛋白多克隆抗体HRP标记物效价测定

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性

（4）抗体稀释液

磷酸缓冲液（pH7.2）（PBS）：72mL的0.2M Na₂HPO₄与28mL的0.2M NaH₂PO₄混和后使用。

（5）洗涤液

1000 mL磷酸缓冲液PBS（pH7.2）加入1 mL吐温-20,混匀后使用（PBST）。

（6）显色液

底物显色A液：醋酸钠13.6 g,柠檬酸1.6 g,30%双氧水0.3 mL,蒸馏水加至500 mL；底物显色B液:乙二胺四乙酸二钠0.2 g,柠檬酸0.95 g,甘油 50 mL,取0.15 g四甲基联苯胺（TMB）溶于3 mLDMSO中,蒸馏水加至500 mL，取等量AB液混匀后使用，注意避光保存。

（7）终止液

浓硫酸（96%）22.2 mL，蒸馏水177.8 mL，混匀后使用。

（8）阳性对照

灭活的无乳链球菌注射免疫健康罗非鱼7d后，心脏采血，5000 r/min,离心10 min,获得罗非鱼无乳链球菌特异性血清，利用IgM纯化试剂盒纯化，获罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体。

（9）阴性对照

健康罗非鱼，心脏采血，5000 r/min,离心10 min,获得正常罗非鱼血清，利用IgM纯化试剂盒纯化，获正常罗非鱼IgM。

2.罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒的使用方法

（1）加样：将待测罗非鱼血清样本用抗体稀释液稀释后，加入96 孔酶标板反应孔中，每孔100 uL，37℃孵育 1 h；

（2）阳性对照和阴性对照：用抗体稀释液把阳性对照样品和阴性对照样品稀释100倍，各加入1孔，每孔加入100 uL，37℃孵育 1 h；。

（3）洗涤：洗涤液洗涤，每次 2 min，洗3次；

（4）加SIP融合蛋白：用抗体稀释液把SIP融合蛋白稀释100倍后，每个反应孔加入100 uL（约50ng/孔），37℃孵育 1h；

（5）洗涤：洗涤液洗涤，每次 2 min，洗3次；

（6）加兔抗SIP IgG-HRP：用抗体稀释液把兔抗SIP IgG-HRP稀释1000倍，每个反应孔加入100 uL，37℃孵育 1h；

（7）洗涤：洗涤液洗涤，每次 2 min，洗3次；

（8）加显色液：每个反应孔加入显色液100 uL，室温下反应 5～10 min；

（9）加终止液：每反应孔加入终止液50 uL,室温下反应1 min；

（10）测OD ₄₅₀ 值：于酶标仪中测定吸光度 OD₄₅₀值。

（11）结果判断：阳性结果/阴性结果≥2.1时，计算待检样品与阴性对照光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1 时判为阳性结果，当P/N≤2.1 时判为阴性结果。

实施例3

罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒灵敏度和特异性测定

1.灵敏度测定

将1000 ng罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体样品，倍比稀释成系列梯度，应用罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒测定，分析其对罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体的检测灵敏度。

罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒对罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体的灵敏度检测结果如表3，灵敏度为16.12 ng。

表3. 试剂盒对罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体灵敏度测定

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

2.特异性测定

无乳链球菌菌株070717LL、TL60829NA，海豚链球菌菌株ATCC29178、TNH-32，嗜水气单胞菌Js703022NA,温和气单胞菌Fp60325NA，豚鼠气单胞菌AB40511NA，迟缓爱德华氏菌AL60306NA1，鳗弧菌SMW5，副溶血弧菌VP89培养至对数生长期，收集菌体，调整菌液浓度1×10⁸CFU/mL，1wt.%甲醛溶液灭活24h，5000 r/min,离心10 min，重复3次，超声波破碎菌体后腹腔注射免疫健康罗非鱼，7d后采集各种菌受免罗非鱼IgM抗体血清，应用罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒检测，测定其特异性。

10株水产病原菌免疫罗非鱼后，采集受免罗非鱼IgM抗体血清，检测结果如表4，仅有无乳链球菌菌株070717LL、TL60829NA免疫的罗非鱼特异性IgM抗体血清为阳性，其它8株病原菌免疫的罗非鱼IgM抗体血清检测结果为阴性，说明该试剂盒对罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体检测特异性强。

表4. 试剂盒对10株水产病原菌免疫的罗非鱼IgM抗体特异性测定

实施例4

罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒的应用

1.罗非鱼无乳链球菌SIP疫苗罗非鱼免疫方案

取210只重约50 g的健康新吉富罗非鱼，分3组，每组70只，暂养1 W后，于1 d（0W）、21 d（3W）、56 d（8W）、91 d（13W）分4次投喂罗非鱼无乳链球菌SIP疫苗饲料，对照组与实验组非免疫时期均投喂罗非鱼基础饲料，将罗非鱼无乳链球菌SIP疫苗饲料和基础饲料按鱼重量5%的量投喂。各实验组按表5的免疫方案（包括阴性对照组）分别进行免疫。

各组罗非鱼于每次免疫后20 d，即一免后第20 d、41 d、76 d、111 d均随机取各组5只罗非鱼的血清进行特异性IgM抗体效价分析，应用罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒检测。

表5 罗非鱼无乳链球菌SIP疫苗免疫方案

2.罗非鱼无乳链球菌SIP疫苗免疫罗非鱼特异性IgM抗体检测

罗非鱼于每次免疫后20 d，应用罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒检测各组罗非鱼4次免疫后的血清特异性抗体效价情况，如附图3所示：阴性对照组罗非鱼血清效价均小于1:25；第二组罗非鱼于首免后第20d检测到血清效价为1:100，二免疫升高至1:200，三免与四免后效价均达最大值1:400；第三组罗非鱼于首免后第20d检测到血清效价为1:200，二免和三免后升高至1:800，四免后效价均达最大值1:1600。第二组与第三组免疫血清效价差异显著（p＜0.05）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省淡水水产研究所

<120> 罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcccagatct gatgaaaatg aataaaaagg tactattg 38

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgggaagctt attatttgtt aaatgatacg tgaaca 36

Claims

1.一种针对罗非鱼IgM产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述细胞株为单克隆抗体细胞株2H5/B5，已于2012年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:C201277。

2.一种罗非鱼无乳链球菌IgM单克隆抗体，其特征在于：所述抗体是由保藏号为CCTCC NO:C201277的针对罗非鱼IgM的单克隆抗体细胞株2H5/B5分泌产生的单克隆抗体2H5/B5。

3.一种如权利要求2所述的一种罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，其特征在于：包括所述的单克隆抗体的酶标板、罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白、以及HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的一种罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，其特征在于包括以下步骤：

（2）罗非鱼IgM单克隆抗体的制备：纯化后的罗非鱼IgM作为抗原腹腔注射免疫Balb/C小鼠，利用杂交瘤技术，制备罗非鱼IgM单克隆抗体2H5/B5；

（3）罗非鱼无乳链球菌表面免疫相关蛋白SIP融合蛋白制备：根据罗非鱼无乳链球菌SIP蛋白全长基因序列，序列编号GB00051，为设计引物，PCR扩增获取与GeneBank上公布的sip基因序列DQ914264、AF151357同源性达99.0%以上的DNA序列；构建重组表达质粒SIP-pET32a（+），将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中，0.5mM IPTG 诱导融合蛋白表达，经纯化后获得原核表达的无乳链球菌SIP融合蛋白；

（4）HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体的制备：以SIP融合蛋白为抗原，浓度为200 mg/L，于四肢肌肉、皮下多点注射免疫新西兰兔，4次免疫后，于第7 d采用颈动脉放血，收集血液于5000 r/min离心10 min，获取SIP融合蛋白兔多克隆抗体血清；兔多克隆抗体血清经饱和硫酸铵沉淀后，HiTrap MabSelect SuRe亲和柱分离纯化，凝胶过滤层析脱盐处理后冻干备用；使用高碘酸纳氧化的HRP偶联兔抗SIP蛋白多克隆抗体，乙醇胺还原偶联物并淬灭活化的HRP，通过亲和层析去除未反应的酶，分子排阻层析分离偶联物，冻干后用1 mL含50wt.%甘油的磷酸盐缓冲液溶解；

（5）阳性对照与阴性对照：阳性对照为灭活无乳链球菌注射免疫罗非鱼7d后，分离纯化的罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体；阴性对照为健康罗非鱼血清IgM；

（6）试剂盒的组装：将步骤（2）的罗非鱼特异性IgM单克隆抗体2H5/B5包被酶标板、步骤（3）的SIP融合蛋白、步骤（4）的HRP酶标记SIP融合蛋白兔多克隆抗体、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照组装成捕获ELISA试剂盒。

5.根据权利要求3所述的一种罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒，其特征在于：抗体稀释液为pH7.2磷酸缓冲液：72mL的0.2M Na₂HPO₄与28mL的0.2M NaH₂PO₄混和后使用；洗涤液为1000 mL、pH7.2磷酸缓冲液PBS加入1 mL吐温-20,混匀后使用；显色液为底物显色A液：醋酸钠13.6 g,柠檬酸1.6 g,30%双氧水0.3 mL,蒸馏水加至500 mL；底物显色B液:乙二胺四乙酸二钠0.2 g,柠檬酸0.95 g,甘油 50 mL,取0.15 g四甲基联苯胺（TMB）溶于3 mLDMSO中,蒸馏水加至500 mL，取等量AB液混匀后使用；终止液为96wt.%浓硫酸22.2 mL，蒸馏水177.8 mL，混匀后使用。

6.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒中的应用。

7.一种如权利要求3所述的罗非鱼无乳链球菌IgM抗体捕获ELISA检测试剂盒在检测罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体和罗非鱼无乳链球菌疾病中的应用。