CN108414762B

CN108414762B - 一种草鱼IgM单克隆抗体、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN108414762B
Application number: CN201810031357.4A
Authority: CN
Inventors: 李中圣; 张�杰; 伍建敏; 赵玉林; 王凤求; 王贵平
Original assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Current assignee: Guangdong Haid Animal Husbandry And Veterinary Research Institute Co ltd
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2038-01-12
Also published as: CN108414762A

Abstract

本发明公开了一种草鱼IgM单克隆抗体、其制备方法及其应用；草鱼IgM单克隆抗体由保藏号为C2017130的杂交瘤细胞株产生；草鱼IgM单克隆抗体的应用为将草鱼IgM单克隆抗体应用于检测鱼类Ig水平的试剂或试剂盒的制备、应用于治疗鱼类病毒感染的药物的制备、应用于评价鱼类疫苗免疫效果的试剂的制备、在鱼类免疫功能评价方面的应用；还提供了杂交瘤细胞株；草鱼IgM单克隆抗体可以提高血清抗体检测过程的灵敏度，具有良好的应用前景。

Description

一种草鱼IgM单克隆抗体、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种草鱼IgM单克隆抗体、其制备方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

真骨鱼血清中免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)主要以四聚体IgM的形式存在。IgM分子量约100KDa,其中重链大小为75KDa,轻链大小为25KDa。在IgM抗体制备中，利用商品化Protein A/G亲和层析时，Protein A/G对IgM的结合效率较低，较难纯化出IgM，因此有必要以人工的方式获得IgM单克隆抗体。而以鱼类的IgM单克隆抗体为基础，通过分析可以评价鱼类的免疫功能、利用鱼类血液、免疫器官和组织中抗体水平变化规律来评价疫苗免疫效果的方法、对于治疗药物的效果研究等。此外，针对目前市场针对鱼类血清抗体的检测，现有的检测法是以病毒重组蛋白作为固相包被物、以HRP标记的IgM抗体作为检测抗体建立的间接ELISA检测法，应用这一方法反复测试发现，ELISA检测P/N值较小，对样品检测的分辨率较低。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种草鱼(Ctenopharyngodon idellus)IgM单克隆抗体，分类命名为杂交瘤细胞Carp IgM单抗，可以提高血清抗体检测过程的灵敏度。

本发明的第二个目的在于提供上述草鱼IgM单克隆抗体的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种草鱼IgM单克隆抗体的应用

本发明的第四个目的在于提供一种杂交瘤细胞株。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种草鱼IgM单克隆抗体，所述草鱼IgM单克隆抗体由杂交瘤细胞株产生；杂交瘤细胞株由中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为：中国武汉大学，保藏日期为：2017年8月18日，保藏号为CCTCC NO:C2017130。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种草鱼IgM单克隆抗体的制备方法，包括：

培养步骤：培养保藏号为CCTCC NO:C2017130的杂交瘤细胞株，使之分泌单克隆抗体；

纯化步骤：将单克隆抗体纯化。

实现本发明的第三个目的可以通过采取至少一个如下技术方案的达到：

一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，将草鱼IgM单克隆抗体应用于检测鱼类Ig水平的试剂或试剂盒的制备。

进一步地，所述试剂或试剂盒以草鱼IgM单克隆抗体作为固相包被物，以HRP标记的病毒蛋白作为检测抗原。

一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，将草鱼IgM单克隆抗体应用于治疗鱼类病毒感染的药物的制备。

一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，将草鱼IgM单克隆抗体应用于评价鱼类疫苗免疫效果的试剂的制备。

一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，草鱼IgM单克隆抗体在鱼类免疫功能评价方面的应用。

进一步地，所述免疫功能评价为草鱼对草鱼呼肠孤病毒II型的免疫功能评价或大口黑鲈对大口黑鲈病毒的免疫功能评价。

进一步地，鱼类免疫功能评价包括：

包被步骤：用包被液将草鱼IgM单克隆抗体稀释至浓度为1-3μg/mL，包被聚苯乙烯反应板；包被液为浓度0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液；

封闭步骤：在反应板的反应孔中加入无蛋白封闭液；

样本加入步骤：反应孔中加入稀释的血清样本，再加入洗涤液进行洗涤，拍干；洗涤液为pH为7.4、含0.05vt％Tween-20的PBS溶液；

检测抗原加入步骤：稀释HRP标记的病毒蛋白后加入反应孔，用洗涤液洗涤，拍干；

显色步骤：加入TMB显色液进行避光显色；

终止步骤：加入终止液，读取OD_450nm值；终止液为2mol/L的H₂SO₄溶液。

该方法有别于常规技术中先包被抗原，加入样品后再加入HRP标记单克隆抗体的步骤，以草鱼IgM单克隆抗体结合ELISA检测方法的改进，大大提高检测的灵敏度。

实现本发明的第四个目的可以通过采取至少一个如下技术方案的达到：一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株产生草鱼IgM单克隆抗体，其保藏号为CCTCC NO:C2017130。

本发明中的鱼类包括但不限于草鱼和大口黑鲈(Micropterus salmoides)。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明的草鱼IgM单克隆抗体可以提高血清抗体检测过程的灵敏度；

本发明在草鱼IgM单克隆抗体的应用中，以草鱼IgM单克隆抗体作为固相包被物，以HRP标记的病毒蛋白作为检测抗原，与常规技术中使用HRP标记的IgM单克隆抗体作为检测抗体相反，针对性地设计草鱼IgM单克隆抗体的使用方式，大大提高检测过程的灵敏性。

附图说明

图1为实施例3Western-Blot结果。

杂交瘤细胞株由中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为：中国武汉大学，保藏日期为：2017年8月18日，保藏号为CCTCC NO:C2017130，分类命名为杂交瘤细胞Carp IgM单抗。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

实施例1：杂交瘤细胞株的获得过程：

1)多肽合成与偶联：

以草鱼IgM重链区氨基酸序列ABD76396(序列如SEQ ID NO.1所示)为基础，筛选出3条多肽序列：CIgM-HC1，其序列如SEQ ID NO.2所示；CIgM-HC2，其序列如SEQ ID NO.3所示；CIgM-HC3，其序列如SEQ ID NO.4所示；

根据3条多肽的序列进行人工合成及纯化；人工合成过程中，分别在CIgM-HC2的羧基端、CIgM-HC3的氨基端加一个半胱氨酸(Cys)；在多肽不同位置中加入半胱氨酸是在不影响多肽结构的情况下提供KLH的偶联位点；

以多肽偶联试剂盒对3条多肽分别与载体蛋白KLH偶联。

2)杂交瘤细胞株的获得：

偶联KLH的3条多肽分别免疫Balb/C小鼠，背部皮下注射，150μg/只；每隔15天检测抗体效价；每组选择草鱼IgM抗体效价高的小鼠，取脾脏细胞，与适量的小鼠骨髓瘤细胞进行融合，每只小鼠融合10块96孔板进行克隆筛选实验；

分别用纯化的草鱼IgM包被ELISA板，对融合的细胞上清进行ELISA筛选，挑选阳性克隆扩大到24孔细胞培养内进行培养，每个克隆进行3轮亚克隆，以确保细胞株分泌抗体的稳定性；最终选择1株杂交瘤细胞株CIgM-2E7作为优选细胞；对优选的杂交瘤细胞株CIgM-2E7扩大培养、验证，交由中国典型培养物保藏中心收藏，保藏号为：CCTCC NO:C2017130。

实施例2：草鱼IgM单克隆抗体的获得过程：

将实施例1得到的杂交瘤细胞注射小鼠，收集小鼠腹水，免疫检测验证，利用ProteinA/G对杂交瘤细胞分泌抗体进行纯化，纯化后的单抗为草鱼IgM单克隆抗体(2E7)。

实施例3：草鱼IgM单克隆抗体免疫分析

分别采集草鱼、鲫鱼(Carassius auratus)、罗非鱼(Oreochromis spp)、大口黑鲈、鲤鱼(Cyprinus carpio)和大头鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)全血，分离制备血清，利用饱和硫酸铵沉淀法分别制备6种鱼IgM：配制4.1mol/L硫酸铵溶液，在搅拌的条件下加入等体积、离心处理后的鱼血清中，4℃搅拌6-8h，4℃8000-10000Xg离心10min，弃上清；将沉淀溶于1/2原血清体积的PBS中，4℃、在透析卡中透析12-24h，取溶解透析后的溶液，BCA法分别测定各种鱼IgM浓度。

1)Western-Blot检测：

将6种鱼血清分别20倍稀释，以各稀释液为样品进行SDS-PAGE，以实施例2得到的草鱼IgM单克隆抗体为识别抗体，HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体为二抗进行Western-Blot，结果如图1所示，图1中M：蛋白Ladder；泳道1：草鱼IgM；泳道2：鲫鱼IgM；泳道3：罗非鱼IgM；泳道4：大口黑鲈IgM；泳道5：鲤鱼IgM；泳道6：大头鲢鱼IgM；草鱼IgM单克隆抗体可分别识别草鱼IgM，大口黑鲈IgM。

2)ELISA检测：

将6种鱼血清稀释至0.2μg/mL，分别包被聚苯乙烯板、封闭，分别加入2000、4000和8000倍稀释的实施例2得到的草鱼IgM单克隆抗体，孵育、洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体，孵育、洗涤、显色，在酶标仪中读取检测的OD₄₅₀nm。结果如表格1所示，草鱼IgM单克隆抗体具有对草鱼IgM较高的识别效价，此外，单抗对大口黑鲈IgM同样具有明显的识别作用。

表格1 6种鱼IgM ELISA试验OD₄₅₀nm均值

后续可进行更多鱼类品种的血清进行免疫分析。

实施例4：草鱼呼肠孤病毒II型(GCRV II)血清抗体的检测

1)优化试验：

以草鱼IgM单克隆抗体(2E7)作为固相包被物，以HRP标记的草鱼呼肠孤病毒II(GCRV II)VP7重组蛋白作为检测抗原。

包被步骤：用包被液将草鱼IgM单克隆抗体稀释1.5μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃、1h后，4℃、6-8h；包被液为浓度0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液；

封闭步骤：在反应板的反应孔中加入无蛋白封闭液(Pierce)，100μL/孔，37℃、1h；

样本加入步骤：反应孔中加入不同比例稀释的阳性和阴性血清，100μL/孔，室温、60min；加入洗涤液250μL/孔进行洗涤3次，拍干；洗涤液为pH为7.4、含0.05vt％Tween-20的PBS溶液；

检测抗原加入步骤：HRP标记的GCRV II VP7重组蛋白稀释至2μg/mL后加入反应孔，100μL/孔，室温、30min，加洗涤液250μL/孔进行洗涤3次，拍干；

显色步骤：加入TMB显色液(生工生物工程(上海)股份有限公司)100μL/孔，进行避光显色10min；

终止步骤：加入终止液50μL/孔，10min内在酶标仪上读取OD_450nm值；终止液为2mol/L的H₂SO₄溶液。

2)对比试验：

以草鱼呼肠孤病毒II(GCRV II)VP7重组蛋白作为固相包被物，以HRP标记的草鱼IgM单克隆抗体(2E7)作为检测抗体。

包被步骤：用包被液将GCRV II VP7重组蛋白稀释2μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃、1h后，4℃、6-8h；包被液为浓度0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液；

检测抗原加入步骤：HRP标记的草鱼IgM单克隆抗体稀释至2μg/mL后加入反应孔，100μL/孔，室温、30min，加洗涤液250μL/孔进行洗涤3次，拍干；

结果如表格2和3所示：

表格2 OD_450nm均值的检测结果

表格3 P/N值数据对比

优化试验和对比试验ELISA检测法对标准阴性和阳性血清进行检测，优化试验的方法检测的P/N值最高为15.37，对比试验最高为6.15。在间接ELISA方法建立中，常常要求较高的P/N值，即阳性标准和和阴性标准品的差距较大，在样品检测时具有较高的分辨率。

实施例5：大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)血清抗体的检测

1)优化试验：

以分离培养并纯化的大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)作为固相包被物，以HRP标记的草鱼IgM单克隆抗体(2E7)作为检测抗体。

包被步骤：将LMBV稀释8μg/mL，包被聚苯乙烯反应板，100μL/孔，37℃、1h后，4℃、6-8h；包被液为浓度0.05mol/L、pH为9.6的碳酸盐缓冲液；

样本加入步骤：反应孔中加入不同40倍稀释的阳性和阴性血清，100μL/孔，室温、60min；加入洗涤液250μL/孔进行洗涤3次，拍干；洗涤液为pH为7.4、含0.05vt％Tween-20的PBS溶液；

检测抗原加入步骤：HRP标记的草鱼IgM单克隆抗体稀释至4μg/mL后加入反应孔，100μL/孔，室温、30min，加洗涤液250μL/孔进行洗涤3次，拍干；

判定实验有效的条件：如果(Pm－Nm)≥0.30，同时Nm≤0.15，则实验有效，否则实验失败，应重做。(Pm：LMBV阳性对照OD的平均值；Nm：LMBV阴性对照OD的平均值)

检测样品结果判定：

1)LMBV抗体的阳性或阴性通过计算Cut-off值(COV)进行判定。Cut-off值(COV)的计算：COV＝Nm×2.1(阴性对照孔OD值＜0.08时按0.08计算)

例如：如果阴性对照两孔平均值Nm＝0.11，则COV＝Nm×2.1＝0.11×2.1＝0.231如果阴性对照两孔平均值Nm＝0.07，则COV＝Nm×2.1＝0.08×2.1＝0.168。

2)检测样品LMBV抗体判定标准。

样本OD值≥1.0×COV值时，判定为LMBV抗体阳性(+)。

样本OD值≤1.0×COV值时，样品判定为LMBV抗体阴性(-)。

检测结果如表格4所示：

表格4样品检测OD_450nm均值及判定

根据有效性判断方法，(Pm－Nm)≥0.30，试验结果有效。COV＝0.184，在两个池塘采集样品中，无LMBV发病池塘样本中，1/11个样本为LMBV抗体阳性；LMBV发病池塘样本中，7/11个样本为LMBV抗体阳性。

对池塘鲈鱼血清样本LMBV抗体检测可为病毒感染情况评估、大口黑鲈对大口黑鲈病毒的免疫功能评价提供重要依据。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海大畜牧兽医研究院有限公司

<120> 一种草鱼IgM单克隆抗体、其制备方法及其应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> Ctenopharyngodon idellus

<400> 1

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Pro Ser Pro Pro Lys Ser Ile

1 5 10 15

Phe Ala Leu Ser Gln Cys Ser Ser Asp Ser Glu Phe Leu Thr Ile Gly

20 25 30

Cys Val Ser Arg Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ser Leu Thr Phe Lys Trp

35 40 45

Lys Asp Pro Ala Lys Lys Glu Val Thr Asp Phe Val Gln Tyr Pro Ala

50 55 60

Phe Gly Ser Asp Gly Asp Tyr Thr Lys Ile Ser His Leu Arg Val Lys

65 70 75 80

Lys Ser Asp Trp Asn Phe Gln Lys Pro Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn

85 90 95

Ser Lys Gly Gly Lys Glu Ala Arg Leu Pro Pro Thr Pro Pro Pro Pro

100 105 110

Pro Pro Asp Gln Pro Ala Thr Val Tyr Leu Thr Val Pro Thr Gln Lys

115 120 125

Asp Leu Glu Asn Gly Thr Ala Thr Phe Leu Cys Leu Ala Gln Gln Phe

130 135 140

Ser Pro Lys Lys Tyr Ser Phe Lys Trp Phe Lys Asp Gly His Gln Val

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Thr Tyr Asp Thr Ser Glu Lys Asn Gly Ser Val

165 170 175

Thr Leu Tyr Ser Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ile Ser Ala Glu Glu Trp

180 185 190

Lys Thr Ala Ala Lys Ile Lys Cys Glu Phe Glu His Lys Thr Gly Lys

195 200 205

Glu Val Arg Glu Ala Ala Tyr Thr Asp Asn Asn His Asp Asp Cys Thr

210 215 220

Asn Val Ala Ala Val Ile Val Pro Pro Ser Leu Glu Asp Met Leu Lys

225 230 235 240

Asn Arg Glu Gly Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ala Asn Pro Gly

245 250 255

Phe Thr Lys Ile Glu Ile Lys Ala Asn Asn Phe Val Ile Ala Glu Ala

260 265 270

Ser Glu Ala His Phe Lys Asn Lys Ile Lys Val Glu Leu Glu Ala Pro

275 280 285

Ile Gly Tyr Glu Glu Trp Ser Asn Gly Thr Val Phe Thr Cys Thr Val

290 295 300

Glu His Thr Lys Leu Pro Gln Pro Met Glu Thr Thr Phe Lys Arg Glu

305 310 315 320

Asn Gly Ala Arg Pro Lys Arg Pro Ser Val Tyr Leu Leu Ala Pro Pro

325 330 335

Glu His Lys Glu Gly Glu Thr Met Thr Leu Thr Cys Tyr Val Lys Asp

340 345 350

Phe Tyr Pro Lys Glu Val Phe Val Ser Trp Leu Ala Asp Asp Glu Pro

355 360 365

Val Ile Phe Lys Ser Lys Thr Ser Leu Pro Val Gln Asp Asp Glu Tyr

370 375 380

Phe Ser Val Tyr Ser Gln Ile Thr Val Ser Tyr Ser Glu Trp Lys Ser

385 390 395 400

Gly Ile Val Tyr Ser Cys Val Val Phe His Glu Ser Ile Asp Glu Lys

405 410 415

Met Arg Val Leu Thr Arg Ser Ile Asp Asp His Ile Asp Lys Pro Gly

420 425 430

Val Ile Asn Leu Ser Met Asn Thr Pro Ala Ser Cys Lys Asp

435 440 445

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Cys Glu Ala Ser Asn Ser Lys Gly Gly Lys Glu Ala Arg Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Thr Phe Lys Arg Glu Asn Gly Ala Arg Pro Lys Arg Pro Ser Val

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Ser Ile Asp Asp His Ile Asp Lys Pro Gly Val Ile Asn Leu Ser Met

1 5 10 15

Claims

1.一种草鱼(Ctenopharyngodon idellus)IgM单克隆抗体，其特征在于，所述草鱼IgM单克隆抗体由保藏号为C2017130的杂交瘤细胞株产生；该杂交瘤细胞株的获得过程包括如下步骤：

1)多肽合成与偶联：

以草鱼IgM重链区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础，筛选出3条多肽序列：CIgM-HC1，其序列如SEQ ID NO.2所示；CIgM-HC2，其序列如SE Q ID NO.3所示；CIgM-HC3，其序列如SEQ ID NO.4所示；

以多肽偶联试剂盒对3条多肽分别与载体蛋白KLH偶联；

2)杂交瘤细胞株的获得：

分别用纯化的草鱼IgM包被ELISA板，对融合的细胞上清进行ELISA筛选，挑选阳性克隆扩大到24孔细胞培养内进行培养，每个克隆进行3轮亚克隆，以确保细胞株分泌抗体的稳定性；最终选择1株杂交瘤细胞株CIgM-2E7作为优选细胞；对优选的杂交瘤细胞株CIgM-2E7扩大培养、验证，交由中国典型培养物保藏中心收藏，保藏号为：C2017130。

2.一种草鱼IgM单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括：

培养步骤：培养保藏号为C2017130的杂交瘤细胞株，使之分泌单克隆抗体；

纯化步骤：将单克隆抗体纯化。

3.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体应用于检测鱼类Ig水平的试剂或试剂盒的制备。

4.如权利要求3所述的草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒以草鱼IgM单克隆抗体作为固相包被物，以HRP标记的病毒蛋白作为检测抗原。

5.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体应用于治疗鱼类病毒感染的药物的制备。

6.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，将权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体应用于评价鱼类疫苗免疫效果的试剂的制备。

7.一种草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，权利要求1所述的草鱼IgM单克隆抗体在鱼类免疫功能评价方面的应用。

8.如权利要求7所述的草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，所述免疫功能评价为草鱼对草鱼呼肠孤病毒II型的免疫功能评价或大口黑鲈对大口黑鲈病毒的免疫功能评价。

9.如权利要求7所述的草鱼IgM单克隆抗体的应用，其特征在于，鱼类免疫功能评价包括：

封闭步骤：在反应板的反应孔中加入无蛋白封闭液；

显色步骤：加入TMB显色液进行避光显色；

10.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株产生草鱼IgM单克隆抗体，其保藏号为C2017130。