CN106353502A - 检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒 - Google Patents

检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测人巨细胞病毒IgG和IgM的ELISA试剂盒，包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322‑561蛋白。其中，包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板用于检测HCMV IgG抗体，包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板用于检测人巨细胞病毒IgM抗体。本发明试剂具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，且试剂制作过程简单、标准易于控制。

Description

检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测人巨细胞病毒（HCMV）IgG和IgM抗体的ELISA检测试剂盒。
背景技术
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）可通过口腔、生殖道、胎盘、授乳以及输血或器官移植等多途径传播。人群感染HCMV的显著特点是感染率高，正常成人HCMV抗体阳性率为76.7%－95.8%，我国也是HCMV感染高度流行国家之一。
HCMV初次感染可无明显症状，但病毒从此长期潜伏体内。当机体免疫功能低下时，潜伏病毒开始复制并大量增殖，继发活动性感染并表现多种临床症状。HCMV感染是导致出生缺陷的重要因素之一，并且有研究显示HCMV感染与糖尿病、动脉粥样硬化及一些恶性肿的发病密切相关。临床活动性HCMV感染多见于孕妇，新生儿、输血患者、恶性肿瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制剂的患者。孕妇活动性感染可通过胎盘、产道或授乳传给胎儿，导致流产，死胎，胎儿形态畸形，器官功能障碍。先天感染的新生儿出生时可伴有黄疸、瘀斑、脉络膜视网膜炎、小头畸形等，而无症状的部分新生儿，随着发育才逐渐被发现听觉、视力低下，智力发育迟缓，运动障碍等。在恶性肿瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能减弱或受抑制的患者HCMV的活动性感染常并发间质性肺炎、视网膜炎、食管炎、结肠炎和脑膜脑炎等多器官脏器损害的各种临床综合征，是患者致死或移植术失败的重要原因。无论是初次感染还是潜伏病毒的继发活动性感染，病毒大量复制、出现症状的早期机体会产生IgM型抗体。IgM相对于IgG的特点是产生早、消失快。所以IgM的检出代表近期感染、机体可能尚处于病毒大量复制状态。加之IgM的检测多采用简便快速价格低廉的ELISA方法，所以尽管存在被检出的时间段较短，依然是临床常用的初步判断感染与否的检测方法。而目前检测HCMV IgM的试剂多以HCMV全病毒裂解蛋白作为包被抗原。其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数HCMV IgM抗体检测试剂虽以HCMV的重组蛋白为包被抗原，试剂制作经济简便，但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高。所以研制制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的HCMV IgM抗体检测试剂依然具有实际意义。
检测IgG抗体了解人群感染率，对HCMV相关疾病的预防、管理控制及相关政策的制定具有重要意义。而明确个体HCMV已感染状态则利于临床确定个体治疗方案，如AIDS及器官移植术患者，需要检测HCMV IgG抗体，从而确定是否需要跟踪其IgM抗体水平，以便及时抗HCMV治疗。所以HCMV IgG抗体的检测虽然只能代表曾感染、体内潜伏有HCMV，并非病毒活动性感染的指证，但是仍然具有市场需求。目前市售检测HCMV IgG抗体的试剂多以HCMV全病毒裂解物作为包被抗原，其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数HCMV IgG抗体检测试剂则以HCMV的重组蛋白为包被抗原，这种试剂制作经济简便但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高，而进口的此类试剂价格过高。
综上所述，需要一种制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的HCMV IgG和HCMV IgM抗体检测试剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM的ELISA试剂盒，至少具有特异性、敏感性、稳定性更高的特点。
根据本发明的一个方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM的ELISA试剂盒，包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白（以下简称为HRP-PP65）。
包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板用于检测HCMV IgG抗体，作为优选的技术方案，所述包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是；抗人γ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。
包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板用于检测人巨细胞病毒IgM抗体，作为优选的技术方案，所述包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是；抗人μ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。
作为优选的技术方案，HRP-PP65的制备方法是采用过碘酸钠酶标方法将原核表达并纯化的PP65322-561蛋白与HRP偶联，包括步骤：将辣根过氧化物酶溶于醋酸盐缓冲液，并加入新鲜配制的过碘酸钠混匀，4oC 30 min后加入已二醇，室温混匀放置30 min；加入PP65322-561蛋白，用1.0 mol/L PH 9.5 的PBS 调PH至9.0， 4oC 偶联12~24小时；加入硼氢化钠还原形成稳定的酶结合蛋白，4℃透析过夜去除铵离子。
含HCMV强免疫原性抗原表位的重组蛋白可代替全病毒用于HCMV特异性抗体的检测。HCMV PP65蛋白是HCMV众多结构蛋白中可以特异性激发B 细胞、细胞毒性 T 细胞(CTL)和辅助性 T 细胞( Th) 免疫的主要靶蛋白，不同HCMV病毒株中, HCMV pp65基因高度保守，本发明所用PP65332～561片段是富含T细胞表位和B细胞表位的PP65第322到561位氨基酸序列。PP65蛋白是HCMV被膜磷蛋白而非糖基化蛋白，无需真核表达的糖基化和折叠过程，在原核细胞表达就可获得高免疫活性蛋白片段。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgG抗体的方法，采用了上述试剂盒。
作为优选的技术方案，所述检测人巨细胞病毒IgG抗体的方法包括步骤：
加样：封闭液稀释待测血清，加入到包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板内，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加酶标抗原：封闭液稀释HRP-PP65，加到反应孔中，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液，室温显色；
终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。
本发明对HSV-Ⅰ型、HSV-Ⅱ型以及EBV IgG阳性血清的检测结果均为阴性，证实无交叉反应，排除了非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗体的可能。
本实施例批内变异系数介于2.0%～5.2%，批间变异系数介于3.3%～7.6%，均小于10%，说明检测体系稳定，稳定性和可重复性良好。
本发明与北京贝尔有限公司HCMV-IgG ELISA试剂分别对94份临床疑似HCMV感染血清的检测，均检出45例阳性，阳性率均为47.87%。两种试剂符合率是100%。阳性率显著低于正常人群可能与新生儿样品较多有关。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒IgM抗体的方法，采用了上述试剂盒。
作为优选的技术方案，所述的检测人巨细胞病毒IgM抗体的方法包括步骤：
加样：封闭液稀释待测血清，加入到包被抗人μ链单克隆抗体的酶标板内，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加酶标抗原：封闭液稀释HRP-PP65，加到反应孔中， 37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液，室温显色；
终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。
本发明对HSV-Ⅰ型、EBV IgM阳性血清的检测结果均为阴性，证实本发明与HSV-1型、EBV IgM均无交叉反应，特异性良好。
精密度分析结果显示：批内变异系数为2.1%～5.6%，批间重复性试验的变异系数为2.2%～7.3%，均小于10%，说明检测体系稳定，有较好的可重复性。
本发明与北京贝尔有限公司HCMV-IgM ELISA试剂以及达安公司的QT-PCR检测HCMV核酸试剂分别对94份临床疑似HCMV感染血清的检测结果显示本发明检出40例阳性、贝尔公司试剂检出39例、达安公司试剂检出42例，阳性率分别为42.55%、41.49%和44.68%，经X2检验，自制试剂与两种市售试剂结果均无显著性差异。
本发明利用重组PP65332～561蛋白建立了捕捉法检测HCMV IgG和IgM抗体的ELISA检测方法，并以业界认为敏感性较高的QT-PCR检测试剂和市售IgM、IgG检测试剂为参考，证明试剂具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，且试剂制作过程简单、标准易于控制。上述检测方法仅获得中间结果，该结果与疾病的诊断或健康状况无直接必然联系。对于IgG检测方法，阳性仅能说明曾经感染过，主要用于流行病学调查，以利于疾控部门制定政策参考。对于IgM检测方法，如果是阳性，还需要结合其他必要指标才能确定是否处于感染状态，检测群体IgM阳性率也常用于人群近期感染现状的流行病学调查。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
检测人巨细胞病毒IgG的试剂盒，包括包被鼠抗人γ链单克隆抗体的酶标板和HRP-PP65，以及PBST洗涤液、封闭液、底物显色液和终止液。
其中，包被鼠抗人γ链单克隆抗体的酶标板的制备：
鼠抗人γ链单克隆抗体1:1000稀释，50μL/孔加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗3次，拍干，含1%BSA的PBS封闭液每孔100μl，37℃封闭2h，PBST洗涤液洗3次，拍干。
其中，HRP-PP65的制备：
采用过碘酸钠酶标方法将原核表达并纯化的PP65332～561蛋白与HRP偶联。
①取HRP 5mg溶于0.5mol/L PH 5.6 醋酸盐缓冲液 0.5 ml；加入新鲜配制的0.1mol/L NaIO4 0.25 ml; 混匀，4oC 30 min。
②加入2.5%已二醇0.5 ml，混匀。室温置30 min。
③加入待标记的纯化PP65332～561蛋白5～10 mg，用1.0 mol/L PH 9.5 PBS 调PH至9.0，混匀，4oC 放置12~24小时。
④加入NaHB4 0.1 ml (0.5 mg)，混匀。4oC 2小时后用0.01mol/L PH 7.4 PBS 透析，4oC 过夜。
PBST洗涤液的配方为：0.15M KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g， KCl0.2g，0.05％ Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至40ml；
底物显色液是在临用前由底物液A和底物缓冲液B各一半混合而成。底物液A主要成份是四甲基联苯胺（TMB)：TMB 20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水至100ml；底物缓冲液B主要成份是PH5.0的磷酸柠檬酸：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M 柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至100ml；
终止液主要成份是2M H2SO4：蒸馏水178.3ml，逐滴加入98％的浓硫酸21.7ml；
封板膜为与酶标板的板面大小一致的透明塑料膜。
实施例2
检测人巨细胞病毒IgM的试剂盒，包括包被鼠抗人μ链单克隆抗体的酶标板和HRP-PP65，以及PBST洗涤液、封闭液、底物显色液和终止液。
其中，包被鼠抗人μ链单克隆抗体的酶标板的制备：
鼠抗人μ链单克隆抗体1:1000稀释，50μL/孔加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗3次，拍干，含1%BSA的PBS封闭液每孔100μl，37℃封闭2h，PBST洗涤液洗3次，拍干。
其中，HRP-PP65的制备：
采用过碘酸钠酶标方法将原核表达并纯化的PP65332～561蛋白与HRP偶联。
①取HRP 5mg溶于0.5mol/L PH 5.6 醋酸盐缓冲液 0.5 ml；加入新鲜配制的0.1mol/L NaIO4 0.25 ml; 混匀，4oC 30 min。
②加入2.5%已二醇0.5 ml，混匀。室温置30 min。
③加入待标记的纯化PP65332～561蛋白5～10 mg，用1.0 mol/L PH 9.5 PBS 调PH至9.0，混匀，4oC 放置12~24小时。
④加入NaHB4 0.1 ml (0.5 mg)，混匀。4oC 2小时后用0.01mol/L PH 7.4 PBS 透析，4oC 过夜。
PBST洗涤液的配方为：0.15M KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g， KCl0.2g，0.05％ Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至40ml；
底物显色液是在临用前由底物液A和底物缓冲液B各一半混合而成。底物液A主要成份是四甲基联苯胺（TMB)：TMB 20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水至100ml；底物缓冲液B主要成份是PH5.0的磷酸柠檬酸：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M 柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至100ml；
终止液主要成份是2M H2SO4：蒸馏水178.3ml，逐滴加入98％的浓硫酸21.7ml；
封板膜为与酶标板的板面大小一致的透明塑料膜。
实施例3
人巨细胞病毒IgG抗体的检测方法，该方法采用实施例1提供的试剂盒。
加样：封闭液1:1000稀释待测血清，加入到包被鼠抗人γ链单克隆抗体的酶标板中，每孔50μL，37℃孵育lh，PBST洗涤3次，拍干。
加酶标抗原：封闭液1:1000稀释HRP-PP65，每孔50μL, 37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。
加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，室温显色15～30min。
终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。
实施例4
人巨细胞病毒IgM抗体的检测方法，该方法采用实施例2提供的试剂盒。
加样：封闭液1:1000稀释待测血清，加入到包被鼠抗人μ链单克隆抗体的酶标板中，每孔50μL，37℃孵育lh，PBST洗涤3次，拍干。
加酶标抗原：封闭液1:1000稀释HRP-PP65，每孔50μL, 37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。
加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μL，室温显色15～30min。
终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。

Claims (8)

1.一种检测人巨细胞病毒IgG和IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：包括包被抗人γ链、µ链单克隆抗体的酶标板和辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是：抗人γ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述包被抗人µ链单克隆抗体的酶标板的制备方法是：抗人μ链单克隆抗体稀释后加入酶标板孔中，置4℃12~24小时；弃去孔内液体，PBST洗后拍干，含1%BSA的PBS封闭液37℃封闭，PBST洗涤液洗后拍干。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白的制备方法是采用过碘酸钠酶标方法将原核表达并纯化的PP65322-561蛋白与HRP偶联，包括步骤：将辣根过氧化物酶溶于醋酸盐缓冲液，并加入新鲜配制的过碘酸钠混匀，4oC 30 min后加入已二醇，室温混匀放置30 min；加入PP65322-561蛋白，用1.0 mol/L PH9.5 的PBS 调PH至9.0， 4oC 偶联12~24小时；加入硼氢化钠还原形成稳定的酶结合蛋白，4℃透析过夜去除铵离子。
5.一种人巨细胞病毒IgG的检测方法，其特征在于：采用权利要求2所述的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于包括步骤：
加样：封闭液稀释待测血清，加入到包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板内37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加酶标抗原：封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白，加入到包被抗人γ链单克隆抗体的酶标板，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加底物液显色：于各反应孔中加的TMB底物溶液，室温显色；
终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。
7.一种人巨细胞病毒IgM的检测方法，其特征在于：采用权利要求3所述的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于包括步骤：
加样：封闭液稀释待测血清，加入到包被抗人μ链单克隆抗体的酶标板内37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加酶标抗原：封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的重组PP65322-561蛋白，加入到包被抗人μ链单克隆抗体的酶标板，37℃孵育，PBST洗涤后拍干；
加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液，室温显色；
终止反应：于各反应孔中加入终止液，观察结果，并测OD450。
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