CN104672331A - 一种抗胸苷激酶1抗体的制备方法及其在解脲支原体菌增殖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了解脲支原体胸苷激酶1(Ureaplasma urealyticum thymidine kinase1，UuTK1)抗原设计及其抗体制备方法。本发明提供的UuTK1的抗体及其组合试剂盒，能特异性的识别UuTK1抗原，用于检测解脲支原体的增殖度。本发明提供的抗体试剂盒具有灵敏度高，特异性高，成本低廉等特点，用于检测人泌尿生殖道和和新生儿呼吸道感染疾病人群中解脲支原体增殖速度的应用。

Description

一种抗胸苷激酶1抗体的制备方法及其在解脲支原体菌增殖中的应用

【技术领域】

本发明涉及一种抗体的制备方法及其应用，具体讲涉及一种解脲支原体胸苷激酶1(Ureaplasma urealyticum thymidine kinase1，UuTK1)抗体的制备方法及其在用于检测人泌尿生殖道和呼吸道感染解脲支原体增殖度。

【背景技术】

解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，简称Uu)是从非淋球菌尿道炎(NGU)患者的尿道分泌物中分离的一种没有细胞壁的原核细胞，根据其分解尿素的特性命名为解脲支原体(Uu)，其包括2个生物群，14个血清型。生物1群称为细小脲原体(Ureaplasma parvum，简称Up，含1、3、6、14共4个血清型，而将生物2群继续称为解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum，简称Uu，含血清型2，4，5，7和7至13。目前关于生物1群的1和3血清型，生物2群的4和8血清型与感染和致病性相关性的报导存在争议。

人体泌尿生殖道存在的解脲支原体(UreaplasmaUrealyticum，Uu)大部分为正常菌群，是常见的共生微生物，在健康人(包括婴幼儿)中是同样存在Uu的寄居。发现Uu在孕妇生殖道的寄居率高达50-80％。所以检查出Uu寄居情况，这并不代表感染这种疾病，只有部分解脲支原体亚型感染时才致病。当人的抵抗力下降时，例如体质虚弱，纵欲过度造成性器官长期慢性充血或局部抵抗力下降，解脲支原体侵入机体组织与血液，或粘附于泌尿生殖道上皮细胞后，该部位组织的解脲支原体大量繁殖而出现的炎症和一系列并发症症状，称为“感染”。当泌尿生殖道发生炎症，粘膜表面受损时解脲支原体易从破损口侵入，引起泌尿生殖道感染，但其具有潜伏期，而无临床症状，因此临床检查到Uu阳性，并不能判断是携带还是感染状态。Uu感染后，患者大多无明显症状，很难被患者觉察，也易造成医生漏诊。

目前常规的解脲支原体的检测方法包括：形态学检查、支原体培养、抗原检测、血清学方法和分子生物学方法，例如PCR技术，TDI-FP技术荧光偏振与模板指导的末端延伸反应检测技术，微孔渗漏法，免疫组织化学，其中准确性和重复性好的为传统的病原学检测方法，即取尿道分泌物、阴道分泌物作为支原体培养的，这也是确定Uu感染的金标准。该方法利用Uu分解尿素时产生碱性的NH₃能使酚红指示剂发生由黄变红的特性，但直接将检测标本接种于液体培养基，若液体培养基被标本中的产酸菌污染，Uu产生的碱性物质即被中和，也随之产生假阴性。因此液体培养不能准确判断支原体感染的有无，而且一种液体培养基也不能同时判断两种支原体感染。与液体培养基相比，现提出固体培养基改良方法污染率明显低于液体培养法，但分离阳性率无统计学差异。而分子生物学方法，例如：常规PCR、PCR-SSCP、荧光PCR、TDI-FP(荧光偏振与模板指导的末端延伸反应检测技术)、PCR-系统进化分析法等进行多种支原体的检测，具有快速、特异性强等优势，但荧光PCR法质控要求高，需要相应的实验条件和设备，比较适合大型医院，作为常规检测方法有一定的限制。与培养法检测结果比，现应用的荧光PCR法，无统计学意义。

现有的测定解脲支原体抗体的血清学试验方法，有特异性血清学检测和非特异性血清学检测。特异性血清学检测方法中，最常用的是补体结合试验，另有间接免疫荧光染色检查法、生长抑制试验、代谢抑制试验、间接血凝试验、酶免疫法和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。非特异血清学方法有肺炎支原体冷凝集试验与MG链球菌凝集试验，对支原体肺炎能起辅助诊断的作用。免疫组化法检测Uu抗原等技术也在应用。其缺点是检测特异性抗体IgG的方法尚不能达到早期快速诊断，灵敏度比较低；MB抗原与疾病的关系，以及它在疾病中的作用还有待进一步探讨。

就解脲支原体感染的治疗而言，国内目前主要是抗生素。临床泌尿科、男性科、妇科等多对就诊人员相关样本的分析方法主要是解脲支原体培养及药物敏感试验等检测，无法区分各种亚型的，对显示阳性的患者报告和临床药物敏感试验报告，进行选择并使用抗生素治疗，该模式可能滥用抗生素。一般而言，抗生素药物主要是大环内酯类药物(常用的有红霉素、琥乙红霉素、罗红霉素、阿奇霉素)和喹诺酮类药物(常用的有氧氟沙星、左氧氟沙星)及大观霉素、克林霉素、克拉霉素等治疗生殖道支原体感染，疗程为1-2周。现发现不同病症的患者对不同的抗生素的敏感性和抗药性是不同的，解脲支原体对抗生素的耐药性问题已引起多方注意。滥用抗生素可能是导致解脲支原体耐药的重要因素，其中解脲支原体对四环素的耐药株占10-20.6％，对多西环素的耐药株占8-27.5％，对红霉素的耐药株占10-52.4％。解脲支原体和人型支原体对氧氟沙星的耐药株占近20％。此外，对罗红霉素及阿奇霉素耐药的解脲支原体也有报告。由于解脲支原体对抗生素的耐药性有日渐增加的趋势，有专家主张在治疗解脲支原体感染时，为了减少或防止耐药株的出现，宜采用2-3种不同类型的抗生素联合治疗。同时，还可用中药利尿消炎丸治疗。有许多长期使用抗生素治疗的解脲支原体感染者，解脲支原体检查依然阳性，而且还出现了一些新的不适。原因极为复杂，例如解脲支原体耐药、检测错误或试剂不过关、二重感染(长期应用抗生素者容易出现真菌、其它不敏感细菌感染)。

【发明内容】

为克服现有检测及治疗方式中的局限性，本发明旨在采用靶标蛋白-解脲支原体胸苷激酶1(UuTK1)，一个与解脲支原体增殖直接相关的关键酶来制备因解脲支原体增殖而引发感染的试剂盒，利用该试剂盒可以快速、简便、准确地检测解脲支原体菌增殖并予以治疗。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种UuTK1抗体，该抗体特异性的识别整个UuTK1酶和任何具有UuTK1表位活性的多肽，其中多肽包括具有酶活性/非活性的多肽、单体、2或4聚体TK1酶，或TK1酶与其它分子形成的蛋白复合物或抑制物。

本发明提供了一种UuTK1抗原决定簇多肽，其抗原决定簇多肽为UuTK1的C末端10肽(192-201)，其氨基酸序列为：Arg-His-His-His-Lys-Val-Pro-Asn-Arg-Pro，本发明还提供了一种UuTK1抗原，包括上述的UuTK1抗原决定簇多肽或任何具有表位活性的多肽位抗原及整个UuTK1蛋白，并利用该抗原或抗原决定簇制备UuTK1抗体。

本发明提供了一种制备UuTK1抗体的方法，将UuTK1的C末端活性肽段与KLH交联，免疫母鸡，提取卵黄液体，水萃取制备抗体溶液，用上述的UuTK1的C末端活性肽段制备的亲和层析柱纯化抗体，初筛得抗体。

本发明还提供了一种UuTK1抗体试剂盒，该试剂盒包含UuTK1抗体，其由UuTK1抗体与化学发光检测系统结合制得的。

本发明提供的试剂盒，可以用于检测和监视人泌尿生殖道和新生儿呼吸道感染疾病人群感染解脲支原体的增殖度。

本发明还提供了一种对该试剂盒的检测方法：包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法、ELISA或免疫细胞化学涂片染色方法。

哺乳类细胞DNA的合成有两条途径：一是从头合成途径(denovo synthesis)：是指以磷酸核糖、氨基酸、一碳单元及CO₂等简单物质为原料，经一系列酶促反应，合成核苷酸。除某些细菌外，几乎所有的生物体均可用从头合成途径。另一是补救合成途径(salvagepathway)：即利用体内游离的碱基或核苷，经过简单的反应过程，合成DNA的途径。在补救合成途径中，所需的胸腺嘧啶核苷是必需由胸苷激酶(TK，ATP：thymidine5′-phosphotransferase，EC.2.7.1.21，简称TK)，催化脱氧胸苷为一磷酸胸苷，提供合成DNA的必需前体物之一。细胞中的TK有2种同工酶形式：细胞质胸苷激酶(称为TK1)和线粒体胸苷激酶(称为TK2)。TK1是一种细胞周期依赖酶，与DNA合成和复制紧密相关，所以TK1活性和浓度升高是与细胞的增殖和生长密切相关。在增殖细胞的细胞周期中，TK1浓度在G₁/S交界处开始升高，G₁晚期急剧升高直至S晚期/G₂早期，但在完全分化的细胞中，如静息细胞，心肌细胞等等，TK1酶表达很低或不可检测。由于TK1在增殖细胞的细胞周期中调控的关键作用，也称为S期特殊酶，用于真实的评估异常增细胞的增殖速度。

根据已经公布的解脲支原体(Uu)的特点，Uu系支原体物种，是目前发现的最小、最简单的具有自我繁殖能力的细胞，UuTK1已被克隆和表达并且进行生化特征分析。UuTK1的特征鉴定表明，它具有与人TK1(hTK1)相似的酶动力学特性。但没有发现从头合成途径的基因。因此，这种解脲支原体合成DNA的唯一途径是必须依赖补救合成途径中的必需的关键酶UuTK1，以确保自我繁殖能力。UuTK1将是最好的靶标蛋白用于感染者Uu细胞异常增殖度的真实的评估，抗菌药物筛选和阻断解脲支原体的增殖。

本发明中选择了UuTK1的特别肽段作免疫抗原，解脲支原体胸苷激酶1(UuTK1)蛋白质序列见序列表，并提供一种新型抗解脲支原体胸苷激酶1抗体(UuTK1抗体)的组合试剂盒，用于检测人泌尿生殖道和呼吸道感染解脲支原体增殖度，识别解脲支原体寄居和感染度，用于动态检测和疗效监测，同时提供了一种用于临床的治疗试剂盒。按照感染的器官和部位，取尿道分泌物、阴道分泌物或唾液(如新生儿肺感染)，可采用体液检测和涂片检测，对被检者个体进行定期检测和监控，判断被检者是否处在Uu“寄居”低风险或“感染”高风险情况。因此，本发明给予被检者和体检中心医生的早期信息。如果是UuTK1升高，预警被检者Uu疾病进程的高风险，给医生制定相关的干预治疗方案和给患者治愈的最佳机会。

采用所述方法对适用于人群中Uu疾病筛查，感染患者治疗的监视，预警被检者可能进程为疾病的风险度。筛选UuTK1升高的风险人群，与下列相关的疾病联合评估Uu在体内细胞异常增殖情况，包括：一系列因Uu感染导致的并发症；定期监控相关疾病可能渐变疾病风险进程，UuTK1持续高水平者，预警体内有解脲支原体异常增殖，需进行必须的治疗，患者治疗中，采用UuTK1抗体，进行动态定期监控，观察解脲支原体异常增殖变化与治疗效果。

监测被检者UnTK1水平，需建立健康者个体UuTK1的基础水平和阈值，例如无疾病健康被检者，需取初次第1个月内的样品，分析UuTK1水平，3个月中，进行3次重复检测，将3次的检测结果计算出平均值，得出健康者个体UuTK1的基础水平，无疾病健康被检者一般在低于阈值，以后每年的常检测期间，被检者的UuTK1值与自己UuTK1的基础水平进行比较。

和现有技术比，本发明的优点如下：

(1)本发明所制备的抗体具有纯度高(>99％)、产量高、高特异性无非特异性免疫交叉反应，硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统试剂盒检测的灵敏度在可达到0.1pg；

(2)稳定性好，可于+4-8度条件下保存一年以上且活性稳定，更便于商业运输和保存并能降低试剂的潜在成本；

(3)检测试剂盒适用于人群筛查：按照检测者不同的个体情况和UuTK1水平的变化，建立UuTK1正常者和感染者的阈值，如果阈值小于正常值，预示解脲支原体增殖度在“共居”状态，如果阈值大于正常值，预示解脲支原体的异常增殖，进入“感染”，给个人和医生提供有效参考信息，从而进行合理的保健防范/干预治疗/综合治疗，远避风险，将可能极大提高治愈效果。

【附图说明】

图1为解脲支原体胸苷激酶1(UuTK1)-靠近C端的10肽与人胸苷激酶1(hTK1)-靠近C端的10肽比较，多肽的氨基酸残基序列号为192-201，图示无相同的表位；

图2为抗UuTK1抗的特异性鉴定图，UuTK1质控品与UuTK1抗体的线性反应图(方法详见实施例5)。图示：选择了最佳的抗体浓度和最佳的UuTK1质控品稀释浓度的组合，即最佳抗体浓度为0.125微克/毫升，UuTK1质控品稀释比例为9:3:1，计算最终浓度为0.6，1.8和5.4pg/3μl。图示Opg/3μl为TBS缓冲液配制的BSA作对照。UuTK1质控品与UuTK1抗体的线性反应图的相关性R＝0.999。不加入抗原的BSA蛋白质显示无免疫反应。验证了UuTK1免疫抗原与UuTK1抗体的免疫特异性；

图3为按照实施例7和图2已确认的使用UuTK1质控品和UuTK1抗体的最佳浓度，鉴定UuTK1-IgY抗体是否与健康正常人体液有免疫交叉反应。标本来源于确认无Uu疾病的血清标本，用实施例5和7所述的增强发光免疫点印迹方法检测。18份被检血清。测试一中的样品1，2，3和4，和测试一中的样品10，11，12和13号分别来源于已鉴定的人肿瘤患者血清标本，采用人TK1抗体检测肿瘤患者血清TK1的水平，均高于1.8pg。其余标本均为健康人血清，采用人TK1抗体检测健康人血清TK1的水平，均低于0.6pg。结果显示无Uu疾病的血清标本，与UuTK1抗体反应极为微弱，18个样品的检测范围为0.51-0.03pg，数据均低于0.6pg。指出，UuTK1抗体与人肿瘤患者血清TK1不产生免疫交叉反应。见图示；

图4为不同患者的UuTK1浓度表达的差异与解脲支原体增殖相关度。标本来源于14例女性患者宫颈分泌物。Uu培养法鉴定阳性者(方法详见实施例9)。用实施5和7所述方法检测，14例阳性患者的UuTK1浓度表达明显的差别指出了不同患者宫颈感染以后的Uu细胞处在不同的增殖速度。但UuTK1抗体与人TK1质控品和无Uu疾病人的血清无免疫交叉反应。说明UuTK1抗体是与特异的与Uu细胞中UuTK1有特异的免疫反应，适用于评估Uu感染患的Uu细胞的增殖速度；

图5为不同来源的标本与UuTK1抗体免疫反应。

图6为UuTK1免疫细胞化学涂片染色鉴定患者Uu细胞增殖速度。

【具体实施方式】

用以下实施例对本发明作非限制性的详细描述：

实施例1

已知为四聚体的解脲支原体胸苷激酶1(UuTK1)与hTK1结构相似。单体由4个223氨基酸对称形成，UuTK1的C末端螺旋与相邻单体的一个螺旋相互作用。由于遗传性差异，已鉴定hTK1相关结构仅有30％的序列与Uu-TK是非常相似的，在N和C端的TK1的序列有很大差异。UuTK1的三维空间晶体结构分析，提供了本发明优选活性肽作为免疫抗原的基础。本发明涉及UuTK1抗体是识别整个UuTK1蛋白。本发明提供的抗体特异性的识别的整个UuTK1蛋白和任何具有表位活性的多肽包括：UuTK1蛋白质，具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TK1蛋白，或TK1蛋白质与其它分子形成的蛋白复合物或抑制物。

按照上述抗体特异性是识别的整个UuTK1蛋白和任何具有表位活性的多肽，本发明采用整个UuTK1蛋白质和任何具有表位活性的多肽制备UuTK1抗体，技术原理和方法相同。本发明以TK1多肽作半抗原为实例来说明技术原理和方法。制备TK1多肽作半抗原设计的基本原则是，抗原性识别区域应具有亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点，一般选择暴露的蛋白质表面的C端肽段，该段序列不形成α-helix，避免同源性太强的肽段，但序列中有两个Pro有好处，因这可使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。本专利申请选择UuTK1蛋白在靠近C端的10个氨基酸残基作为半抗原：序列号192-201：RHHHKVPNRP。如图1所示，与相同序列号的人TK1比，UuTK1的10个氨基酸残基无相同的表位。

本发明选择UuTK1蛋白质在靠近C端的96个氨基酸残基作为UuTK1标准质控品，序列号121-216：ISGLD KNFKG EPFGP IAKLF TYADK ITKLT AICNE CGAEA THSLRKIDGK HADYN DDIVK IGCQE FYSAV CRHHH KVPNR PYLNS NSEEF IKFFK N。

实施例2免疫抗原制备

化学合成得到10个氨基酸残基作半抗原和96个氨基酸残基作为UuTK1作标准质控品，经HPLC鉴定纯度大于96％，质谱鉴定质量合格。再将半抗原10肽的C端酰胺化，并在N端连接半胱氨酸(委托中国深圳翰宇公司)

CRHHHKVPNRPYLNSNSEEFIKFFKN-酰胺化

上述优化的半抗原与BSA交联组成10肽-BSA免疫抗原(化学合成委托中国深圳翰宇公司)。

实施例3

用实施2的免疫抗原，按照现有的单/多克隆抗体技术制备UuTK1抗体。实施3是按照母鸡免疫程序和IgY抗体筛选技术，以IgY抗体筛选的技术为实例，制备抗TK1 IgY粗品步骤。详细步骤见专利ZL02134727.1，“抗细胞质胸苷激酶－IgY的制备及肿瘤诊断组合物”中的实施例5，6和7。

用上述10肽-BSA免疫抗原免疫母鸡和制备抗体。利用母鸡免疫的优点在于：

(1)鸡的IgY和人的IgG两者间存在分子遗传差异性；

(2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性；

(3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比，蛋黄中提取的IgY具有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子，即IgY)；

(4)IgY抗体不激活人补体系统，从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的激活；

(5)类风湿因子(RF)与IgY抗体不反应。这种RF是许多免疫测定中非特异反应的主要来源，因为RF与哺乳动物抗体IgG的Fc部分反应，可导致Uu患者和健康人样品的假阳性。

用上述免疫抗原免疫母鸡，提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，纯化所述抗TK1IgY粗品包括下述步骤：

第一步：选择180天龄健康来航母鸡30只，上述10肽-BSA免疫抗原用PBS缓冲液溶解与福氏完全佐剂按1：1混合，注射到产蛋母鸡的胸肌。经每周，共两次免疫后，再用福氏不完全佐剂与免疫抗原混合液加强免疫，四周后每天收集鸡蛋，在4℃下储存；

第二步：免疫母鸡生产出的抗体是否具有高特异性和高灵敏度的初筛，分离每个免疫母鸡的卵黄液。抗体的粗品纯化过程如下：分离蛋黄与蛋白，完整的蛋黃用无离子水洗净后去蛋黄表皮，收集蛋黄液。用10倍体积的蒸馏水稀释蛋黄液，拌搅均匀后调pH值为5.0，4℃下放置过夜。次日取出后调pH值至5.5，通过二次硫酸铵沉淀法，第一次按1000ml溶液加硫酸铵固体351g的比例，第2次按每1000ml加196g硫酸铵的比例，在10℃、4000转/分转速下冷冻离心24分钟。弃去上清液，将沉淀蛋白用1：4的无离子水稀释并用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至8.0。用G25柱脱除硫酸铵后，混合的粗品溶液上制备好的亲和层析柱。

实施例4亲和柱制备

根据免疫抗原类型，选择CNBr-activated Sepharose4Fast Flow为材料与Uu质控品96肽偶合，亲和柱的偶合制备程序参见产品说明(GE Healthcare，UK)。采用实施例3第二步得到的水萃取后得到抗体粗品，经亲和层析纯化得到初筛的UuTK1抗体。纯化抗体：于2-8℃下将混合粗品液加入亲和柱，循环5次，每ml亲和柱第1次过柱速度为0.2-0.25ml/min。循环后用亲和柱平衡溶液冲洗杂蛋白，经过3次以上的重复测试，UV均小于0.010时，停止冲洗；用1.5倍亲和柱体积的Actisep洗脱抗体，再用G25柱洗脱除去Actisep，将收集好的抗体混合，测混合后的UV值；及时调pH至8.0，加入保护试剂，保存抗体于+4-8度冰箱。

实施例5硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)对UuTK1-IgY抗体筛选和鉴定

参照专利ZL201110353971.0，“一种多表位TK1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用”中实施例9：应用TK1-IgY抗体(1)硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法，建立人血清TK1快速检测方法。其程序是：

1)取清晨空腹血样品，于4000rpm，8-10分钟，分离血清。将3微升的生物体液样品(例如血清)精确点样到硝酸纤维素膜(Hyband TMC，GE，UK)上，同时，用不同稀释浓度的UuTK1质控品点样。风干30分钟，用pH为7.5的TBS(20mmol/L Tris，0.15mol/LNaCl)漂洗(2分钟/2次)；

2)加入用TBS缓冲液配置的6％的脫脂奶粉，室温下封闭1小时，除去封闭试剂；

3)加入用TBS配置的最佳稀释浓度的UuTK1抗体，免疫反应1.5小时。反应完成以后，用TBST(TBST中加入0.1％吐温20)迅速漂洗2次，震摇洗涤3次(5分钟/1次)；

4)加生物素化第2抗体，按抗体浓度1mg/ml,最佳浓度稀释为1500倍，室温下震摇反应40分钟。反应毕，同上方法洗涤；

5)加入亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-Horse Radish Peroxidase)。按上方法洗涤后，用ECL发光试剂精确反应1分钟，甩干后，该膜密封于薄膜袋，放入CCD检测仪器，用CCD(Charged Coupled Device)成像系统分析仪捕获信号和扫描定量分析此发光信号的强弱。用此标准曲线计算被检者UuTK1的变化水平，此UuTK1值的水平对应于被检者的解脲支原体的增殖速度。按照此法建立健康人UuTK1标准阈值，如UuTK1的浓度大于正常健康人标准阈值，评估为风险升高值。

依照上述方法检测方法样品：样品1为UuTK1质控品(浓度：0.6，1.8和5.4pg/3微升)。样品2为人TK1质控品(浓度：0.6，1.8和5.4pg/3微升)。样品3为Uu培养法14份阳性反应样品。样品4为4份人TK1高表达的肿瘤患者血清样品(大于1.8pg)。样品5为6份人TK1低表达的健康人血清样品(小于0.6pg)。图示，UuTK1抗体仅仅与UuTK1质控品呈现线性相关的表达，不同Uu感染的患者显示UuTK1的高表达，范围2.1-6.12pg/3微升。UuTK1抗体与人TK1质控品反应极微弱，视为阴性反应。UuTK1抗体与TK1高表达的人肿瘤患者血清样品和TK1低表达的健康人血清样品均反应极微弱，视为阴性反应。

实施例6生物素直接标记UuTK1-IgY抗体

磺酸基琥珀酰亚胺-LC-生物素直接标记UuTK1-IgY抗体(2143试剂盒EZ-Sulfo-NHS-LC-Biotinylation，Pierce，USA)。从-20度冰箱取出的磺酸基琥珀酰亚胺-LC-生物素瓶，按照说明书披露的方法计算，20倍摩尔比的生物素试剂与1倍摩尔的IgG抗体，将1毫克生物素溶解于182微升的超纯无离子水中，取24.1微升加入到用975.9微升的PBS中，配置2毫克纯化UuTK1-IgY抗体。冰浴孵育两小时或在室温下反应30-60分钟。用HABA Assay检测分子数，即刻用脱盐柱清除多余的生物素。

实施例7UuTK1抗体与UuTK1质控品反应最佳反应条件的建立

对制备的抗体是否仅与UuTK1抗原有特异性反应的确认。用实施7所述的增强发光免疫点印迹方法检测和实施8所述的生物素直接标记UuTK1-IgY抗体方法，测试不同浓度UuTK1抗体与抗原反应最佳反应条件。即在固定一过量抗体条件下，配置比例为9：3：1的不同稀释浓度的质控品。得到最佳抗体稀释浓度(0.125微克/毫升)和质控品，稀释比例浓度(5.4，1.8和0.6pg/3μl)，如图2所示。

实施例8UuTK1-IgY抗体的特异性和灵敏度鉴定

对制备的抗体是否与人TK1有免疫交叉反应的确认，用纯化的人重组TK1，其浓度为20，6.6和2pM，用实施例5和7所述的增强发光免疫点印迹方法检测，结果显示无免疫交叉反应。这说明UuTK1-IgY抗体与人TK1没有免疫交叉反应(图4)。

对制备的抗体是否与健康正常人分泌体液有免疫交叉反应的确认，用确认无Uu疾病的健康血清，用实施例5和7所述的增强发光免疫点印迹方法检测，健康者显示极微弱免疫反应或不显示免疫交叉反应。采用这检测方法其检测灵敏度度可达0.1pg水平(图3)。

对制备的抗体是否与人TK1有免疫交叉反应的确认，用已确认为肿瘤患者，检测的其血清TK1的浓度大于2pm(即大于0.6pg/3μl)，用实施例5和7所述的增强发光免疫点印迹方法检测，肿瘤患者同样显示极微弱免疫反应或不显示免疫交叉反应。其检测灵敏度可达0.1pg水平(图3)。

实施例9UuTK1免疫细胞化学涂片染色鉴定患者Uu细胞增殖速度

涂片标本，标本采集：

1)常规消毒外阴后，男性标本用无菌棉拭子插入尿道2-3cm处，旋转360度，停留15s获得细胞后取出；

2)女性标本以阴道窥器扩张阴道后用无菌棉拭子取宫颈获得含细胞的分泌物；

3)唾液标本(如新生儿肺感染)；

4)采用实施例9的培养法得到阳性标本；上述3种方法的到的Uu细胞，涂布于清洁载玻片，过夜风干。

UuTK1免疫细胞化学染色步骤简述如下：为了灭活内源性酶，将切片浸入3％H₂O₂溶液10分钟后，用封闭试剂处理30分钟，加入生物素标记的UuTK1抗体，于在室温下孵育2小时；用PBS溶液清洗切片；加入亲和素-辣根过氧化物酶，并在室温下孵育40分钟；二氨基联苯胺显色并用苏木精对载玻片进行复染色。通过200-400放大倍数显微镜观察和计数每一涂片中的100个细胞的数中有多少细胞显示UuTK1阳性染色，按阳性染色细胞的百分比计算，小于5％UuTK1染色细胞为阴性染色，大于5％UuTK1染色细胞为阳性染色，小于25％染色细胞为低染色，大于25％染色细胞为高染色。适用于评估患者Uu细胞的增殖速度。

实施例10解脲支原体感染的阳性患者的UuTK1的水平变化的检测

按照实施例9的操作方法，得年龄26-60岁的14位女性患者宫颈分泌物标本。将该标本直接接种于液体培养基，常规培养2天，Uu分解尿素产生碱性的NH₃，观察酚红指示剂发生由黄变红的变化，为Uu的阳性标本。将培养细胞离心，800g，5分钟，弃出培养液。收集的细胞用PBS(pH7.4)洗涤一次，再将收集的细胞用0.5ml的PBST(0.1％Tween)，2次溶冻处理，于10000rpm离心，制备萃取上清液溶液。按实施例5和7所述增强发光免疫点印迹方法检测。

将实施例9的培养法得到阳性标本和实施例10的免疫细胞化学涂片染色方法。如图6所示：一感染患者的UuTK1免疫细胞化学涂片染色鉴定图，图6A中，按照实施例全程序，加入UuTK1抗体，在解脲支原体细胞中显示强的UuTK1综色染色，染色度大于50％，但不加入UuTK1抗体，显示阴性染色(放大倍数400x)。证明UuTK1抗体是特异性的与UuTK1免疫反应的抗体。实施例11ELISA方法初检测和筛查高危人群

1)包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性UuTK1抗体至最适浓度(1-10μg/ml)，每凹孔加0.2ml，贮存冰箱4℃过夜，或37℃水浴3小时；

2)洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤TBS缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。加入用TBS缓冲液配置的3％的BSA，室温下封闭1小时，除去封闭试剂；

3)0.2ml的三种不同稀释浓度的UuTK质控品加入凹孔。待检标本来源于清晨空腹血清或分泌液25微升，用缓冲液稀释至0.2ml，加入凹孔，37℃水浴2小时；

4)移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟；

5)加入0.2ml用缓冲液稀释的生物素标记特异性UuTK1抗体溶液，37℃作用1小时。洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟；

5)加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的亲和素-辣根过氧化物酶，37℃作用1小时。洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟；

6)加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用15/30分钟，观察到合适的反应颜色，每凹孔加入0.2ml终止剂2MH₂SO₄。用酶标比色计测定(OPD用492nm)OD值，记录结果。

建立正常健康人UuTK1标准阈值，将此阈值与感染患者的UuTK1比较，计算被检者TK1的变化水平，如被检者UuTK1高于正常健康人UuTK1标准阈值，评估为UuTK1菌的增殖速度风险升高。该方法灵敏度为0.5ng/ml，用于初检测和筛查性病高危人群中。

尽管本申请结合优选实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于上述实施例当中，应该理解，在本发明构思的引导下，本领域技术人员可进行各种修改和改进，这些变更和修改均在申请待批的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种解脲支原体胸苷激酶1(Ureaplasma urealyticum thymidine kinase1，UuTK1)的抗体，其特征在于所述抗体特异性的识别整个UuTK1酶和任何具有UuTK1表位活性的多肽。所述多肽包括具有酶活性/非活性的多肽、单体、2或4聚体TK1酶，或TK1酶与其它分子形成的蛋白复合物或抑制物。

2.一种UuTK1抗原，其特征在于：所述抗原包括UuTK1蛋白或任何具有表位活性的多肽位及整个UuTK1蛋白。

3.如权利要求2所述UuTK1抗原，其特征在于所述UuTK1的抗原决定簇多肽为UuTK1的C末端10肽(192-201)，其氨基酸序列为：Arg-His-His-His-Lys-Val-Pro-Asn-Arg-Pro。

4.一种UuTK1抗体，其特征在于所述抗体包括利用权利要求2或3任一所述UuTK1抗原制备的UuTK1抗体。

5.一种制备如权利要求1或4任一所述的UuTK1抗体的方法，所述方法包括：UuTK1的C末端活性肽段与KLH交联，免疫母鸡，提取卵黄液体，水萃取制备抗体溶液，用所述的UuTK1的C末端活性肽段制备的亲和层析柱纯化抗体，初筛得抗体。

6.一种利用权利要求5所述的UuTK1抗体制备的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含所述UuTK1抗体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由UuTK1抗体与化学发光检测系统结合制得的。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于检测和监视人泌尿生殖道和新生儿呼吸道感染解脲支原体增殖度。

9.一种对权利要求6所述试剂盒的检测方法：所述检测方法包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法、ELISA或免疫细胞化学涂片染色方法。