KR102168417B1

KR102168417B1 - 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102168417B1
Application number: KR1020180173455A
Authority: KR
Inventors: 김학용; 최재원; 조병관; 원민호; 이현주; 김무진; 맹은아
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2020-10-21
Also published as: KR20200082651A

Abstract

본 발명은 디프테리아 독소에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 키트 및 디프테리아 독소 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단일클론항체는 디프테리아균이 분비하는 독소에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 다른 세균이 분비하는 독소나 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 디프테리아 독소 검출을 통한 디프테리아 병증 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단일클론항체는 디프테리아 병증의 치료 예후 관찰, 디프테리아 독소의 검출 또는 정량적 분석 등과 관련된 연구 수행 및 관련 기술개발에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도{Monoclonal antibody with specificity for the toxin of Corynebacterium diphtheriae, hybridoma cell line producing the same and use thereof}

본 발명은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 키트 및 디프테리아 독소 검출 방법에 관한 것이다.

디프테리아는 디프테리아균에 의해 유발되는 급성 호흡기 감염병으로, 대한민국 법정감염병 제2군에 해당하는 질병이다. 디프테리아균은 인체의 모든 점막을 침범할 수 있으며, 침범 부위에 막(membrane)을 형성하는 것이 특징적이다. 디프테리아 발생부위는 주로 인후나 편도와 같은 호흡기 점막이나 피부의 국소지역으로 알려져 있으며, 디프테리아균이 분비하는 독소가 혈류를 통해 신체 각 부위로 전달될 수 있다. 디프테리아는 디프테리아에 걸린 환자나 보균자와의 접촉을 통해 발생할 수 있으며, 주로 환자나 보균자의 호흡기 분비물(객담, 콧물, 기침, 인후 분비물 등)을 통해 전파되는 것으로 알려져 있다. 간혹 피부병변 접촉이나 피부의 상처 및 비생물학적 매개체에 의한 전파가 일어난다고도 알려져 있다.

디프테리아균에 감염되면 2~5일간의 잠복기를 거쳐 발열과 함께 피로, 인후통, 식욕감퇴, 미열 등과 같은 증상이 나타나는 것으로 알려져 있다. 디프테리아는 항독소(antitoxin)나 페니실린(penicillin) 및 에리트로마이신(erythromycin)과 같은 항생제를 투여하고 격리 후 호흡기를 관리하며, 치료 후 디프테리아 균 배양 검사에서 균이 자라지 않는 것을 확인해야 한다. 치료받지 않은 디프테리아 환자의 경우 감염증 발생 후 약 1개월 동안 코, 목, 눈 및 피부의 병변에서 균이 분리될 수 있으며, 일부 만성 보균자는 6개월 이상 균이 검출되기도 한다. 적절한 치료를 받은 경우에는 수 일 이내에 전염성이 없어지는 것으로 알려져 있다. 하지만 적절한 치료시기를 놓치게 되면, 신장(kidney), 심장(heart), 신경계(nervous system) 등에 치명적인 손상을 초래할 수 있으며, 급성 신장괴사(acute tubular necrosis), 심근염(myocarditis), 말초신경병증 및 마비 등의 치명적인 합병증이 발생해 사망에 이를 수 있다. 디프테리아의 경우 세계보건기구에서 보고된 자료에 의하면 약 5~10% 정도의 치사율을 보인다고 알려져 있지만, 디프테리아는 조기 진단을 통해 치료한다면 완치율이 매우 높은 질병이다.

디프테리아는 온대지방이나 열대지방에서 상대적으로 발생률이 높은 것으로 알려져 있으며, 디프테리아 백신이 개발되지 않았던 1980년 이전에는 매년 수십 만 명의 환자가 발생했었다. 하지만 1920년대 개발된 디프테리아 백신이 1940년대 이후 전 세계로 널리 보급됨에 따라 발생률이 현저히 적어지고 있으며, 우리나라의 경우 디프테리아 백신이 보급된 이후 발생률이 현저하게 감소하여 1987년 이후 현재까지 환자가 발생하고 있지 않다. 그러나 카리브해 연안 국가들, 라틴 아메리카, 동유럽, 동남아시아, 아프리카 일부 국가 등과 같이 백신 공급이 원활하지 않은 지역에서는 여전히 풍토병으로 남아있어 지속적으로 환자가 발생하는 것으로 알려져 있다. 의사, 간호사 등과 같이 병원균에 노출이 쉬운 사람들은 성인이 되어서도 지속적으로 디프테리아 백신의 접종이 요구되고 있으며, 최근 지구의 기후변화로 인한 신·변종 병원균의 출현으로 인해 백신으로 예방되지 않는 변종 디프테리아균이 발생할 수 있기 때문에 이에 대한 대비가 필요한 상황이다. 또한 최근 보고된 일부 제약회사의 부도덕한 ‘불량 백신 사례(중국 창춘창성 바이오테크놀로지 및 우한생물제품연구소 사례, 2018년)’로 미루어 볼 때, 언제든 디프테리아 감염 사례가 나타날 수 있는 상황이기 때문에 신속한 진단기술이 요구된다.

디프테리아균에 감염된 환자에서 나타나는 초기 증상이 감기나 몸살로 다른 바이러스 및 세균에 감염되었을 때 나타나는 증상과 매우 유사하기 때문에, 정확한 진단이 어렵다는 단점이 있다. 디프테리아균(C. diphtheriae)은 길이 1~8 ㎛, 폭 0.3~0.8 ㎛인 그람양성균(gram-positive bacteria)으로 막대모양을 띄며, 메틸렌블루(methylene blue) 시약으로 염색을 하게 되면 이염 과립(metachromatic granule)을 관찰할 수 있다.

현재 디프테리아 확진을 위한 대표적인 방법으로는 환자의 병변 부위로부터 디프테리아균을 직접 검출하는 방법이며, Tellurite 배지에서의 배양 및 Elek 면역침강법(Elek immunoprecipitation)과 같은 2가지 방법이 표준 진단방법이다. 디프테리아균은 Loeffler 배지에서 선택적으로 잘 증식하지만, Tellurite 배지상에서는 흑색의 군집(black colony)을 만든다는 특징이 있다. Tellurite 배지는 바이오펩톤(biopeptone), 염화나트륨(sodium chloride), 옥수수전분(corn starch), 헤모글로빈(haemoglobin), 성장보충제(growth supplement), 텔루르산칼륨(potassium tellurite) 등으로 구성되어 있다. 이 중에서도 텔루르산칼륨은 선택적으로 디프테리아균이 정상적인 군집을 형성하는 것을 막고, 디프테리아균이 갖는 독특한 특징으로 인해 텔루르산칼륨이 환원되어 흑색의 군집을 만들게 된다. Elek 면역침강법은 in vitro에서 미생물의 독소생산능(toxigenicity)을 분석할 수 있는 대표적인 방법으로, 한천(agar) 배지 위에서 디프테리아 항독소(antitoxin)가 포함된 테스트 스트립(strip)을 바탕으로 디프테리아 감염 여부를 진단한다. 테스트 스트립 위에는 양성군(독소를 분비하는 디프테리아균), 시험군(디프테리아 의심 환자로부터 분리된 미생물), 음성군(독소를 분비하지 않는 디프테리아균)의 3가지 시료를 서로 다른 줄에 처리를 하게 되며, 이를 이용하여 24시간 배양 후에 얻어진 결과로부터 디프테리아를 진단하게 된다.

이 외에도 디프테리아 진단방법으로는 API® Coryne 방법, MALDI-TOF 질량분석법(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 지노타이핑(genotyping) 등이 있다. 우선 API® Coryne 방법은 당의 발효나 효소 활성도를 확인하기 위한 건조된 기질을 함유하고 있는 20개의 튜브 형태로 되어있는 스트립을 이용한다. 디프테리아균이 배양된 배양접시에서 군집 하나를 취해, 디프테리아균을 재배양한 시료를 희석하여 각각의 튜브에 떨어뜨린 후에 반응을 관찰하게 되며, 20가지 튜브에서 발색반응의 변화를 통해 디프테리아균이 갖는 독특한 당의 발효나 효소활성도를 기준정보(reference)와 비교하여 디프테리아를 진단하게 된다. MALDI-TOF 질량분석법은 단백질 조성(compositions)을 분석할 수 있기 때문에, 디프테리아균을 동정하여 디프테리아균에 존재하는 단백질 분석결과에 대한 기준정보(reference)가 존재하게 된다. 따라서 디프테리아 의심 환자로부터 분리·배양된 미생물의 단백질 분석결과를 기준시료와 대조하여 디프테리아를 진단하게 된다. 중합효소연쇄반응(PCR)의 경우, 디프테리아균이 생성할 수 있는 독소를 암호화하고 있는 유전자(tox gene)에 특이적인 프라이머(primers)를 이용하여 독소 유전자 증폭 후, 독소 유전자 존재 유무의 파악을 통해 디프테리아를 진단할 수 있는 방법이다. 중합효소연쇄반응은 균 배양에 비해 비교적 빠르게 디프테리아를 진단할 수 있다는 장점이 있지만, 디프테리아균 보균자나 실제 독소 단백질을 생성하지 않는 독소 유전자를 갖는 환자를 양성으로 판단할 수 있고, 변이된 독소 유전자를 갖는 디프테리아균의 경우에는 이 방법을 이용하여 진단할 수 없기 때문에, 디프테리아균 배양을 통한 표준검사를 함께 시행해야 한다. 지노타이핑 방법은 세균이 갖는 리보솜RNA(rRNA)의 오페론의 제한 유형(restriction pattern)의 차이를 분석하여 디프테리아균을 확인하거나 디프테리아를 진단하는 방법이다. 즉, 모든 세균은 rRNA를 가지고 있지만 세균의 종마다 그 서열이 다르고, 특정 서열을 기존에 알려진 데이터베이스(database)의 정보와 비교하면 어떤 종의 세균인지를 확인할 수 있다. 그러나 종의 진화 메커니즘의 정보가 없다는 점과 지노타이핑 시험과정이 매우 엄격하기 때문에 다른 방법들에 비해 상대적으로 재현성이 떨어진다는 단점이 있다.

현재 디프테리아 표준 진단법은 적게는 수 일에서 길게는 1주일 이상 걸리는 디프테리아균의 배양을 필수적으로 포함하고 있다. 균을 배양하는데 긴 시간이 소요된다는 것은 디프테리아 의심 환자의 병증이 그 사이에 심화될 수도 있다는 것을 의미한다. 또한 이 과정에서 균을 배양하는 사람은 디프테리아에 걸리지 않은 상태이기 때문에 2차 감염의 위험성이 항상 존재하게 되며, 최종 디프테리아 진단의 경우 양성 및 음성을 판별할 수 있는 숙련된 전문가를 필요로 한다는 단점이 있다. 이 외에 API® Coryne 방법이나 MALDI-TOF 질량분석법(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry)등과 같은 비교적 최신의 방법은 기존 방법에 비해 간단하거나 민감도가 높다는 장점이 있지만, 역시 최소 24시간 이상의 디프테리아균의 배양을 필요로 한다는 단점이 있다. 이 중에서도 특히 MALDI-TOF 질량분석법의 경우 고가의 장비가 필수적이며 분석시료의 전처리 과정이 복잡하다는 단점이 있다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이나 지노타이핑(genotyping)의 경우에는 긴 시간동안 직접 균을 배양하지 않아도 되기 때문에, 24시간 안에 신속한 디프테리균의 검출이 가능하다는 장점이 있지만, 보균자의 경우에는 위양성(false-positive)을 나타낼 수 있으며 변종의 디프테리아균의 경우에는 전혀 검출이 불가능하다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 별도의 디프테리아균의 배양과정 없이 디프테리아균의 검출이나 디프테리아 감염 진단을 위해, 디프테리아 병증을 유발하는 디프테리아 독소에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 본 발명의 단일클론항체를 이용하는 경우 ‘디프테리아 독소-단일클론항체 복합체(항원-항체 복합체)’에 대한 반응 분석으로부터 수 시간 안에 손쉽게 디프테리아균의 검출 및 독소의 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2006-0097526호

따라서 본 발명의 목적은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG_2b 이소타입일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 0.2 내지 20.0 나노몰(nM)의 해리상수로 디프테리아 독소에 결합할 수 있다.

또한 본 발명은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명의 단일클론항체 이외에 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지체는 효소, 발광체, 형광체, 발색체를 포함하며, Q dot(Quantum dot), HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(glucose oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 형광물질(fluorescent material), 방사성 물질 및 색소(dye)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발색기질은 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 디프테리아균 감염이 의심되는 대상의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 뇌척수액 및 소변로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예예 있어서, 상기 항원-항체 반응은 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 웨스턴 블럿(western blotting), 면역 점 블럿 분석법 (immunodot blotting assay), 면역형광측정법(immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(immunochromatography) 및 측방 유동 면역분석법(lateral flow immunoassay, LFA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 디프테리아균이 분비하는 독소에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 다른 세균이 분비하는 독소나 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 디프테리아 독소 검출을 통한 디프테리아 병증 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 디프테리아 병증의 치료 예후 관찰, 디프테리아 독소의 검출 또는 정량적 분석 등과 관련된 연구 수행 및 관련 기술개발에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 단일클론항체를 만들기 위한 항원(antigen)인 디프테리아 독소(diphtheria toxin)를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 수행 후, 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단백질을 염색한 결과 사진이다.
도 2는 디프테리아 독소가 면역화된 마우스 혈액 내에 존재하는 디프테리아 독소에 대한 마우스 체내에 생성된 항체의 역가(titer)를 확인하기 위한 결과 그래프이다.
도 3은 세포 융합을 통해 생성된 96-웰 세포 배양 플레이트(96-well cell culture plate)에 존재하는 디프테리아 독소에 대한 하이브리도마의 반응성 비교 그래프이다.
도 4는 하이브리도마 세포주 4종(JDT1, JDT2, JDT3, JDT6)으로부터 생성되어 순수 분리·정제된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 수행 후, 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단백질을 염색한 결과 사진이다.
도 5는 하이브리도마 세포주 4종(JDT1, JDT2, JDT3, JDT6)으로부터 생성된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체의 이소타입(isotype)을 확인한 결과이다.
도 6은 하이브리도마 세포주 4종(JDT1, JDT2, JDT3, JDT6)으로부터 생성된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체의 해리상수(dissociation constant, K_D)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 하이브리도마 세포주 JDT6로부터 생성된 단일클론항체의 디프테리아 독소 특이도(specificity)를 확인하기 위해, 디프테리아 독소·콜레라 독소·소혈청 알부민에 대한 상기 단일클론항체와의 반응성을 확인한 그래프이다.

본 발명은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 용어 ‘단일클론항체’란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 디프테리아 독소 단백질에 특이적으로 결합하므로, 디프테리아 독소를 인식하는 단백질 분자이다.

본 발명의 용어 ‘하이브리도마 세포’란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다.

본 발명자들은 별도의 디프테리아균의 배양과정 없이 디프테리아균의 검출 또는 디프테리아 감염 진단을 위해, 디프테리아 병증을 유발하는 디프테리아 독소에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 대한 연구를 진행하였고, 그 결과 디프테리아 독소 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 구축하고, 이를 이용하여 디프테리아 독소 특이적 단일클론항체를 생산하였다.

본 발명에서는 총 288종의 하이브리도마 세포주 중 디프테리아 독소와 450 nm에서 흡광도 1.0 이상의 값을 보이는 하이브리도마 세포주 6종을 1차 선별하였으며, 이들 중 생존능을 상실했거나 디프테리아 독소에 대한 반응성이 없는 하이브리도마 세포주를 제외하는 과정을 거쳐, 4종의 하이브리도마 세포주를 2차 선별하였다. 이후, 이들 세포주 각각이 생산하는 단일클론항체의 이소타입 및 해리상수를 측정하였으며, 그 결과 기존에 알려진 독소에 대한 단일클론항체의 이소타입인 IgG₁과 다른 IgG_2b 아형을 가지면서 우수한 결합친화도를 갖는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 최종 선별하였다.

본 발명에 따른 IgG_2b 아형의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 ‘JDT6’로 명명하였고, 이들 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 11월 22일자로 기탁하였으며, 2018년 11월 28일자로 기탁번호 KCTC18747P를 부여받았다.

따라서 본 발명은, 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 디프테라아 독소 검출용 키트; 및 상기 단일클론항체를 이용한 디프테리아 독소 검출방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 디프테리아 독소는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다.

본 발명의 디프테리아 독소 단백질에 대해 특이적인 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 제조될 수 있다(K

hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46. 참조). 단일클론 항체를 분비하는 ‘하이브리도마 세포주’를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 디프테리아 독소 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, 디프테리아 독소 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 웨스턴블럿 분석법으로 선별하고, 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기 생체내 대량배양은 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 고농도의 항체 생산을 유도한 후, 복수액(ascites)에서 분리하는 것을 의미한다.

상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites)에서 분리할 수 있다.

한편, 항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 유용한 점은 단일 에피토프, 즉 항원결정부위를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블럿팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.

상기 단일클론항체의 항원과의 결합 친화성은 통상의 방법에 따라 결정할 수 있으며, 이러한 방법으로는 특별히 제한하지는 않으나, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역측정법(ELISA), 면역침강법, 면역형광법, 색채입자결합법, 화학발광물질결합법, 면역블럿팅을 통해 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다.

본 명세서에서는 디프테리아 독소에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1)및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas A. K. et al., 2017).

항체 분자의 ‘기능적인 단편’이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')₂, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 제한 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 발명의 일구체예에 있어서, 본 발명의 단일클론항체는 IgG_2b 이소타입일 수 있으며, 상기 단일클론항체는 0.2 내지 20.0 나노몰(nM)의 해리상수로 디프테리아 독소에 결합할 수 있다.

또한, 본 발명은 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포를 제공할 수 있다.

상기 하이브리도마 세포주는, 디프테리아 독소 단백질을 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 상기 면역화시킨 마우스의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및 융합된 하이브리도마 세포주에서 디프테리아 독소 단백질에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 하이브리도마 세포주를 통해 생산한 단일클론항체는 디프테리아 독소를 특이적으로 인식함으로, 이러한 단일클론항체는 디프테리아 독소 단백질 또는 디프테리아균의 검출(진단)을 위한 용도로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 디프테리아균 감염 여부를 확인/진단(디프테리아 감염증 진단)할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, ‘진단’은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 상기 디프테리아균 감염 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 단일클론항체를 이용하여 디프테리아 독소의 존재 여부 및 디프테리아균의 감염 여부를 검출할 수 있으며, 또한, 디프테리아균의 감염이 의심되는 생물학적 시료를 대상으로 하여 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 항원-항체 반응은 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 웨스턴 블럿(western blotting), 면역 점 블럿 분석법 (immunodot blotting assay), 면역형광측정법(immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(immunochromatography) 및 측방 유동 면역분석법(lateral flow immunoassay, LFA) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

웨스턴 블럿(Western blot)법은, 생물학적 시료 중에 존재하는 해당 단백질을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 아크릴아미드 겔(gel) 전기 영동 시킨 뒤, PVDF 멤브레인에 전이하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것이다.

면역 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드글라스 상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것에 따라 실시한다.

한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재 여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성 여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 ‘항원-항체 복합체’란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘생물학적 시료’ 또는 ‘시료’는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 뇌척수액 및 소변 등에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 디프테리아 독소 단백질에 특이적인 본 발명의 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 및 디프테리아 독소에 특이적인 다른 종류의 다클론 또는 단일클론항체를 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 상기 항원-항체반응의 분석법의 방법과 동일한 방법으로도 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 검출용(진단용) 조성물은 디프테리아 독소 검출 또는 디프테리아균의 감염증 진단을 위한 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공할 수 있다.

본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 검출(진단)의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

따라서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 독소 검출용 키트 또는 디프테리아균의 감염증 진단을 위한 키트를 제공한다.

상기 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 또한 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 표지체의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 대상물질(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스파타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 3,3',5,5' - 테트라메틸벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인 (fluorescein), 피코빌리프로틴(phycobiliprotein), 로다민(rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(metal sol), 염료졸(dye sol), 미립자 라텍스(particulate latex), 칼라인디케이터(color indicator), 리포좀에 포함된 색재료(color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(horseradish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC(fluorescein isothiocyanate)가, 발광물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(lucigenin)이, 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다.

본 발명의 일구체예에 있어서, 상기 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체접합체, 상기 표지체와 발색반응하는 발색 기질 용액 및 각 반응단계에 사용할 세척액을 추가로 포함할 수 있다.

상기 2차 항체접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, Q dot(Quantum dot), HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(glucose oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 형광물질(fluorescent material), 방사성 물질 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 형광물질로는 플루오르신이소티옥시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 피코빌리프로테인(phycobiliprotein) 등을 사용할 수 있고, 발광물질로는 이소루미놀(isoluminol), 루시제닌(lucigenin) 등을, 방사성 물질로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H 등을 사용할 수 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB(diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbasole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.

상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS(Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS(Phosphate buffered saline), 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20 등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다.

또한 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 검출 방법을 제공할 수 있다.

상기 시료는 디프테리아 독소 여부를 검출하고자 하는 분석 대상 물질로서 디프테리아균 감염이 의심되는 동물이나 환자의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 뇌척수액 및 소변 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 항원-항체 반응은 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 웨스턴 블럿(western blotting), 면역 점 블럿 분석법 (immunodot blotting assay), 면역형광측정법(immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(immunochromatography) 및 측방 유동 면역분석법(lateral flow immunoassay, LFA)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

나아가 본 발명은 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 포함하는 디프테리아균의 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 용어, ‘약학적 조성물’은 유효성분으로서 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 포함하는 조성물로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 등의 다른 화학적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 목적은 생물체에 화합물의 투여를 용이하게 하는데 있다. 여기서, 용어 ‘유효성분’은 생물학적 효과의 원인이 될 수 있는 펩타이드 또는 항체 제제를 말한다. 용어 ‘약학적으로 허용가능한 담체’는 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 이러한 용어에는 보조제가 포함된다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, 인산완충액) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 용어 ‘부형제’는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 전분의 여러가지 당류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 인간 뿐 아니라 디프테리아균이 감염될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 가축의 디프테리아 감염증을 예방 및 치료할 수 있는 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 디프테리아 독소에 특이적인 단일클론항체는 디프테리아 독소에 특이적으로 결합하여 이들의 발현 또는 기능을 억제할 수 있으므로 디프테리아균에 의해 야기되는 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

폴리아크릴아미드 겔 전기영동( Polyacrylamide gel electrophoresis)을 통한 디프테리아 독소의 확인

단일클론항체를 만들기 위한 항원(antigen)으로 사용할 디프테리아 독소(diphtheria toxin)가 높은 순도(purity)로 존재하는지, 알려진 디프테리아 독소의 분자량(molecular weight)인 약 58 킬로달톤(kilodalton, kDa) 부근에 위치하는지를 확인하기 위해 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 염색하고, 탈색용액을 이용하여 탈색반응을 진행한 다음 디프테리아 독소를 확인하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 단백질 사이즈 마커(size marker)와 비교했을 때, 디프테리아 독소는 45 kDa 및 60 kDa 사이에 존재하는 것으로 보아 58 kDa의 분자량을 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 해당 밴드(band) 외에 다른 밴드가 없었기 때문에 순수 분리·정제된 디프테리아 독소임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

효소면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 위한 디프테리아 독소가 코팅된 플레이트 준비

96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(well)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 디프테리아 독소를 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하고 있는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 다음 블로킹(blocking)을 위해 1% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 제조된 96-웰 플레이트(96-well plate)는 건조하고 서늘한 곳에 보관하였다.

< 실시예 3>

마우스 면역화 및 항체 역가 측정

상기 <실시예 1>을 통해 확인된 디프테리아 독소 30 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석시킨 다음, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 섞어주어 에멀젼(emulsion) 형태로 만든 다음 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에는 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 같은 조건으로 2차 면역화를 수행하였다. 2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 디프테리아 독소에 대한 항체가 충분히 생성되었는지 역가(titer)를 측정하였다.

Indirect ELISA 방식으로 마우스 혈액 내 항체의 역가를 측정하였으며, 상기 <실시예 2>로부터 준비된 디프테리아 독소가 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트에 1/10², 1/10³, 1/10⁴의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 HRP(horseradish peroxidase) 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H₂SO₄ 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰(well)에 분주하여 반응을 종결시켰다.

혈액 내에 존재하는 디프테리아 독소에 대한 항체의 역가(디프테리아 독소에 대한 반응성)에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader, Bio-Rad 사 제품)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과 값을 아래 ‘표 1’에 나타냈다. 또한, 마우스의 혈액 희석배수별 반응성 결과 그래프를 ‘도 2’에 나타내었다.

마우스 혈액의 희석비율별 디프테리아 독소에 대한 항체의 역가

디프테리아 독소가 면역화된 마우스 혈액의 희석비율	흡광도 (450 nm)
1/10²	3.522 ± 0.013
1/10³	3.495 ± 0.013
1/10⁴	2.766 ± 0.353
대조군 (PBS 용액)	0.033 ± 0.018

그 결과 상기 표에서 나타낸 바와 같이, 마우스 혈액이 1/10⁴ 만큼 희석된 시료에서의 흡광도(Absorbance at 450 nm, Abs₄₅₀)가 별도의 기준치인 0.500을 훨씬 상회하는 값이 나왔기 때문에, 면역화가 잘 이루어진 것으로 판단하였다. 따라서 최종적으로 디프테리아 독소 30 ㎍을 PBS 용액에 희석하여 별도의 adjuvant 없이 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(booster injection)을 수행하였다.

< 실시예 4>

PEG를 이용한 세포융합

세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(K

hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 <실시예 3>에서 디프테리아 독소가 면역화된 마우스로부터 비장(spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(splenocyte)를 계수하였다. 다음 37℃, 5% CO₂의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크에 있는 마우스 골수종세포(myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 같은 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포가 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500 (polyethylene glycol) 1 ㎖를 처리한 다음, 39 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 천천히 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 첨가하여(107개의 splenocytes 당 10 ㎖ HAT 배지) 세포를 현탁한 다음 세포배양용 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(well)에 100 ㎕씩 분주해주었다. 이후 37℃, 5% CO₂의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다.

< 실시예 5>

하이브리도마 세포주 선별

상기 <실시예 4>를 통해 융합된 세포를 7일 이상 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것을 확인한 다음, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(well)에 있던 기존 HAT 배지를 교체하여 상기 <실시예 4>와 같은 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-웰(96-well) 세포 배양 플레이트 내에 존재하는 각각의 웰(well)에 존재하는 배지를 취하여 상기 <실시예 2>에서 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 <실시예 3>과 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하였다.

그 결과‘도 3’에 나타낸 바와 같이, 총 288개의 하이브리도마 세포주 중 디프테리아 독소와 450 nm에서 흡광도 1.0 이상의 값을 보이는 웰(well)에 존재하는 6종의 하이브리도마 #1-62, #2-14, #2-68, #3-77, #3-78, #3-84를 선별하였으며, 이들을 각각 JDT1, JDT2, JDT3, JDT4, JDT5, JDT6 으로 명명하였다. 또한, 추가로 24-웰 플레이트(24-well plate) 및 6-웰 플레이트(6-well plate)에서의 계대배양을 거쳐 생존능 및 디프테리아 독소에 대한 반응성을 확인하였으며, 그 결과 생존능을 상실했거나 디프테리아 독소에 대한 반응성이 없는 하이브리도마 2종 JDT4 및 JDT5을 이후 실험에서 제외시켰다. 최종 선정된 4종의 하이브리도마 JDT1, JDT2, JDT3, JDT6을 세포배양 후 하이브리도마를 계수하여, 1개의 96-웰 플레이트(96-well plate) 당 50개~100개의 하이브리도마 세포가 들어가도록 하여 서브-클로닝 과정을 진행하였다. 보다 확실한(안정한) 단일클론의 하이브리도마 세포주가 얻어질 때까지 같은 과정을 반복하여 클로닝을 수행하였다.

< 실시예 6>

단일클론항체의 생산, 정제 및 확인

생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 생산하였으며, 구체적으로 T175 플라스크를 이용하여 별도의 배지(media) 교체 없이 10일 이상 하이브리도마를 대량 배양하였으며, 세포배양을 통해 하이브리도마 세포들이 분비(secretion)한 단일클론항체가 포함된 배지를 전량 회수하였다. 이는 단일클론항체 획득을 위해 본 실시예에서 수행한 것일 뿐, 마우스 복강 내 하이브리도마 주입을 통한 복수(ascites) 생성 등의 과정을 통해서도 단일클론항체 획득이 가능하다. 회수한 하이브리도마 배지에 포함된 불순물 제거를 위해 1,200 rpm에서 10분간 원심분리를 수행한 후, 불순물 제거를 위해 주사기 필터를 통해 필터링을 수행하였다.

상기의 과정으로부터 준비된 배지에 포함된 단일클론항체인 이뮤노글로불린 G (immunoglobulin G, IgG)만을 선택적으로 정제하기 위해 준비된 배지를 20 mM KH₂PO₄ (pH 7.4) 용액으로 평형화 되어 있는 아가로즈(agarose)-Protein G 레진이 충진(packing)되어 있는 컬럼(column)에 흘려주었다. 배지를 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH₂PO₄ (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 모든 불순물을 제거한 다음, 0.1 M glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 부피 비(volume ratio)가 되도록 섞어주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 수행하였다. 투석이 완료된 단일클론항체는 주사기 필터를 통해 응집물(aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 ‘도 4’에 나타낸 바와 같이 <실시예 1>과 같은 조건으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 쿠마씨 블루(Coomassie Blue) 염색을 통해 고순도의 4종의 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 확인하였다.

그 결과‘도 4’에서 볼 수 있는 것처럼, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리ㆍ정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.

< 실시예 7>

단일클론항체의 이소타입 ( isotype ) 확인 및 해리상수 (dissociation constant, K _D ) 측정

상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리ㆍ정제된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 상기 <실시예 6>으로부터 준비된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H₂SO₄ 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 ‘도 5’에 나타내었다. 이로부터 상기 <실시예 6>으로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체의 이소타입은 ‘표 2’에 나타낸 바와 같이 JDT1, JDT2, JDT3은 모두 IgG₁이었으며, JDT6만이 IgG_2b임을 확인할 수 있었다.

4종의 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체의 이소타입

세포주	이소타입 (Isotype)
JDT1	IgG₁
JDT2	IgG₁
JDT3	IgG₁
JDT6	IgG_2b

한편, 상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리ㆍ정제된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체의 해리상수(dissociation constant, K_D) 또는 결합친화도(binding affinity)를 측정하기 위해 상기 <실시예 2>로부터 제조된 디프테리아 독소가 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 100 나노몰(nM)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 웰(well)에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H₂SO₄ 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 ‘도 6‘에 나타내었다. 이로부터 상기 <실시예 6>으로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체와 디프테리아 독소의 해리상수(dissociation constant (K_D)) 또는 결합친화도(binding affinity)는 ‘표 3’에 나타낸 바와 같이, JDT1의 경우 약 8.791 나노몰(nM), JDT2의 경우 약 73.330 나노몰(nM), JDT3의 경우 약 0.331 나노몰(nM), JDT6의 경우 약 2.097 나노몰(nM) 임을 확인할 수 있었다.

4종의 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체의 해리상수

세포주	해리상수 (K_D)
JDT1	(8.791 ± 0.264) × 10^-9 M (몰)
JDT2	(73.330 ± 12.380) × 10^-9 M (몰)
JDT3	(0.331 ± 0.264) × 10^-9 M (몰)
JDT6	(2.097 ± 0.081) × 10^-9 M (몰)

상기 결과를 토대로‘JDT6’ 하이브리도마 세포주가 기존에 알려진 독소에 대한 단일클론항체의 이소타입과 달리 IgG_2b임을 확인하였으며, 상기 하이브리도마 세포주에서 생산된 단일클론항체가 다른 세포주에서 생산한 단일클론항체 대비 우수한 결합친화도를 가지는바, ‘JDT6’ 하이브리도마를 추가적으로 세포배양 후에 세포기탁을 진행하였다. 이에 본 발명자들은 상기 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 생산하는 ‘JDT6’ 하이브리도마 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2018년 11월 22일자로 세포기탁을 진행였으며, 기탁기관으로부터 2018년 11월 28일자 기탁번호 KCTC18747P를 부여받았다.

< 실시예 8>

다른 박테리아 독소 및 단백질과의 교차반응 확인

상기 <실시예 6>을 통해 분리ㆍ정제된 단일클론항체가 디프테리아 독소에만 특이적으로 결합(또는 반응)하면서, 다른 박테리아의 독소나 다른 단백질에는 결합(또는 반응)하지 않는지 확인하기 위해 상기 <실시예 2>의 과정과 같은 방법으로 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하였다. 상기 <실시예 6>을 통해 분리ㆍ정제된 디프테리아 독소에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 디프테리아 독소, 콜레라 독소(cholera toxin), 소혈청알부민(BSA)이 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(stop solution)인 0.2 N H₂SO₄ 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 반응을 종결시켰다. 서로 다른 단백질에 대한 단일클론항체의 반응성 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 ‘도 7’에 나타내었다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리ㆍ정제된 ‘JDT6’ 하이브리도마에서 생산된 단일클론항체가 다른 박테리아의 독소나 다른 단백질과는 결합(반응)하지 않으며, 디프테리아 독소에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC18747P

20181122

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal antibody with specificity for the toxin of Corynebacterium diphtheriae, hybridoma cell line producing the same and use thereof <130> NPDC-75314 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of diphtheriae toxin <400> 1 Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp 20 25 30 Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr 35 40 45 Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys 50 55 60 Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser 65 70 75 80 Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn 85 90 95 Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly 100 105 110 Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys 115 120 125 Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly 130 135 140 Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn 165 170 175 Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe 180 185 190 Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala 195 200 205 Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu 210 215 220 Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr 225 230 235 240 Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser 245 250 255 Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu 260 265 270 Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu 275 280 285 Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala 290 295 300 Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp 305 310 315 320 Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly 325 330 335 Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu 340 345 350 Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala 355 360 365 Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn 370 375 380 Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr 385 390 395 400 Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His 405 410 415 Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg 420 425 430 Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu 435 440 445 Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly 450 455 460 Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg 465 470 475 480 Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys 485 490 495 Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu 500 505 510 His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu 515 520 525 Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly 530 535

Claims

디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 IgG_2b 이소타입 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18747P의 하이브리도마 세포.
제1항의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 디프테리아 독소에 대해 특이적으로 결합하는 IgG_2b 이소타입 단일클론항체.
제2항에 있어서,
상기 단일클론항체는 0.2 내지 20.0 나노몰(nM)의 해리상수로 디프테리아 독소에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
삭제
제2항의 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 조성물.
제2항의 단일클론항체를 포함하는 디프테리아 독소 검출용 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 제2항의 단일클론항체 이외에 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서,
상기 표지체는 Q dot(Quantum dot), HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 글루코오즈 옥시다아제(glucose oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 형광물질(fluorescent material), 방사성 물질 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
제7항에 있어서,
상기 발색기질은 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
시료를 준비하는 단계;
상기 시료에 제2항의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및
항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 검출 방법.
제10항에 있어서,
상기 시료는 디프테리아균 감염이 의심되는 대상의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 뇌척수액 및 소변로 이루어진 군으로부터 선택되는 디프테리아 독소 검출 방법.
제10항에 있어서,
상기 항원-항체 반응은 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 웨스턴 블럿(western blotting), 면역 점 블럿 분석법 (immunodot blotting assay), 면역형광측정법(immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(immunochromatography) 및 측방 유동 면역분석법(lateral flow immunoassay, LFA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 디프테리아 독소 검출 방법.