KR101062437B1 - 간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단 키트 및 상기간흡충 특이 항원의 생산을 위한 단클론 항체 - Google Patents

간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단 키트 및 상기간흡충 특이 항원의 생산을 위한 단클론 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간흡충증 환자의 혈액 내의 항체와 강하게 반응하는 간흡충의 조항원을 면역원으로 하여 면역화 된 쥐의 비장세포와 골수종 세포를 융합시켜 얻은 융합세포주를 클로닝하여 단클론 항체를 생산하고 이를 정제하여 반응성이 좋은 단클론 항체를 선정한 뒤 이를 이용하여 면역크로마토그래피법으로 간흡충 특히 항원을 정제함으로써 얻은 간흡충 특이 항원을 포함하도록 제작된 간흡충의 신속 진단 키트 및 이를 이용한 간흡충의 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 진단 키트에 사용되는 단클론 항체와 이들을 생산하는 융합세포(hybridoma)에 관한 것이다.
간흡충, 간흡충증, 간디스토마, 진단키트, 단클론 항체, 면역친화크로마토그래피

Description

간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단 키트 및 상기 간흡충 특이 항원의 생산을 위한 단클론 항체{A rapid diagnostic kit for Clonorchis sinensis comprising the Clonorchis sinensis-specific antigen and a monoclonal antibody for production of the Clonorchis sinensis-specific antigen}
본 발명은 간흡충증 환자의 혈액 내의 항체와 강하게 반응하는 간흡충의 조항원을 면역원으로 하여 면역화 된 쥐의 비장세포와 골수종 세포를 융합시켜 얻은 융합세포주를 클로닝하여 단클론 항체를 생산하고 이를 정제하여 반응성이 좋은 단클론 항체를 선정한 뒤 이를 이용하여 면역크로마토그래피법으로 간흡충 특히 항원을 정제함으로써 얻은 간흡충 특이 항원을 포함하도록 제작된 간흡충의 신속 진단 키트 및 이를 이용한 간흡충의 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 진단 키트에 사용되는 단클론 항체와 이들을 생산하는 융합세포(hybridoma)에 관한 것이다.
간디스토마는 간흡충이라는 기생충이 사람 간 속의 담관이나 간외 담관 및 담낭에 기생하면서 일으키는 병을 말한다. 간흡충이 담관에 염증을 일으키거나 담관을 패쇄하여 무기력증, 복통, 소화불량 및 황달 등의 증세를 일으킨다.
간흡충은 민물회 등을 통해서 인체에 감염되는 식품매개성 기생충이다. 간흡충은 사람의 간이나 간 밖의 담관, 그리고 담낭 속에 살면서 담관이나 담낭을 자극하고 여기에 이차적인 세균침입으로 인해 심한 염증을 일으켜 담관염이나 담낭염으로 나타난다. 또한 많은 수의 간흡충이 간 내 담관에 감염될 경우에는 담도를 막아 담도폐쇄를 일으키기도 한다. 간흡충이 이렇게 담도를 막으면 담즙이 정체되고, 이 상태에서 죽은 충체나 충란이 핵이 되어 담석이 잘 생긴다고도 한다. 가장 중요한 것은 이러한 담도폐쇄, 만성적인 염증이 계속되면서 담관암이 생길 수 있다는 것이다.
간흡충 감염의 치료에는 프라지콴텔 (praziquantel)을 투여하여 치료하는데, 이 약품은 간흡충 뿐 아니라 폐흡충에 대해 살충력이 강하여 우수한 치료효과를 발휘한다. 그러나 반복적인 복용에 의해 담관에 압박을 가해서 복통을 일으킬 수도 있는 부작용이 있고, 인체에 충체에 대한 내성을 생기게 하는 것이 아니라서 프라지콴텔을 복용하여 완치된 후에도 재감염이 될 수 있다는 위험성이 있다.
간흡충 감염은 그 자체의 치료는 큰 문제가 되지 않으나, 감염 상태가 오래 방치되었을 경우 그에 따른 합병증이 유발된다. 담관암, 담관내 결석, 화농성 담관염 등의 다양한 합병증은 간흡충 감염 자체에 비하여 대단히 심각한 질환이므로 이러한 중증 질환으로 발전하기 전에 조기에 감염여부를 진단하고 치료의 시기를 앞당기는 것이 매우 중요하다 할 수 있다.
보건 복지부와 한국건강관리협회가 5년 주기로 전국적인 대변충란 조사를 실시한 자료에 따르면 최근 윤충 감염은 거의 없어진 상태이며, 국내에서 윤충 감염 률이 급감함으로써 간흡충, 폐흡충 등 흡충과 유구조층, 스파르가눔 등 조충이 기생충 감염의 주요 원인이 되었는데 특히 이들은 임상적으로 심각한 감염증세와 부작용을 일으키기 때문에 진단과 치료가 더욱 중요하다. 간흡충증 감염의 진단 방법으로 현재 사용되고 있는 것에는 대변 내 충란검사법, 영상진단으로서 초음파와 내시경적 역행성 담도 조영술, 피내반응 검사로서 피부반응검사 그리고 혈액검사를 통한 기생충 항체검사가 있다.
대변 충란 검사법은 대변에서 간흡충의 알을 찾아내는 것이다. 이 검사는 가장 정확하게 감염여부를 판단할 수 있을 뿐 아니라, 대변 내 충란수를 측정하여 얼마나 심하게 감염되었는지 즉 감염 정도를 추정할 수 있는 장점이 있어 가장 일반화 된 방법이다.
피내반응검사 (C.S skin test)는 간흡충이 몸에 들어온 적이 있는지를 알아낼 수는 있으나 치료를 하여 간흡충이 모두 죽은 경우에도 양성으로 나타나는 단점이 있다. 현재의 감염여부를 정확히 진단할 수는 없는 방법이다. 주로 진단과정 초기에 주로 이용되는데, 간흡충에 감염된 경우의 80-90%는 양성으로 나오지만, 치료 후에도 환자의 50% 이상이 5~20년간 계속 양성으로 반응하는게 문제이다.
초음파검사, 전산화 단층 촬영 (CT), 자기공명영상 (MRI), 내시경적 역행성 담관 조영술은 간 내 담관이 불규칙적으로 확장된 소견을 확인하여 간흡충증을 의심해 볼 수 있고, 또 이차적인 합병증 즉 담낭, 담관, 간의 염증, 담관결석, 담관암 등을 알아볼 수 있는 방법이다.
혈청학적 방법은 충체가 어려서 아직 충란을 산란하지 않거나, 충체가 노쇠 하여 충란을 생성하지 않을 경우 혈청에서 항체를 검출하여 간흡충 감염을 잠정 진단할 수 있는 방법이다. 기생충 특이 항체를 혈청학적으로 검사하는 방법에는 보체결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역법 등이 있다.
상기에 기술한 바와 같이 다양한 진단 방법이 있으나, 흡충과 조충 감염에 있어서 중요 문제점 중 하나는 검사실적으로 민감도와 특이도가 둘 다 높은 진단법이 정립되어 있지 않다는 점이다. 충란, 또는 포낭을 인체 가검물 또는 조직에서 직접 검출하는 것이 가장 확실한 방법이지만, 민감도가 낮고, 때로는 너무 침습적인 방법을 사용해야만 하는 것이 문제가 된다.
또한, 임상증상과 방사선학적 검사가 진단에 도움이 되지만 다른 질병과 확실하게 감별하거나 원인 기생충을 확진할 수 있는 방법은 되지 못한다. 선별검사로 흔히 사용되고 있는 간흡충 및 폐흡충 피내반응 검사는 민감도는 높지만, 특이도가 낮다고 알려져 있고, 현증과 과거 감염을 구분하지 못하며(Chung et al., 1995; Sandun et al., 1959; Walton과 주, 1959; 김동찬 외, 1969; 정호연 외,1989), 충체 전체를 갈아서 만드는 조항원을 사용하는 데서 기인한 교차반응이 심해서 진단검사로는 부적절하다.
이를 보충하기 위해 1950년대 이후 기생충 특이 항체를 혈청학적으로 검사하는 보체 결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역법 등이 개발되었지만, 민감도와 특이도면에서나 편리성 면에서 ELISA 방법이 우수하기 때문에 ELISA 방법이 임상검사실에서 흡충, 조충의 현증 감염의 진단 및 혈청학적 역학조사, 치료효과의 모니터링 및 치유판정에 유용하게 사용되고 있다. 그러나 위의 모든 방법들과 마찬가지로 ELISA 방법 역시 고가의 장비와 전문가를 반드시 필요로 하기 때문에 실제 간디스토마 환자가 자주 발생하는 농어촌 지역이나 섬 지역에서는 검사가 거의 불가능한 상태이다.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 간흡충에 대해 특이적인 단클론 항체를 제작하여 이들을 이용한 면역친화크로마토그래피(immuno-affinity chromatography) 법을 이용하여 조충체 추출물로부터 간흡충 특이 항원을 분리정제한 다음 이들 항원을 원료로 사용하여 간흡충 진단 키트를 제작한 뒤 상기 진단 키트를 이용하여 간흡충을 진단함으로써 다른 기생충들과의 비특이적인 반응을 줄일 수 있고, 신속 면역크로마토그래피 법으로 개발하였기 때문에 고도의 인력과 비싼 장비의 도움 없이 현장에서 효율적으로 간흡충을 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 간디스토마 진단법인 충란검사와 피내반응검사보다 민감도와 특이도가 뛰어나며, 효소면역측정법보다 간편하고 경제적인 진단 키트로서 간흡충 특이 단클론 항체를 이용하여 분리 정제한 간흡충 특이 항원을 포함하는 진단 키트를 제공하고자 하는 것이다. 본 발명의 간흡충 특이 항원을 포함하는 진단 키트는 기존의 진단 키트에서 문제점으로 대두된 낮은 민감도와 특이도를 극복하고 효소면역측정법의 결과와 높은 일치도를 보여 간디스토마의 진단에 쉽게 이용될 수 있어 치료에 더욱 효과적이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 진단 키트를 이용하여 간디스토마를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 간흡충 특이 항원을 생산하기 위한 간흡충 항원에 특이적인 신규한 단클론 항체를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 간흡충 특이 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 제공하고자 하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 간흡충 항원 특이 단클론 항체를 이용하여 생산된 간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 진단 키트에 비해 특이도와 민감도가 뛰어나며, 현장에서 고도의 기술이나 인력, 그리고 장비의 사용 없이 초고속으로 검사할 수 있는 장점이 있 는 신속, 간편한 진단 키트이다.
본원에서 사용한 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 간흡충증의 발병여부를 확인하는 것이다.
본원에서 사용한 용어, “간흡충증”은 간디스트토마라고도 불리우며, 간흡충(肝吸蟲, Clonorchis sinensis)의 기생흡충의 감염에 의해 발생하는 질환 또는 질병을 말한다.
본원의 “간흡충 특이 항원”은 본 발명자에 의하여 개발된 신규의 간흡충 특이 단클론 항체로부터 분리 정제된 항원을 말한다. 상기 간흡충 특이 단클론 항체는 바람직하게는 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포에 의해 생산되는, 간흡충 항원에 특이적인 단클론 항체 Cs1이다.
구체적인 예로서, 상기 간흡충 특이 항원은 다음과 같은 방법에 의하여 제조되었다. 본 발명자들은 숙주로부터 분리된 간흡충 충체로부터 간흡충 항원들을 준비하여 다수의 간흡충증 (간디스토마) 환자의 혈청과 반응시켜서 간흡충증 특이 항체와 강하게 반응하는 간흡충 항원들을 찾아내었다 (도 1). 간흡충증 특이 항체와 강하게 반응하는 간흡충 항원들을 추출해내어 면역원으로 사용하여 생쥐에 주사하여 간흡충 항원과 특이적으로 반응하는 1종류의 단클론 항체를 분비하는 융합세포 를 제조하였다. 상기 융합세포에서 생산되는 단클론 항체를 단백질 G-Sepharose 충진제를 이용한 친화크로마토그래피를 통해서 순수하게 정제하였다. 정제한 이들 단클론 항체를 CNBr-activated Sepharose와 반응을 시켜서 단클론 항체-Sepharose 충진제를 제작하였다. 이것을 컬럼에 넣고 충진시켜서 간흡충 특이 항원을 정제하는 데에 이용하였다.
간흡충 특이 항원의 정제는 우선 개의 간로부터 적출된 간흡충들을 생리식염수(PBS, phosphate buffered saline)를 첨가하여 조직을 분쇄한 다음, 단클론 항체-Sepharose가 충진된 컬럼을 이용하여 면역친화크로마토그래피를 수행하여 간흡충 특이 항원들을 정제하여 본 발명의 진단키트에 사용하였다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 간흡충 특이항원을 이용하여 진단 키트를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직한 양태로서, 상기 간흡충증 진단키트를 제조하는 방법은 (a) 간흡충에서 항원을 정제하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 항원에 대한 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 제조하고 이로부터 단클론 항체를 생산하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 단클론 항체에서 간흡충 항원에 대한 반응성이 높은 단클론 항체를 선별하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 단클론 항체에 대한 특이 항원을 분리정제하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계의 특이 항원을 이용하여 진단 키트를 제작하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로는, 간흡충증 환자들의 혈청으로부터, 면역블롯을 통하여 반응성 이 높은 간흡충 조항원을 선별하고, 이를 이용하여 생쥐를 면역화한다. 그 다음 상기 면역화 생쥐의 비장세포와 골수종세포를 이용하여 융합세포주를 만들고 이로부터 단클론 항체를 생산한다. 이렇게 생산된 단클론 항체들을 정제하고, 이들 중 간흡충 항원에 대한 반응성이 높은 것을 선택하여 키트 제작용 원료생산에 사용하여 간흡충증 진단 키트를 제작한다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하기로는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다.
면역크로마토그래피 측정법(immunochromatographic assay: ICA)은 그 신속함과 간편함 때문에 래피드 테스트(rapid test)라고도 불리는데, 그 원리는 검체의 혈청 중에 들어 있는 간흡충증 항체가 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항원(tracer antigen)과 반응한 다음 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 단백질 A(Protein A)와 결합하여 발색 띠를 형성함으로써 양성 및 음성을 육안으로 판별하는 것이다. 면역크로마토그래피 진단 방법은 절차가 간단하고 결과가 신속하게 나오기 때문에 호르몬, 항원, 항체, 의약 성분 등의 검사에 현재 많이 이용되고 있다.
본 발명의 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색체입자결합법으로 검출하며, 색체입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 바람직한 일 실시예로서, 본 발명에서는 색체입자로서 금 콜로이드를 이용한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 진단 키트는, 항원-항체 복합체와 결합하는 포획체(capture)로서 단백질 A(Protein A) 이외에 단백질 G(Protein G) 또는 항 사람 면역글로불린 (anti-human IgG)를 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시예로서, 본 발명에서는 포획체(capture)로서 단백질 A(Protein A)를 이용한다.
구체적 하나의 양태로서, 본 발명의 면역크로마토그래피법을 이용한 간디스토마 진단 키트는, 표면에 두 개의 눈에 보이지 않는 선이 그어져 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인과 항원-금 축합체가 건조 상태로 보관되어 있는 유리섬유 패드의 두 가지 주요 부분으로 구성되어 있다. 상기 니트로셀룰로오스 멤브레인에 눈에 보이지 않는 선에는 서로 다른 두 가지 항체가 고정화 되어 있다. 구체적으로 아래 쪽에 있는 검사선(test line, T)은 단백질 A(Protein A)를, 위쪽의 대조선(control line, C)에는 스트렙토아비딘(Streptoavidin)이 고정되어 있다. 유리섬유 패드에는 간흡충 특이 항원과 바이오틴-소혈청 알부민(Biotin-BSA)을 금 입자에 축합(conjugation)시킨 항원-금 축합체와 바이오틴-소혈청 알부민-금 축합체가 유리섬유 패드에 흡수된 후 건조되어 있다. 이렇게 구성되어 있는 키트의 검체 적하부 에 검체를 가하면 유리섬유 패드에 건조 상태로 보관되어 있는 항원-금 축합체가 수화되고 검체 중의 항체과 결합하면서 동시에 모세관 현상에 의하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 있는 미세구멍을 통하여 이동한다. 이어, 상기 보이지 않는 선에 고정되어 있는 단백질 A(Protein A)가 항원-금 축합체에 결합된 항체과 반응하면서 항원-금 축합체가 띠고 있는 붉은 색 때문에 눈에 보이는 붉은 선으로 나타나게 된다. 또한, 위쪽 선에 고정되어 있는 스트렙토아비딘 (Streptoavidin)은 간흡충에 대한 항체가 없더라도 바이오틴-소혈청 알부민-금 축합체와 반응할 수 있으므로 매 검사마다 반드시 나타나고, 이것으로 검사가 적절하게 수행되었는 지를 확인할 수 있다. 즉, 간흡충 항체가 있으면 그 키트의 검사선과 대조선이 동시에 나타나고, 간흡충 항체가 없으면 검사선은 나타나지 않고 대조선만 나타난다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 진단 키트를 이용하여 간디스토마를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 간디스토마 진단 방법은 채취된 혈액(혈청 또는 혈장)을 상기의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하여 흡수되도록 하여 방치한 후, 반응이 종료된 진단 키트의 검사선의 유무에 따라 간디스토마의 양성 여부를 판단한다.
본원에서 사용한 용어, “생물학적 시료”는 간흡충증이 의심되거나 검사하려는 인간을 포함한 포유동물의 혈청, 혈장 등을 말하며, 본 발명에서는 편의상 “검체” 또는 “샘플”이라고 지칭하기도 한다. 상기 생물학적 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않 고 사용할 수 있다.
생물학적 시료에 간흡충 항체가 있는 경우에는 본 발명의 상기 진단 키트 내 간흡충 특이 항원이 항체와 결합하고 이들이 검사선을 통과함에 따라 상기 간흡충 특이 항원과 생물학적 시료 내의 항체가 결합된 복합체가 검사선의 포획체와 결합하면서 육안으로 식별할 수 있도록 막 위의 검사선에서 색 변화가 일어난다. 그러나 생물학적 시료에 간흡충 항체가 없는 경우에는 본 발명의 간흡충 항원과 결합하지 않아 막 위의 검사선에서 아무런 변화가 일어나지 않는다. 이로써 본 발명의 진단 키트를 사용함으로써 간흡충을 간편하고 신속하게 진단할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 간흡충에 특이적인 단클론 항체로부터 분리 정제된 간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 간흡충 특이 항원은 간흡충에 특이적인 단클론 항체로부터 분리 정제된 항원이며, 상기 단클론 항체는 구체적으로 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포에 의해 생산되는 단클론 항체 Cs1이다.
본 발명의 상기 조성물에 포함된 간흡충 특이 항원은 본 발명자에 의하여 제조된 간흡충 항원에 특이적으로 반응하는 항 간흡충 특이 단클론 항체를 분비하는 융합세포로부터 선별된 단클론 항체로부터 분리 정제된 항원이므로, 이를 포함하는 본 발명의 간흡충증 진단용 조성물은 간흡충증에 대한 민감성 및 특이성이 종래의 다른 조성물에 비하여 현저하게 높다(실시예 7 참조).
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 진단 키트의 원료 생산에 사용되는 간흡충 항원에 특이적인 신규한 단클론 항체를 제공한다.
본원에 사용된 용어 '단클론 항체'는 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 결정기(epitope)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다. 상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Mislstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991 등 참조) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
구체적인 양태로서, 본 발명의 단클론 항체는 간디스토마(또는 간흡충증) 환자의 혈액 내의 항체와 강하게 반응하는 간흡충의 조항원을 면역원으로 하여 생쥐를 면역화시킨 후, 이의 비장 세포(splenocyte)를 골수종 세포(myeloma)와 융합하여 융합세포 (hybridoma)를 생성하고, 간흡충 항원과 특이적으로 결합하는 융합세포를 선별하여 이로부터 제조한 항체이다.
구체적으로, 도 2의 흐름도에서 예시한 바와 같이 간흡충 항원들을 전기영동을 통하여 단백질을 분리하고 다양한 간디스토마 양성 혈액과 반응시켜서 면역블롯 (immunoblot)을 실시하여 간흡충증 항체과 반응성이 강한 항원들을 확인하였다. 이 들을 겔(gel)로부터 추출하여 면역원으로 이용하였다.
준비된 항원을 면역원으로 사용하여 생쥐에 주사하여 간흡충 항원에만 특이적으로 반응하는 항 간흡충 단클론 항체를 분비하는 융합세포 1종을 선별적으로 분리(cloning)를 하였다. 좀 더 구체적으로, 간흡충 항원에 특이적으로 반응하는 항 간흡충 특이 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 선별하기 위하여, 전기영동을 통해서 추출된 간흡충 항원이 결합된 엘리자 플레이트(ELISA plate)를 준비하여 단클론 항체의 반응성을 스크리닝(screening)하였다. 간흡충 항원이 결합된 플레이트에서는 반응을 하는 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 선별하였으며, 여기에서 분비되는 단클론 항체를 Cs1이라고 명명하고 이를 본 발명 진단 키트의 원료 제작에 사용하였다. 상기 선별된 융합세포주를 각각 생쥐 복강에 주입한 후, 일정기간이 지난 다음 복수를 채취하고, 이로부터 단클론 항체를 분리하였다.
본 발명의 간흡충 항원을 선별적으로 인지하는 단클론 항체 Cs1을 생산하는 융합세포는 2007년 8월 30일자로 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 11182BP로 기탁하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단클론 항체 Cs1을 생산하는, 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포를 제공한다.
본 발명은 간흡충으로부터 간흡충 특이 항원을 정제하고 이를 이용하여 면역화 된 쥐의 비장세포와 골수종 세포를 융합시켜 얻은 융합세포주를 클로닝하여 단클론 항체를 생산하고 이를 정제하여 반응성이 좋은 단클론 항체를 선정한 뒤 이를 이용하여 면역크로마토그래피법으로 간흡충 특히 항원을 정제함으로써 얻은 간흡충 특이 항원을 포함하도록 제작된 간흡충의 신속 진단 키트를 제공할 수 있으며, 상기 간흡충 진단 키트를 이용하여 기존의 진단 키트 보다 특이도와 민감도가 높으며, 사용법이 원스텝(one-step)으로 무척 간편하고 고가의 장비의 도움 없이 신속하게 현장 검증(point-of-care testing, POCT)이 가능한 진단 방법을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 간흡충증 특이 항체와 반응성이 있는 간흡충의 항원 정제
1) 간흡충증 특이 항체와 반응성이 있는 간흡충 항원의 확인
원광대학교 의과대학 기생충학교실(익산, 한국)에서 제공된 간흡충증 항체 양성 혈청을 이용하여 본 시험을 수행하였다. 본 시험에 이용된 혈액들은 충란 검사 및 피내반응 검사를 통해서 간흡충증 환자로 확인된 혈액들로서 지난 수년간 준비된 것이다. 이들 혈액들을 면역블롯 (immunoblot)에 이용하였다.
간흡충은 원광대학교 의과대학 기생충학교실(익산, 한국)과 한양대학교 의과대학 기생충학교실(서울, 한국)로부터 환자 또는 환견으로부터 적출되어진 것이며 이것을 제공받았다. 간흡충을 생리식염수를 이용하여 3회 세척한 다음, 충체 10 mg당 5ml의 생리식염수를 가하여 조직분쇄기(tissue grinder; PolyTron, Kinematica AG 사, 스위스)를 이용하여 5분간 분쇄하고, 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 상층액을 10% 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)에 넣고 전기영동을 실시하였다. 전기영동된 겔 내에 있는 단백질 항원들을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮긴 후, 간흡충증 환자들의 혈액과 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이것을 0.1% Tween 20이 포함된 생리식염수로 씻은 다음, 항 인간 면역글로블린-HRP 축합체(anti-human IgG-HRP conjugate)와 반응시켰다. 그 후, 멤브레인용 티엠비(Membrane 1 component TMB, BioFX 사, 미국)를 이용하여 발색을 시켰다(도 1).
2) 간흡충 특이 항원의 정제
전기영동을 통하여 분리된 간흡충 항원의 정제는 전기용출(electro-elution)을 이용하였다. 도 1a에서와 같이 SDS-PAGE를 수행한 다음, 간흡충증 항체와 강하게 반응하는 부분인 분자량 7 kDa 부위의 항원들을 확인하였다. 이 후, 도 1b에서와 같이 많은 양의 간흡충 항원들을 동일한 조건에서 전기영동을 하여 분자량 7 kDa 부위의 겔(gel)을 잘라서 모은 다음, 전기용출기(ElectroEluter Model 422; Bio-Rad 사, 미국)를 이용하여 전기 용출(electro-elution)하였다. 추출된 간흡충 항원 용액을 0.1% 에스디에스(SDS)와 0.1% 트원 20(Tween 20)이 포함된 생리식염수 로 투석 (dialysis)을 하였다.
실시예 2 : 간흡충 항원에 대한 단클론 항체 제작
1) 항원의 면역화
각각 100㎍의 간흡충 항원이 들어 있는 용액과 같은 부피의 컴플리트 프레운즈 아주번트(complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 생후 6-8주 가량 된 암컷 생쥐(BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주입하였다. 2주 후에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 희석하여(1/1000) 엘리자(ELISA, enzyme linked immunosorbant assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역가가 낮게 나오면 2주 후에 다시 면역화시켰다.
2) 비장세포(Splenocyte)와 골수종(Myeloma) 세포의 융합
면역화 된 쥐에서 비장을 꺼낸 후, 조직분쇄기로 비장을 으깬 후, 세포 혼탁액을 용기에 담고 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 골수종 세포는 세포배양용 플라스크에서 회수하여 RPMI1640에 현탁하고 세포수를 계산하였다. 비장세포 역시 세포수를 계산하였다. 1× 107의 골수종 세포와 1× 108의 비장세포를 50ml 용기로 옮겨 RPMI1640을 적당량 첨가 후 200×g로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 천천히 흔들어 주면서 1ml의 PEG(50% polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5분 후에 1ml의 RPMI1640을 30초에 걸쳐 넣고, 다시 3ml의 RPMI1640을 30초에 걸쳐 첨가하였다. 또 다시 17ml의 RPMI1640을 1분에 걸쳐 넣은 다음 20ml의 RPMI1640을 더 넣어주고, 5분 동안 반응시켰다. 200×g로 5분간 원심분리한 후 배지는 제거하였다. 50ml의 1% HAT(hypoxathine-aminopterin -thymidine)을 함유하는 RPMI1640에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포(Feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 용기에 100㎕/웰 씩 융합된 세포를 넣어준 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.
3) 융합세포주의 클로닝 및 복수를 이용한 항체생산
10일 정도 후에, 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면 96웰 세포배양용 용기에서 배지를 조금 취하여 엘리자 방법으로 정제된 간흡충 항원 대한 항체를 생산하는 웰을 확인하고, 그 웰의 세포를 회수하여 24웰 세포배양용 용기로 옮긴 다음 배양한 후, 안정한 단클론 세포주가 얻어질 때까지 클로닝을 계속하였다. 클로닝이 완료되면 티 플라스크(T flask)로 옮겨 대량으로 배양하여 얼린 후 액체 질소에 보관하였다.
생후 6-8주 된 쥐(BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 0.5ml 주사하였다. 1주일째 되는 날 융합세포를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여, 쥐 한 마리당 1.5× 106세포를 0.5ml 인산염 완충액에 현탁 후 복강에 주사하였다. 1-2주가 지나면서 복수가 적당히 차오르 면 주사기를 이용하여 복수(ascitic fluid)를 채취한 후 냉동 보관하였다.
4) 단클론 항체의 정제
채취한 복수에 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가 한 후 30분간 혼합하였다. 그리고 15,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 다시 이 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4℃에서 30분간 방치하였다. 다시 15,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20mM 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20mM 인산완충용액에서 18시간 이상 투석(dialysis)하였다. 투석 후, 20mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼(Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해주었다. 컬럼에 결합된 항체는 100mM 글리신용액(glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution) 시켰다. 이때 1M Tris (pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10부피를 첨가해 주어 pH를 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후 150mM 인산완충용액에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다.
상기 본 발명에 따른 단클론 항체의 제작 과정을 도 2에 나타내었다.
5) 단클론 항체의 선정 및 해리상수(Kd) 계산
정제된 단클론 항체를 대상으로 간흡충 항원과 반응성이 높은 항체를 선정하기 위해서 엘리자 방법을 이용하여 측정하였다. 겔(gel)로부터 추출된 간흡충 항원 을 96 웰(well) 엘리자 플레이트(ELISA plate)에 2㎍/㎖의 농도로 코팅하였다. 정제된 단클론 항체를 각각 단계적으로 희석하여 간흡충 항원이 코팅된 플레이트와 반응시키고, 반응 후 결합되지 않은 항체를 세척과정을 통해 제거하였다. 고추냉이 과산화효소(Horseradish peroxydase)가 결합된 산양 항 생쥐 면역글로블린 G(IgG)를 반응시키고, 세척과정을 통해 반응하지 않은 과산화효소-IgG를 제거하였다. 과산화효소의 기질이 되는 TMB(tetramethyl benzidine)를 넣고 발색시켜 반응정도에 따른 흡광도(A450)를 측정하였으며, 그 결과는 도 3a와 같았다. 간흡충 항원에 대한 항체 가운데 반응성이 좋은 Cs1을 본 발명의 키트 제작용 원료 생산에 사용하였다.
또한, 본 발명에 이용한 키트의 제조에 사용하고자 하는 항체에 대한 해리상수를 측정하기 위해서 간접적 경쟁 ELISA (indirect competitive ELISA)를 통하여 Klotz plot을 실시하고, 해리상수를 구한 결과, 본 발명의 단클론 항체의 해리상수는 도 3b와 같았다.
6) 면역크로마토그래피를 이용한 간흡충 특이 항원의 정제
단클론 항체 Cs1를 CNBr-활성화된 세파로스(CNBr-activated Sepharose CL-6B; GE Healthcare, 미국)에 각각 공유결합을 시켰다. 그 후, 이들을 컬럼에 충진시켜 항원 제조에 이용하였다. 조선대학교 의과대학과 한양대학교 의과대학으로부터 제공된 간흡충을 충체 10 mg당 5ml의 생리식염수를 가하여 조직분쇄기(tissue grinder; PolyTron, Kinematica AG 사, 스위스)를 이용하여 5분간 분쇄하고, 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이 상층액을 미리 준비해 둔 컬럼을 이용하여 면역친화크로마토그래피를 수행하였다. 단백질의 용출은 100 mM 글리신(glycine, pH 2.8)을 이용하였으며, 용출한 후 곧바로 1M 트리스(Tris, pH 8.0)로 완충시키고 생리식염수를 이용하여 투석하였다.
상기 본 발명에 따른 간흡충 특이 항원의 면역친화크로마토그래피를 이용한 정제 과정을 도 4a에 나타내었으며, 간흡충 특이 항원의 분리 정제 결과를 도 4b에 나타내었다.
실시예 3: 간흡충 항원을 이용한 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태 진단 키트의 제조
1) 항체의 부동화
도 5a에서와 같이 플라스틱 카드에 부착된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 특정 위치, 즉 검사선(test line, T)에는 단백질 A(Protein A)를, 그리고 대조선(control line, C) 위치에는 스트렙토아비딘(Streptoavidin)을 각각 분주하고 30℃ 인큐베이터에서 2일간 건조시켜 단클론 항체가 니트로셀룰로오스 멤브레인에 완전히 부동화되도록 하였다.
2) 금 축합체(gold conjugate)의 제조 및 금 축합패드의 제조
단클론 항체 Cs1를 이용한 면역친화크로마토그래피(immuno-affinity chromatography)를 통해서 정제된 간흡충 항원을 약 40nm 크기의 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)와 섞은 후 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응하여 간흡충 항원과 콜로이드성 금 입자가 서로 결합되도록 하였다. 1시간 후, 소 혈청 알부민(BSA, bovine serum albumin)와 수크로오스(sucrose)를 각각 3% 및 1%되게 첨가한 후, 다시 1시간 동안 반응시켜 항체가 결합하지 못한 콜로이드성 금 입자의 부위와 반응토록 하였다. 그 후, 10,000rpm에서 20분간 원심 분리시켜 간흡충 항원이 결합된 금 축합체를 회수하고, 540nm에서 흡광도를 측정한 후 냉장 보관하였다. 제조된 금 축합체를 플라스틱 재질의 마이코로웰 플레이트(microwell plate)에 주입시킨 후, 건조시켜 금 축합웰 (gold conjugate well)를 제조하였다.
3) 스트립 키트의 조립
도 5a에서 예시되어 있는 바와 같이 단백질 A(Protein A)가 결합된 니트로셀룰로오스 멤브레인이 붙어있는 플라스틱 카드의 상단부에는 검체 및 버퍼를 흡수할 수 있는 흡수패드(absorbance pad)를 부착하여 스트립 형태 키트를 완성하였다.
실시예 4 : 간흡충 항원을 이용한 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태 진단 키트의 제조
1) 항체의 부동화
도 5a에서와 같이 플라스틱 카드에 부착된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 특정 위치, 즉 검사선(test line, T)에는 단백질 A(Protein A)를, 그리고 대조선(control line, C) 위치에는 스트렙토아비딘(Streptoavidin)을 각각 분주하고 30℃ 인큐베이터에서 2일간 건조시켜 단클론 항체가 니트로셀룰로오스 멤브레인에 완전히 부동화되도록 하였다.
2) 금 축합체(gold conjugate)의 제조 및 금 축합패드의 제조
단클론 항체 Cs1를 이용한 면역친화크로마토그래피(immuno-affinity chromatography)를 통해서 정제된 간흡충 항원과 바이오틴-소 혈청알부민을 각각 약 40nm 크기의 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)와 섞은 후 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응하여 간흡충 항원과 콜로이드성 금 입자가 서로 결합되도록 하였다. 1시간 후, 소 혈청 알부민(BSA, bovine serum albumin)와 수크로오스(sucrose)를 각각 3% 및 1%되게 첨가한 후, 다시 1시간 동안 반응시켜 항체가 결합하지 못한 콜로이드성 금 입자의 부위와 반응토록 하였다. 그 후, 10,000rpm에서 20분간 원심 분리시켜 간흡충 항원이 결합된 금 축합체를 회수하고, 540nm에서 흡광도를 측정한 후 냉장 보관하였다. 제조된 금 축합체를 유리 섬유(glass fiber) 재질의 패드(pad)에 흡수시킨 후, 건조시켜 금 축합 패드를 제조하였다.
3) 디바이스 형태 키트의 조립
도 6a에서 예시되어 있는 바와 같이 단백질 A(Protein A)가 결합된 니트로셀룰로오스 멤브레인이 붙어있는 플라스틱 카드의 상단부에는 검체 및 버퍼를 흡수할 수 있는 흡수패드(Absorbance pad)를 부착하고, 하단부에는 검체를 적하하는 샘플패드(Sample pad)와 축합패드(conjugate pad)를 부착시켰다. 디바이스 형태의 경우 이렇게 조립된 반제품을 도 6a에 명시되어 있는 바와 같이 플라스틱 재질의 하우징(housing)에 넣어 키트를 완성시켰다.
실시예 5 : 스트립 형태 키트의 검사 방법
키트와 함께 제공되는 금 축합웰에 세척액을 1방울 떨어뜨렸다. 그 후, 혈청 검체 3 마이크로리터(microliter)를 피펫을 이용하여 넣고 섞었다. 그 후, 스트립 형태 키트의 꽂아서 검액이 흡수되도록 하고 10분간 방치하였다. 3 방울의 세척액을 세척웰에 넣은 다음 검액이 흡수된 스트립 형태의 키트를 꽂고 15분간 방치하여 세척반응을 시켰다. 반응이 종료된 스트립은 도 5b에 명시되어 있는 바와 같이 검사선 상에 나타난 붉은 색의 띠의 위치에 따라 간디스토마 항체 여부를 판독하였다.
실시예 6 : 디바이스 형태 키트의 검사 방법
알루미늄 파우치(Aluminum pouch)에 들어있는 디바이스 키트를 꺼내 평편한 바닥에 놓았다. 혈청 검체를 3 마이크로리터(microliter) 채취하여 도 6a에 명시되어 있는 바와 같이 검체 적하부(sample window)에 넣고 검액이 흡수되도록 하였다. 그 후, 세척액(assay buffer)을 3방울 떨어뜨린 후 15분간 방치하였다. 반응이 종료된 키트는 도 6b에 명시되어 있는 바와 같이 검사선 상에 나타난 붉은 색의 띠의 위치에 따라 간디스토마 항체 여부를 판독하였다.
실시예 7 : 간흡충 항체 검출을 위한 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태 및 디바이스 형태 키트의 효능 시험
1) 양성 민감도 효능 시험
상기 실시예 3 내지 4에 의해 제조된 진단 키트를 이용하여 간디스토마 양성 100 검체에 대한 키트의 민감도 성능을 테스트 하였다. 본 진단 키트의 민감도를 확인하기 위한 임상 시험은 원광대학교 의과대학 기생충학교실(익산, 한국)에서 수행되었다. 또한, 대조 시험을 위하여 이 간흡충증 양성 검체들을 제네디아 간폐디스토마 항체 엘리자(ELISA, (주)녹십자, 한국) 키트를 이용하여 확인 시험을 하였으며, 그 후, 본 발명에서 이룩한 진단 키트와 비교하였다. 그 결과는 표 1에 나타나 있는 바와 같았다.
민감도 시험을 위한 양성 100 검체를 이용한 시험 결과
종합결과 (총 100 검체) ELISA 결과
양성 음성
나노사인 간디스토마 항체 양성 93 0
음성 7 0
계 100 0
민감도 (Specificity)1 93.0%
[주] 1민감도 = [(양성 반응 키트의 수)/(총 양성 검체수)]×100 (%), 양성 검체 측정시
상기의 경우, (93/100)×100 = 93.0 %
2) 음성 특이도 효능 시험
상기 실시예 3 내지 4에 의해 제조된 진단 키트를 이용하여 간디스토마 음성 100 검체에 대한 키트의 특이도 성능을 테스트 하였다. 본 진단 키트의 특이도를 확인하기 위한 임상 시험은 원광대학교 의과대학 기생충학교실(익산, 한국)에서 수행되었다. 또한, 대조 시험을 위하여 이 간흡충증 양성 검체들을 제네디아 간폐디스토마 항체 엘리자(ELISA, (주)녹십자, 한국) 키트를 이용하여 확인 시험을 하였으며, 그 후, 본 발명에서 이룩한 진단 키트와 비교하였다. 그 결과는 표 2에 나타나 있는 바와 같았다.
특이도 시험을 위한 음성 100 검체를 이용한 시험 결과
종합결과 (총 100 검체) ELISA 결과
양성 음성
나노사인 간디스토마 항체 양성 0 8
음성 0 92
계 0 100
특이도 (Specificity)1 92.0%
[주] 1특이도 = [(음성 반응 키트의 수)/(총 음성 검체수)]×100 (%), 음성 검체 측정시
상기의 경우, (92/100)×100 = 92.0 %
3) 민감도 및 특이도 시험결과를 통한 결론
상기와 같이, 본 발명의 진단 키트는 기존의 진단 키트와 비교해 사용법이 무척 간편하고 고가의 장비의 도움 없이도 신속하게 검사함에도 불구하고 민감도와 특이도가 높으며 임상적으로 유효성이 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 간흡충으로부터 간흡충 특이 항원을 정제하고 이를 이용하여 면역화 된 쥐의 비장세포와 골수종 세포를 융합시켜 얻은 융합세포주를 클로닝하여 단클론 항체를 생산하고 이를 정제하여 반응성이 좋은 단클론 항체를 선정한 뒤 이를 이용하여 면역크로마토그래피법으로 간흡충 특히 항원을 정제함으로써 얻은 간흡충 특이 항원을 포함하도록 제작된 간흡충의 신속 진단 키트를 제공할 수 있으며, 상기 간흡충 진단 키트를 이용하여 기존의 진단 키트 보다 특이도와 민감도가 높으며, 사용법이 원스텝(one-step)으로 무척 간편하고 고가의 장비의 도움 없이 신속하게 현장 검증(point-of-care testing, POCT)이 가능한 진단 방법을 제공할 수 있 으므로 의료진단산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1a은 간흡충으로부터 분리된 간흡충의 항원들과 환자의 혈청(10건) 내의 간흡충증 항체와의 반응성을 보여 주는 면역블롯(immunoblot) 결과를 나타내는 도면이다.
도 1b는 간흡충으로부터 분리된 간흡충 항원들의 전기영동 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 간흡충증 항체에 대해 특이적으로 반응하는 간흡충 항원의 분리정제를 위한 단클론 항체의 제작방법을 도시한 흐름도이다.
도 3a는 본 발명에 따른 간흡충 항원 분리정제용 단클론 항체 Cs1의 반응성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 본 발명에 따른 단클론 항체 Cs1의 해리상수(Kd) 그래프이다.
도 4a는 본 발명에 따른 단클론 항체를 이용하여 간흡충으로부터 간흡충증 항체 특이 항원을 분리 정제하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 4b는 본 발명에 따른 간흡충 특이 항원을 분리 정제한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명에 따른 간흡충증 항체의 진단을 위한 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태의 구성 모식도를 나타내는 도면이며, 도 5b는 본 발명에 따른 간흡충증 항체 진단 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태의 검사결과에 대한 사진을 나타내는 도면이다.
도 6a는 본 발명에 따른 간흡충증 항체 진단 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태의 구성 모식도를 나타내는 도면이며, 도 6b는 본 발명에 따른 간흡충증 항체 진단 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태의 검사결과에 대한 사진을 나타내는 도면이다.

Claims (15)

  1. 간흡충의 항원에 특이적인 단클론 항체로부터 분리정제된 간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단 키트로서, 상기 단클론 항체는 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포주로부터 생산된 것인 진단키트
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태의 진단 키트.
  4. 제 1항에 있어서, 항원-항체 복합체를 색체입자결합법으로 검출하는 진단 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 색체입자와 결합하는 항원으로서 간흡충증 항체에 특이적인 항원을 사용하는 진단 키트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 간흡충증 항체에 특이적인 항원은 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포주로부터 생산된 단클론 항체을 이용한 면역친화크로마토그래피를 통해 정제된 항원임을 특징으로 하는 진단 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. (a) 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포를 제조하고, 이로부터 단클론 항체를 생산하고 선별하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 선별된 단클론 항체에 대한 특이 항원을 분리정제하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계의 특이 항원을 이용하여 진단 키트를 제작하는 단계를 포함하는, 간흡충증 진단키트를 제조하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 간흡충의 항원에 특이적인 단클론 항체로부터 분리정제된 간흡충 특이 항원을 포함하는 간흡충증 진단용 조성물로서, 상기 단클론 항체는 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포주로부터 생산된 것인 간흡충증 진단용 조성물.
  14. 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포주로부터 생산되는 항체 Cs1.
  15. 기탁번호 KCTC 11182BP의 융합세포주.
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