KR20080040942A - 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트 및 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체와 골드입자의 결합체가 스트립상에서 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과의 반응 위치에 부착되고, 스트립상의 항원의 진단 위치에 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 결합이 가능한 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체가 부착된 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트 및 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단방법을 제공한다. 상기 본 발명에 의하면, 돼지의 설사 분변을 이용하여 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 농장이나 실험실 현장에서 특별한 검사 장비 없이도 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 진단키트 및 진단 방법을 제공할 수 있다.

돼지 유행성 설사 바이러스, 면역크로마토그라피법, 신속진단키트

Description

돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트 및 진단 방법{Test-Kit for Diagnosis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Diagnosis Method}

도 1은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트의 실제 제작 사진[A : 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 신속진단키트, B : 표준 음성 검체를 적용한 후의 신속진단키트, C : 표준 양성 검체를 적용한 후의 신속진단키트]

도 2는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트의 구조도(a) 평면도, (b) 단면도

도 3은 본 발명에 이용된 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체의 웨스턴 블롯 사진[6G15: 검사라인용 마우스 항 돼지 유행성설사 바이러스 단클론 항체, 9D11: 골드 접합체용 마우스 항 돼지 유행성설사 바이러스 단클론 항체]

도 4는 본 발명에 따른 진단키트의 검출한계를 보여주는 결과[A; 본 발명 진단키트, B: RT-PCR]

도 5는 본 발명에 따른 진단키트의 교차반응성을 보여주는 결과[1. 브라키스피라 하이오디센테리에, 2. 이스케리치아 콜라이(O8), 3. 클로스트리디움 퍼프린겐스 타입 A, 4. 살모넬라 타이피(ATCC 2501), 5. TGEV, 6. 로타 바이러스, 8. PEDV]

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트 및 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단방법에 관한 것으로 보다 상세하게는, 돼지의 설사 분변을 이용하여 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 농장이나 실험실 현장에서 특별한 검사 장비 없이도 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 진단키트 및 진단 방법에 관한 것이다.

돼지 유행성 설사병 (Porcine epidemic diarrhea : PED)은 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)의 감염에 의하여 연령에 관계없이 발생되는 돼지의 전염병으로 구토와 수양성 설사가 특징이며 돼지전염성위장염(TGE)과 매우 유사한 증상을 일으키나 2주령 미만 신생자돈의 폐사율이 돼지 전염성 위장염보다 낮고 비육돈 및 성돈에서의 발병은 전염성 위장염보다 흔하게 나타난다.

PEDV는 돼지 전염성 위장염 바이러스와 유사한 코로나 바이러스로서 비교적 열에 저항성이 있어 50℃에서 30분간 처리하여도 감염력이 완전히 상실되지 않는다.

1992년 국내에서 처음으로 PEDV가 분리보고 된 이래 그 해부터 1994년 봄까지 대유행한 바 있으며 특히 TGE와 임상적으로 감별이 되지 않고 예방약이 개발되지 않아 막대한 경제적 피해를 초래한 바 있다.

PED는 일령에 관계없이 발병되며 전염성 위장염에 비하여 연중 발생하는 편이나 겨울철에 보다 흔히 발병한다. 또한 전염성 위장염에 비하여 돈사간 또는 돈방간 전파가 느리나 어린 일령에 발병하면 심한 수양성 설사로 폐사율이 높게 나타난다.

이 바이러스는 주로 감염돈의 분변에 의해서 경구감염된다는 점에서 TGE와 유사하며 감염돈의 분변이 전파에 중요한 역할을 한다. 농장내에 PEDV의 침입은 감염동물이나 농장내 출입 차량에 의해서 농장내로 전파되며, 돈사간 전파는 바이러스에 오염된 신발, 의복, 양돈기구 등을 통하여 다른 돈사로 바이러스가 쉽게 전파된다. 특히 농장내에서 PED의 발생은 돼지를 팔거나 새로 구입한 돼지를 입식시킨 후 4∼5일 이내에 많이 발생되므로 세심한 주의가 필요하다.

PED의 진단은 임상증상만으로 진단하기는 매우 어렵다. 모든 일령의 돼지에서 설사증상이 관찰되는 급성 PED의 경우 임상증상만으로 TGE와 감별이 되지 않는다. 그러나, 종돈장의 경우 어린 자돈에서는 증상이 없거나 경미한 임상소견을 보이는 반면, 이유돈과 육성돈에서 급성의 설사 증상을 보일때는 PED로 의심할 수 있지만 확진은 어렵다.

확정진단은 감염돼지의 공장과 회장의 동결조직 절편을 이용하여 형광항체법으로 바이러스 항원을 검출하는 방법으로써 신속하고 특이성이 높은 진단법으로 가장 많이 이용되고 있다. 그러나 형광항원의 검출율은 설사초기에는 높지만, 2∼3일 이상 심한 설사로 위축된 자돈에서는 진단율이 떨어질 수 있으므로 진단의뢰시에는 반드시 설사초기의 자돈을 의뢰하면 정확한 진단을 받을 수 있다.

또한 RT-PCR법도 항원진단을 할 수 있다. 그러나 위에서 서술한 PED진단은 2∼7일이 소요됨으로서, 병의 특성상 최종진단이 나올 경우 이미 농장내에 전파가 되어 농장자체에 막대한 피해를 끼칠 수 밖에 없다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술이 지니는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로,

본 발명의 목적은 돼지의 설사 분변을 이용하여 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 농장이나 실험실 현장에서 특별한 검사 장비 없이도 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 진단키트를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 농장이나 실험실 현장에서 특별한 검사 장비 없이도 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 진단방법을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체와 골드입자의 결합체가 스트립상에서 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과의 반웅 위치에 부착되고, 스트립상의 항원의 진단 위치에 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 결합이 가능한 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체가 부착된 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 단크론 항체는 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 단크론 항체는 돼지 유행성 설사 바이러스의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 단크론항체는 6G15 또는 9D11 인 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 스트립상의 소정 위치에 대조라인의 형성을 위해 산양 항 마우스 IgG 항체가 부착되어진 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트를 제공한다.

또한 본 발명은 검사하고자 하는 샘플을 스트립상의 검출패드에 로딩하는 단계; 스트립상의 반응위치에 부착된 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체와 골드입자의 결합체와 상기 샘플내의 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 반응시키는 단계; 스트립상의 항원의 진단 위치에 부착된 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 결합이 가능한 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체와 상기 반응결과물을 반응시키는 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 스트립상에 로딩되는 샘플은 돼지 분변의 희석액 임을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 단크론 항체는 돼지 유행성 설사 바이러스의 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 단크론 항체는 6G15 또는 9D11 인 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 2개의 서로 다른 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체를 이용한 항체-항원(PEDV)-항체의 직접 샌드위치 방법이 적용되는 진단키트 및 이를 이용한 진단방법이 제공된다. 상기 본 발명의 면역크로마토그래피의 원리에 의해 설사 분변 중의 돼지 유행성 설사 바이러스의 항원을 신속 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명에 따른 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단을 위한 진단키트는 검사 후 즉시 검사선의 발색 유무를 통해 돼지 유행성 설사 바이러스의 감염 여부를 신속하고 손쉽게 진단 할 수 있도록 한다.

본 발명에 따른 진단키트의 작동원리는 아래와 같다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예로서 제공되는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단용 키트의 구조가 도시되어 있다. 진단키트는 샘플을 로딩할 수 있는 샘플주입구(S), 반응결과를 확인시켜주는 검사라인 창(T) 및 대조라인 창(C)이 구비된 하우징과, 상기 하우징의 내부에 위치하며, 샘플이 로딩되어 면역크로마토 그래피 반응을 일으키는 스트립으로 구성되어 있다.

스트립은 지지체(6) 상에 샘플이 로딩되는 검체패드(1), 상기 검체패드와 단부가 중첩되고, 상기 검체패드(1)로부터 통과된 항원과 면역반응이 가능한 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체(하기 실시예에서는 9D11이 사용)와 골드입자의 결합체가 부착된 골드패드(2), 멤브레인상에서 상기 하우징의 검사라인 창 및 대조라인 창에 각각 대응되는 위치에 형성되는 검사라인과 대조라인이 구비되고, 상기 검사라인은 상기 항원과 결합가능한 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체(하기 실시에에서는 6G15가 사용)를 포함하며, 상기 대조라인은 산양 항 마우스 IgG 항체를 포함하고 있다. 멤브레인과 연장하여 상부에는 흡습패드(5)가 부착되어 있다.

상기 사용된 두 항체는 2006.10.11일자로 한국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10996BP (PEDV 6G15) 및 KCTC 10997BP (PEDV 9D11)으로 각각 기탁된 것이다.

먼저, 돼지 유행성 설사 바이러스 항원이 함유된 검액(설사분변을 희석액으로 용해한 것)을 샘플주입구(S)에 넣으면 검액 중의 돼지 유행성 설사 바이러스 항원이 검체 패드(1)를 이동하면서 큰 입자의 분변덩어리는 여과되고, 곧이어 골드패드에 있는 금 입자가 부착된 마우스 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체와 반응하여 복합체를 형성한다. 상기 결합체는 모세관 현상에 의해서 멤브레인 위를 이동하며 다시 멤브레인 위에 흡착된 마우스 단클론 돼지 유행성 설사 바이러스 항체와 반응하여 직접 샌드위치 원리에 의해 항체-항원-멤브레인 항체의 복합체를 형성하며 이러한 경우 골드의 색상에 의해 해당 위치에 보라색 밴드 (검사선/T) 가 형성된다. 검사라인 위에서 반응하지 않고 지나친 골드 입자는 산양 항 마우스 항체 가 흡착된 대조선(C) 위치에서 반응하여 보라색 밴드를 나타낸다. 이와 같은 반응은 본 발명에 의하면 통상적으로 5∼10분 안에 육안으로 관찰할 수 있다.

즉, 검사하고자 하는 검액을 타원형의 샘플주입구(S)에 로딩하고 5 ∼ 10분 후에 C(대조라인), T(검사라인) 위치에 보라색 밴드가 나타났는지를 관찰한 결과, 스트립의 기능이 정상적이라면 모든 경우에 C 위치에 보라색 선이 나타나야 하고 C 위치에만 보라색 선이 있는 경우는 돼지 유행성설사 바이러스 항원에 대하여 음성으로 판정하며, C, T 위치에 모두 보라색 선이 나타나면 돼지 유행성설사 바이러스 항원이 양성인 것으로 판정할 수 있다.

이와 같은 면역크로마토 그래피 진단법의 특징은 기존의 다단계 면역검출법에서 볼 수 있는 샘플희석, 세척 및 효소 컨쥬케이트와 기질의 반응을 통한 발색 과정을 하나로 통합하여 단일 과정으로 검사할 수 있는 편리성을 제공하며, 또한 검사판정시에 특정한 장비가 요구되지 않아 경제적이면서, 진단의 신속성을 제공하는 장점이 있다.

본 발명에 따른 진단방법을 보다 구체적인 진단키트의 제조예로서 이하에서 설명한다.

먼저 돼지 유행성 설사 바이러스를 베로(Vero) 세포에서 증식시킨 후 바이러스를 흡착 크로마토그래피(Affinitiy chromatography)하여 순수분리 정제하였다. 이와 같이 분리된 돼지 유행성 설사 바이러스는 항원으로서 사용되어 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 단클론항체를 제조하기 위해 사용된다.

면역크로마토그래피법으로 진단하기 위해서는 나이트로 셀룰로우즈 멤브레인 에 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체를 정해진 위치(검사선/T)에 흡착시키고, 금입자에 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론항체를 접합시켜 반응 위치인 골드패드(2)에 부착시키고 건조시켰다.

건조된 골드패드(2)와 검체를 로딩하는 검체패드를 중첩하여 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위에 덮고 반대편 위치에 흡습용 패드를 부착시켜 테스트용 스트립을 제조한다.

본 발명에 따르는 진단 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다.

대조라인 위치에는 산양 항 마우스 IgG를 흡착시켜 마우스 IgG가 흡착된 골드입자가 검체 중의 돼지 유행성 설사 바이러스 항체의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 밴드를 나타내게 한다.

반응하지 않은 내용물은 흡습패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. 즉, 검체 중에 돼지 유행성 설사 바이러스가 일정량 이상 존재하면 정성적으로 발색되게 된다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 돼지 유행성 설사 바이러스 정제 및 단클론항체 제조

1) 돼지 유행성 설사 바이러스의 배양 및 정제

돼지유행성설사바이러스(PEDV SM 98P strain)를 단층이 형성된 베로(Vero) 세포에 접종한 다음 트립신(10㎍/ml)이 함유된 무혈청 배지로 바이러스를 배양하여 세포변성효과가 80％이상 일어났을 때 바이러스 감염세포를 -20℃에서 3회 동결융해하여 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 채취하였다. 이 상층액을 22,000rpm(Beckman, SW 28Ti rotor)에서 4시간 동안 원심분리하여 침전물을 상층액의 1/100양이 되게 TNE 버퍼(10mM Tris, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH7.4)로 부유시켰다. 부유시킨 바이러스 농축액을 30％, 40％, 50％, 60％의 불연속 설탕 농도구배(discontinuous sucrose gradient)위에 중첩하여 100,000xg 에서 4시간 동안 원심분리하여 확인된 바이러스 밴드를 채취하여 투석한 다음 마우스 면역용 항원으로 사용하였다.

2) 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체 제조

정제된 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 면역원으로 사용하여 Balb/c 마우스에 면역시켰다. 이후 비장 세포를 분리하여 마이엘로마(myeloma)와 접합시켜 돼지 유행성 설사 바이러스 항원에 대한 단클론 항체를 분비하는 잡종 세포주의 선발은 간접형광항체법을 이용하였다. 간접형광항체법을 통하여 선발된 세포주를 대량 배양하였으며, Balb/c 마우스의 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 프로테인 A/G 겔을 이용하여 IgG 항체를 정제하였다. 이렇게 정제된 항체 중 신속 진단키트의 목적에 맞는 두 종류의 단클론항체(6G15 및 9D11로 명명함)를 선별하였다. IgG 항체의 정제 및 선별과정은 "Antibodies, A Laboratory manual, Ed Harlow & David Lane, 1988."에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

이들 항체는 모두 돼지 유행성 설사 바이러스의 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단백질(58kDa)에 대한 단클론항체임을 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 3). 이들 두 항체는 2006.10.11일자로 한국, 대전광역시 유성구 어은동 52번지 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10996BP (PEDV 6G15) 및 KCTC 10997BP (PEDV 9D11)으로 기탁되었다.

정제된 항체를 1 ㎎/㎖ 농도로 PBS로 희석하여 골드 접합용으로 사용하였다.

<실시예 2> 대조라인용 산양 항 마우스 항체의 제조

정제된 마우스 IgG를 구입하여 생리식염액에 용해하고 각 접종 때마다 100 mg 씩 준비하여 Freund's 완전 부형제(complete Adjuvant) 0.5 ml과 혼합하여 에멀젼 시켰다. 이렇게 준비된 접종물을 30 kg이상의 산양의 피하에 접종하였다. 1개월 간격으로 6회를 동일한 방법으로 접종하되 2회 접종부터는 불완전 부형제(incomplete adjuvant)를 사용하여 4회 접종하였다. 이후 혈청 채취, 역가 측정 및 항체 정제는 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

즉, 면역된 산양의 경정맥에서 시험 채혈을 실시한 후 혈청을 분리하여 ELISA 방법으로 역가를 측정하였다. 역가 측정은 마우스 IgG를 ELISA용 평판에 1㎍/ml 농도로 흡착시키고 항혈청을 1％ BSA 용액으로 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000배 등으로 희석하여 반응시켰다.

구입한 항 산양 IgG-퍼옥시다아제를 이용하여 2차 반응을 시키고 TMB로 발색시켰다. 정상 산양 혈청의 흡광도 값보다 약 3배 이상되는 흡광도를 컷 오프 하여 100만배 이상의 타이터(titer)를 나타내면 전채혈하였다.

전채혈 후 원심분리하여 혈청을 분리하고 마우스 IgG를 세파로오즈 4B 겔에 흡착시켜 통과시켰다. 항혈청 중에 항 산양 마우스 IgG 항체는 마우스 IgG에 반응하고, 반응하지 않은 단백질은 PBS로 세척하였다. 그후 0.2M 글라이신 (pH 2.0) 용액으로 특이 항체를 용출하고 용출액을 PBS로 투석하였다. 투석된 항체액의 단백농도를 BCA법으로 측정하고 사용할 때 까지 냉장에 보관하였다.

<실시예 3> 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론항체 - 금 접합체 제조방법

골드 클로라이드(Gold chloride)를 0.01％로 증류수에 용해한 후 0.1％ 소디움 시트레이트 용액을 첨가하면서 가열하였다. 약 10분간 가열한 후 냉각하여 냉장 보관하면서 금 접합체와 반응시킬 때 이용하였다. 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체 6G15를 1 ㎎/㎖ 농도로 금 용액에 첨가하여 10분간 반응시켰다. 골드 입자를 안정화 시킨 후 10,000×g에서 30분간 원심하여 침전을 만들고, 다시 PBS에 용해한 후 0.45㎛ 여과기로 여과하여 540nm에서 흡광도가 10이 되도록 희석하였다. 이 금 용액을 산양 항 마우스 면역글로블린이 흡착된 멤브레인에 트윈 20과 혼합하여 이동시켜 반응성을 확인하였다.

<실시예 4>스트립 제조방법

나이트로셀룰로스 멤브레인의 특정위치에, 즉 검사선 T 위치에는 마우스 항 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체 9D11을 1.0㎎/㎖되게 코팅하였으며, 대조선 C 위치에는 산양 항 마우스 IgG항체를 0.75㎎/㎖되게 각각 코팅하였다. 마우스 돼지 유행성 설사 바이러스 단클론 항체-금 접합체 및 돼지 IgG-금 접합체를 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적셔 건조시킨 후 골드 패드를 제조하였다. 검사 샘플이 잘 수용되도록 검체 패드를 건조시켜 제조하였으며, 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 잘 건조하여 흡습 패드를 제조하였다. 상기 제조된 멤브레인에 골드 패드, 검체 패드, 흡습패드를 부착하여 스트립을 제조하였다.

<실시예 5> 본 발명에 따르는 진단키트의 용법 및 용량 결정

(1) 판정 시간 결정

돼지 유행성 설사 바이러스 항원 신속진단을 위한 반응시간 설정은 돼지 설사분변을 이용하여 양성 검체는 양성으로 음성검체는 음성으로 판정할 수 있는 최소의 시간을 판독시간으로 설정하였다. 즉, 양성 표준 검체와 음성 표준 검체를 신속진단키트의 검체 점적부위에 4방울 점적하고 5분, 10분, 15분, 20분 경과시까지 멤브레인의 배경과 반응선이 명확하게 구분되는 시간을 설정하였다. 본 시험에 사용한 양성 표준검체는 10^7.0TCID₅₀/ml의 돼지 유행성 설사 바이러스를 10％ 음성 돼 지 분변 추출액으로 8배 희석한 검체(고역가 양성검체)와 32배 희석한 검체(중역가 양성검체), 100배 희석한 검체(저역가 양성검체)를 사용하였으며, 10％ 음성 돼지 분변 추출액은 음성 표준검체로서 RT-PCR로 돼지 유행성 설사 바이러스 음성으로 확인된 검체를 이용하였다. 그 결과 5, 10, 15, 20분 경과 시까지 관찰하여 시험 결과를 판정했을 때, 반응 후 5분 경과 시부터 양성 및 음성 표준 검체의 판정을 정확히 하였고, 10분 경과시에는 주변 배경과 반응선의 구분이 명확하였다. 15분 및 20분 경과시에도 양성 및 음성 표준 검체의 판정을 정확히 하였으나 판독 시간의 신속함을 위해 상기의 결과를 근거로 하여 본 제제를 용법 용량에 따라 시험할 때의 판독 시간을 5 ∼ 10분으로 설정하였다.

(2) 본 발명에 따르는 진단키트의 검액 점적량

본 진단키트의 검체 희석액량과 희석된 검체의 점적량을 결정하기 위하여, 검체를 각각 0.5㎖, 1㎖, 2㎖, 3㎖의 검체 희석액에 반응시켜 어떤 조건이 판정 시간 이내에 결과 판독에 적합한지 확인하였다. 또한 본 진단키트의 희석된 검체를 각각 3방울(75ul), 4방울(100ul), 5방울(125ul), 6방울 (150ul) 반응시킨 후 어떤 조건이 판정 시간 이내에 결과 판독에 적합한지 확인하였다. 그 결과, 검체 희석액량은 0.5ml 및 1ml에서 양성 검체의 밴드 강도(band strength)가 가장 강하게 나타났으나 0.5ml인 경우 밀도가 높아 이동이 늦어지고 배경이 깨끗하지 않아 검체 희석액은 1ml로 설정하였다. 검액 4방울 적용시 5분 경과시부터 양성 및 음성 표준 검체의 판정을 정확히 하였고, 10분 경과시에는 주변 배경과 반응선의 구분이 명확 하였다. 그러나 4방울 적용시 5분 후부터 배경과 반응선의 구분이 명확하였다. 상기의 결과를 근거로 하여 본 제제를 용법 용량 중 검체희석액량을 4방울, 5방울(100-125 ul)로 설정하였다.

(3) 용법 및 용량

상기의 실험결과를 토대로 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 신속진단 키트의 용법 및 용량은 다음과 같이 설정하였다.

1) 분변 채취용 면봉을 사용하여 분변 시료 혹은 항문 내 분변을 채취하여 검체 희석액이 들어있는 샘플병에 넣는다.

*2) 분변이 충분이 추출될 수 있도록 면봉을 휘저어준다.

3) 큰 입자가 가라앉을 때까지 튜브를 세워둔다.

4) 드롭퍼로 상청 검액을 취하여 검사용 디바이스에 4 ∼ 5방울 떨어뜨린다.

5) 5, 10분 후에 판독한다.

<실시예 6> 본 발명 진단키트의 검출한계

본 진단 키트의 검출감도를 확인하기 위하여 돼지 유행성 설사 바이러스 백신주 (PEDV SM98 strain)를 검체 희석액으로 10진 희석하여 단계별 희석액을 본 진단키트의 용법 용량에 따라 시험하고, 또한 PBS (pH 7.2)로 10진 희석한 것은 RT-PCR로 음성 양성 결과를 확인하여 상호 비교함으로서 본 진단키트의 검출감도를 확 인하였다. 그 결과, 신속진단키트는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 10^5.0 TCID₅₀/ml 농도까지를 정확하게 양성으로 판정하였고, RT-PCR은 10^2.0 TCID₅₀/ml 의 검출감도를 보였다 (도 4).

이러한 결과는 PCR의 민감도가 본 발명의 경우보다 1000배 높음을 의미하지만, 본 발명의 실시예가 야외 검체를 빠른 시간 내에 간단히 검출할 수 있는 장점을 가지는 것을 고려하였을 때 의미가 있다고 할 수 있다.

<실시예 7> 본 발명 진단키트의 교차 반응성

본 발명 실시예의 진단키트가 돼지의 설사 원인체 중 돼지 유행성 설사 바이러스 이외의 병원체에 대하여 교차반응성이 있는지를 조사하였다. 국립수의과학검역원에서 보유 중인 자돈의 설사 원인체 즉, 브라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriae) B204, 이스케리치아 콜라이(O8), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 타입 A, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) (ATCC 2501), 전염성위장염바이러스(Transmissible Gastroenteritis Virus), 로타 바이러스(OSU, Gottfried)를 대상으로 교차반응성을 확인하였다. 그 결과, PEDV 외의 돼지 포유자돈에서 설사를 유발할 수 있는 병원체와는 교차반응이 없는 것을 확인하였다 (도 5).

<실시예 8> 본 발명 실시예 진단키트를 대상으로 하는 검출시기 시험

본 발명 실시예의 진단키트가 실제 자돈에서 어느 시기에 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 검출할 수 있는지를 조사하였다. 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 중화항체가 없는 3일령 포유자돈에 병원성 PEDV SM 균주를 10^2.0LD₅₀/ml를 경구로 1ml씩 8마리에 접종하고 접종 9일 후까지 매일 오전 및 오후에 분변을 면봉으로 칠하여 RT-PCR과 본 발명으로 검사하였다. 또한 폐사한 개체의 경우에는 부검하여 십이지장, 공장, 회장 및 결장의 장유제액과 장내용물에 대하여 RT-PCR을 실시하였으며 또한 각 부위별 장 내용물에 대하여 본 발명의 키트로 검사하였다.

공격접종후 8마리의 포유자돈들이 접종 1일 후부터 모두 구토 및 설사를 하였으며, 그중 1마리는 접종 2일 후, 1마리는 접종 3일 후, 2마리는 접종 4일 후, 1마리는 접종 6일 후에 폐사하였다. 6일 이후까지 생존한 3개체는 연변을 보이다가 그중 2마리가 8일까지 생존하였고 1마리만이 8일부터 정상분변을 보이다가 시험기간인 9일 후까지 생존하였다.

분변의 RT-PCR 및 본 실시예의 시험 결과, 공격접종 1일 후부터 두 시험법 모두 양성을 보였으며 공격접종 5∼6일까지 설사를 보이는 자돈 중 1건 외에는 두 방법 모두 일치되게 PEDV를 검출할 수 있었다. 따라서 발병 5∼6일 이내의 설사 분변을 대상으로 본 실시예로 검사를 실시하면 RT-PCR법과 비교하였을 때 좋은 일치율을 보임을 알 수 있었다 (표 1).

<표 1> 검출시기 시험결과

공격 접종 후 경과일(일)

자돈 No.

시 험

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

A

P

A

P

A

P

A

P

A

P

A

P

A

P

A

P

A

P

A

P

26

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

설

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

+

+

본 제제

-

-

+

+

+

+

+

+

27

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

설

설

설

설

설

설

연

연

연

연

정

정

정

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

nt

-

nt

-

nt

-

본 제제

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

nt

+

nt

+

nt

+

28

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

설

설

설

설

설

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

본 제제

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

29

분변상태

정

정

설

설

설

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

본 제제

-

-

+

+

+

30

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

설

설

설

설

설

설

연

연

연

연

연

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

nt

-

nt

-

본 제제

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

nt

-

nt

-

31

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

-

본 제제

-

-

+

+

+

+

-

32

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

설

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

-

-

본 제제

-

-

+

+

+

+

+

-

33

분변상태

정

정

설

설

설

설

설

설

설

설

설

설

연

연

연

연

연

연

폐

RT-PCR

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

nt

-

nt

-

본 제제

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

nt

+

nt

+

A:오전 9:30, P:오후 4:30, 정:정상분변, 설:설사분변, 연:연변, 폐:폐사, +:검출, -:불검출,

nt:Not tested

또한 폐사한 5마리 자돈을 십이지장, 공장, 회장 및 결장의 장내용물에서 본 실시예의 키트로 검사한 결과 공장에서 가장 높은 빈도로 검출이 되었으며, 십이지장, 회장, 결장에서도 검출 가능함을 알 수 있었다 (표 2).

<표 2> 검출 장기 시험결과

자돈 No.	폐사일	시험법		십이지장	공장	회장	결장
29	2	RT-PCR	장유제액	-	+	+	+
			장내용물	+	+	+	+
		키 트		±	+	+	+
32	4	RT-PCR	장유제액	+	+	+	-
			장내용물	+	+	+	-
		키 트		±	+	±	-
26	4	RT-PCR	장유제액	-	-	-	-
			장내용물	-	+	+	-
		키 트		-	+	+	-
31	3	RT-PCR	장유제액	+	-	+	-
			장내용물	+	-	+	-
		키 트		+	-	+	-
28	6	RT-PCR	장유제액	-	+	-	-
			장내용물	+	+	-	+
		키 트		±	+	-	±

+ : 검출됨, - : 검출 안됨

<실시예 9> 본 발명 실시예의 진단키트를 대상으로 하는 민감도, 특이도 시험

본 발명 실시예의 진단 키트의 민감도, 특이도 및 정확도를 확인하기 위하여 국립수의과학검역원에 시험의뢰된 자돈 설사분변 367 검체를 대상으로 실시하였다. 자돈 설사분변을 RT-PCR로 먼저 검사를 실시하여 음, 양성을 확인하고, 동시에 본 제제의 검사법에 따라 실험을 실시하여 민감도 및 특이도를 조사하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.

그 결과, RT-PCR을 골드 표준(gold standard)으로 하여 양성으로 판정된 179 검체와 음성으로 판정된 188 검체에 대하여 본 실시예로 시험한 결과, 양성 검체중 164 검체가 양성으로 판정되었으며, 15 검체만이 음성으로 판정되어 92％의 민감도를 보였다. 이러한 결과는 현재까지의 돼지유행성 설사 바이러스 항원검출법중 가장 높은 감도를 보이는 RT-PCR과 비교한 결과이므로, 검출감도를 고려하였을 때(약 1,000배) 매우 높은 민감도를 보이는 것으로 사료되며, 실제 야외 상황에서는 매우 높은 농도의 돼지 유행성설사 바이러스가 분변으로 배출됨을 의미한다.

또한 음성 검체중 184 검체가 본 실시예로 음성으로 판정되었으며, 4 검체만이 양성으로 판정되어 98％의 특이도를 보였다.

따라서 본 실시예는 전체적으로 94.8％의 정확도를 보여, 농장 현장이나 실험실에서 사용가능할 것으로 사료된다.

<표 3>

구 분		RT-PCR		합 계
		양성	음성
본 제제	양성	164	4	168
	음성	15	184	199
합 계		179	188	367

민감도 = = 91.6％

특이도 = = 97.9％

정확도 = = 94.8％

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명에 의하면, 돼지의 설사 분변을 이용하여 돼지 유행성 설사 바이러스 항원을 농장이나 실험실 현장에서 특별한 검사 장비 없이도 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 진단키드 및 진단방법을 제공한다. 따라서 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사 바이러스의 항원 진단키트 및 진단방법은 자돈의 설사 감별진단에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 돼지 유행성 설사병 박멸 프로그램이나 백신 적용 문제 등 양돈산업에 지대한 도움을 줄 수 있을 것으로 기 대된다.

Claims (2)

1. 돼지 유행성 설사 바이러스의 뉴클레오캡시드 58kDa에 결합하는 단크론항체 6G15 (KCTC 10996BP)와 골드입자의 결합체가 스트립상에서 돼지 유행성 설사바이러스 항원과의 반응위치에 부착되고, 스트립상의 항원의 진단위치에 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 상기 단크론항체 6G15 (KCTC 10996BP)의 결합위치와 상이한 위치에서 결합이 가능한 단크론항체 9D11 (KCTC 10997BP)이 부착된 돼지 유행성 설사 바이러스 항원 진단키트.
2. 검사하고자 하는 샘플을 스트립상의 검출패드에 로딩하는 단계; 스트립상의 반응위치에 부착된 돼지 유행성 설사 바이러스의 뉴클레오캡시드 58kDa에 결합하는 단크론항체 6G15 (KCTC 10996BP)와 골드입자의 결합체와 상기 샘플내의 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 반응시키는 단계; 스트립상의 항원의 진단위치에 부착된 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 항원과 상기 단크론항체 6G15 (KCTC 10996BP)의 결합위치와 상이한 위치에서 결합이 가능한 단크론항체 9D11 (KCTC 10997BP)와 상기 반응결과물을 반응시키는 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사 바이러스 항원의 진단방법.

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