CN113801922A - 猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，包括核酸吸附材料、阳性对照膜片、阴性对照膜片、样品采集管、漂洗管A、漂洗管B、扩增检测管、采样拭子、牙签、滤纸条和说明书。本发明的试剂盒操作简单，无需专业人士，只需要一台恒温设备或保温杯即可在腹泻类病毒单独或混合感染的早期实现对其现场快速准确诊断，对临床猪腹泻类疾病的防控有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术
近年来，猪腹泻类疾病给我国的养猪业造成了严重的经济损失。该类疾病不仅流行范围广，而且致病病原十分复杂。除了猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)这三种重要的猪腹泻类病毒以外，猪嵴病毒(Porcinekobuvirus,PKV)、猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)、猪丁型冠状病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV)这三种新发病原也被陆续证实与猪腹泻类疾病有关。该类新发病原导致的临床症状与以上三种常见病毒极为相似，因此临床诊断上容易发生混淆，造成误诊。目前，我国临床上对该类病原未引起足够重视，加之缺乏与这类新发病原相对应的鉴别诊断技术，都进一步加剧了猪腹泻类疾病的防控难度。由此，研发针对该类新发病原的鉴别诊断技术对于准确诊断病原，并有针对性地防控猪腹泻类疾病意义重大。
当前，对于这类新发疫病的检测均有与之相对应的分子生物学诊断方法，主要为逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术和实时荧光定量PCR(quantitative real-timePCR)技术。运用分子生物学手段进行单一病原的检测，工作量大且成本高，孟丽等人曾建立了一种基于RT-PCR技术同时鉴别多种猪腹泻类病毒的检测方法，为这类病毒的鉴别诊断提供了参考。然而该方法无法摆脱传统的从复杂的生物样品中(如，动物血液、组织、肛拭子等样本)提取核酸以及PCR检测过程的繁琐步骤，不仅耗时费力，且需要经过专业培训的人员和昂贵的检测仪器，因此难以实现对该类病原快速的鉴别诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是猪腹泻类疾病的新发病原导致的临床症状与三种常见病毒极为相似，临床诊断上容易发生混淆，造成误诊。目前，我国临床上对该类病原未引起足够重视，加之缺乏与这类新发病原相对应的鉴别诊断技术，都进一步加剧了猪腹泻类疾病的防控难度。
为解决上述技术问题，本发明提供了猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，是一种基于核酸恒温扩增技术的现场快速鉴别诊断试剂盒的研发及在引起猪腹泻的病毒性病原检测中的应用，针对PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV这6种引起猪腹泻的常见病毒性病原，研发了特异性引物序列，并基于GE Healthcare,USA、牌号为FTA Card，Whatman生产的核酸现场快速提取试剂盒，仅1-3分钟便可实现对动物血液、组织、肛拭子等样本中核酸的现场快速提取，无需过柱离心和热处理等烦琐步骤，因此无需任何设备，可通过直接从膜片中扩增核酸而消除对单独的核酸洗脱步骤的需要。
此外，在检测阶段，采取核酸恒温扩增技术(Nucleic acid isothermalamplification technology,NAIAT)技术，实现对结果的可视化判定。该技术可以在恒温条件下实现对靶序列的高效扩增，而结果仅通过肉眼就能观察。该方法在病原微生物检测方面具有简便、特异性强、结果便于观察、不需要精密仪器等优势，具有良好的发展前景。基于该方法建立的针对猪腹泻类新发病毒病原的快速鉴别诊断方法，可以在腹泻类病毒单独或混合感染的早期实现对其快速准确诊断，对临床猪腹泻类疾病的防控有重要意义。
为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，包括多个扩增检测管，所述扩增检测管内分别预装如表1所示的PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV的特异性引物：
表1 PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV的特异性引物
进一步的，猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，还包括表2所示的组分：
表2猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分
进一步的，表2中所述样品采集管内预装50～100μL样品裂解液，样品裂解液为平衡酚、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和TRIzol的混合液，体积比为4:1:4:2，pH为8.0。
进一步的，所述表中漂洗管A中预装100～500μL95％乙醇；漂洗管B中预装100～500μL70％～80％乙醇。
进一步的，所述扩增检测管预装检测试剂，所述检测试剂由石蜡分割为上、下两层，下层为10×Bst buffer、25mM dNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4和12mM HNB，上层为Bst2.0DNA聚合酶、反转录酶和ddH2O以及表1所示检测6种病原的特异性引物，所述石蜡熔点为53-58℃；
进一步地，用于检测6种病原的所述扩增检测管预装检测试剂包括：Bst2.0DNA聚合酶1.0μL、反转录酶0.5μL、10×Bst buffer 2.5μL、25mM dNTPs 1.96μL、5M Betaine 5.0μL、100mM MgSO4 2.0μL、12mM HNB 0.4μL、ddH2O 7.14μL以及相对应的6种病原的检测引物；所述特异性引物包括：40μM FIP 1.0μL、40μM BIP 1.0μL、40μM LF 0.5μL、40μM LB 0.5μL、20μM F3 0.25μL、20μM B3 0.25μL。
进一步的，所述猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的检测量为6个样本使用量，样本量可以扩大到24T、36T及以上。
本发明提供猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒具体包括以下操作步骤：
(1)样品裂解：取肛拭子置于样品采集管中，搅动至白色浆状；
(2)一次漂洗：取核酸吸附材料加入至上述样品采集管中，用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至漂洗管A中，用牙签轻轻搅动5～10秒；
(3)二次漂洗：更换新牙签将上述核酸吸附材料转移到漂洗管B中，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条适当晾干；
(4)扩增检测：再用新牙签将上述晾干的核酸吸附材料和阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上，将检测管置于63～65℃条件下，2分钟后小心取出检测管，用手指轻弹管底3～5下，确保膜片下沉到下层反应液中，再迅速放回恒温器内保温40分钟；
(5)结果判读：用眼睛观察反应液颜色；阳性对照显示为天蓝色，阴性对照显示为紫色，否则判定实验结果无效；样品检测结果的判断比对阳性和阴性对照进行；如果样品的反应液显示天蓝色则表示该样品的该病原检测结果为阳性，如果样品的反应液显示紫色则表示该样品的该病原检测结果为阴性。
进一步的，所述采样用核酸吸附材料购买自美国GE Healthcare，牌号为FTACards，Whatman，经打孔器制作成直径2～3mm，能够有效吸附样品裂解液中的核酸。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)简单、便携：从核酸提取、扩增到检测结果判读，既不需要吸取液体，也不需要离心，只需要一个保温设备(或保温杯)；而且试剂盒中的所有试管均为预装试剂，极大简化了操作复杂性，非常适用于非专业人士的核酸现场快速检测。
(2)快速、准确：既往检测方法仅核酸提取过程耗时约30分钟～2小时，本发明从核酸提取、扩增到检测结果判读全过程不超过45分钟；与基于TaqMan探针的qPCR检测方法相比，该试剂盒对PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV这6种病原的诊断特异性(DSp)分别为100％、99.4％、100％、100％、95.5％、100％，诊断灵敏性(DSe)分别为90.2％、89.2％、93.3％、88.8％、94.1％、93.3％，kappa值分别为0.93、0.91、0.99、0.94、0.87、0.96，具有极好的可重复性(Kappa≥0.87)。
(3)采用石蜡分割体系：检测管内石蜡上下层分别预装不同的反应组分，延长了保存时间；检测过程中反应体系由石蜡油包埋，检测结束后离开反应温度后石蜡迅速凝固，与检测管形成“双保险”，防止任何气溶胶的产生。
(4)成本非常低：包括有形成本(试剂盒成本、人员成本和设备成本)和无形成本(时间成本)都明显低于现有的提取方法。
附图说明
图1是实施例1中的试剂盒对6种目标病原进行鉴别诊断的可行性分析；
其中扩增检测管从左到右预检测病原分别为“PEDV(1)、TGEV(2)、PoRV(3)、PKV(4)、PSV(5)和PDCoV(6)”、“－”和“+”。A组编号①～⑥均加入了pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N重组质粒的混合液1μL，质粒浓度为100copies/μL；B组编号⑦～
依次加入了1μL的pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒，pMD18-PEDV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒，pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒，pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒，pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒，以及pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M和pMD18-PSV混合重组质粒；质粒浓度均为100copies/μL。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配制。
PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV这6种病原的基因阳性质粒构建为选取GenBack所报道的相关序列片段，采用生工生物工程(上海)股份有限公司人工基因合成的方法制备。将6种病原的特异性核酸片段分别克隆到pMD18-T载体上，分别构建pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N重组质粒，所构建质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确定为阳性克隆。相关特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。
Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、WarmStart RTx反转录酶以及配套10×Bstbuffer、100mM dNTPs和100mM MgSO4，购自NEB。
100×羟基萘酚蓝溶液，简称HNB，购自北京百奥莱博科技有限公司。
5M Betaine(非盐酸盐)：购买甜菜碱，化学式为C5H11NO2，分子量117.15，分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g，用100mL无RNase水溶解后，在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2，加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。
核酸吸附材料：FTA Cards,Whatman购自美国GE Healthcare公司，经打孔器制作成直径2～3mm。
平衡酚：将苯酚重蒸馏，冷却后加入双蒸水至饱和并形成等体积水相，加入1/100总体积的1M Tris·HCl，pH为8.0，用浓盐酸调节混合物的pH至8.0；分装后，在-20℃保存。
样品裂解液配制：pH为8.0，分别取平衡酚、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol，按体积比为4:1:4:2配制核酸提取试剂。
猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的组装：包括盒体、盒体内的试剂和耗材，说明书。盒体内的试剂分别为预装50～100μL样品裂解液的样品采集管、预装100～500μL 95％乙醇的漂洗管A、预装100～500μL 70％～80％乙醇的漂洗管B和预装检测试剂的扩增检测管；盒体内的耗材分别为核酸吸附材料、采样拭子、牙签、滤纸条以及阳性对照膜片、阴性对照膜片。
实施例1：
试剂盒对目标基因PEDV-N、TGEV-N、PoRV-VP6、PKV-M、PSV和PDCoV-N检测的可行性分析
方法步骤如下：
步骤(1)：设置2组试验：1组分别将100copies/μL的pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N重组质粒混合，各取混合液1μL分别加至6份核酸吸附材料中，使其充分吸收，依次编号①～⑥；2组中6份核酸吸附材料吸附的1μL混合液分别为：100copies/μL的pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒；100copies/μL的pMD18-PEDV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒；100copies/μL的pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PKV-M、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒；100copies/μL的pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PSV和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒；100copies/μL的pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M和pMD18-PDCoV-N混合重组质粒；100copies/μL的pMD18-PEDV-N、pMD18-TGEV-N、pMD18-PoRV-VP6、pMD18-PKV-M和pMD18-PSV混合重组质粒；依次编号⑦～
。
步骤(2)：将上述核酸吸附材料和阴阳性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上，将检测管置于恒温水浴锅中，65℃反应2分钟后小心取出检测管，用手指轻弹管底3～5下，确保膜片下沉到下层反应液中，再迅速放回实时荧光定量PCR仪中，40分钟后观察检测管内反应液颜色。
结果如图1所示，①～⑥检测管反应液颜色由紫色变为天蓝色，表明试剂盒对目标基因PEDV-N、TGEV-N、PoRV-VP6、PKV-M、PSV和PDCoV-N均能正确识别；⑦～
检测管反应液颜色未发生变化。2组试验证实本发明试剂盒对6个基因的混样检测具有良好的特异性，且对100copies/μL的目标基因在40分钟时内均能检出。
实施例2：
本发明提供的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒与基于TaqMan探针的qPCR检测方法的检测效果对比分析
选取某疑似发病猪场200份以上发病样本，按照本发明试剂盒所述检测步骤对临床样本进行检测。同时，所有样本均采用检测各基因的基于TaqMan探针的qPCR检测方法进行比较。
对目标病原PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV，本发明提供的诊断试剂盒的DSe值分别为90.2％、89.2％、93.3％、88.8％、94.1％、93.3％，DSp值分别为100％、99.4％、100％、100％、95.5％、100％，kappa值分别为0.93、0.91、0.99、0.94、0.87、0.96(见表3)。结果表明，与基于TaqMan探针的qPCR检测方法相比，本发明提供的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒具有极好的可重复性(Kappa≥0.87)。
表3本发明提供的诊断试剂盒和基于TaqMan的qPCR检测方法对猪腹泻类病毒性病原临床样品的测试比较结果
注：DSe＝TP/(TP+FN)；DSp＝TN/(TN+FP)，其中，TP代表阳性结果，FN代表假阴性结果，TN代表阴性结果，FP代表假阳性结果。Kappa＝(Po–Pe)/(1–Pe)，其中Po是观察符合率，Pe是机遇符合率。0＜Kappa≤0.40，则说明诊断试验的可重复性差；如果0.40＜Kappa＜0.75，则说明具有中、高度可重复性；如果Kappa≥0.75，那么该诊断试验就具有极好的可重复性。
实施例3：
试剂盒内扩增检测管保存期试验
分别考察保存于56℃、室温(26-28℃)、4℃和-20℃的有效期。结果详见表4、5、6、7。
表4扩增检测管保存于56℃的测试结果
结果显示：检测体系保存于56℃，48小时内检测结果正常。
表5扩增检测管保存于室温(26-28℃)的测试结果
结果显示：检测体系保存于室温(26-28℃)，15天内检测结果正常，但是反应体系颜色整体变浅。
表6扩增检测管保存于4℃的测试结果
结果显示：检测体系保存于4℃，80d内检测结果正常，但是反应体系颜色从60d后整体变浅。
表7扩增检测管保存于-20℃的测试结果
注：D值＝(顶峰时吸光度-140秒前的吸光度)/(峰值时间-开始起峰的时间)×1000，D值≥5.0判定为阳性；D值＜5.0判定为阴性。DT值为峰值时间。该体系仍在持续测试中。
结果显示：检测体系保存于-20℃，6个月内检测结果正常，反应体系颜色正常。该体系仍在持续测试中。
本研究基于核酸恒温扩增技术，建立了一种针对猪腹泻相关6种病毒性病原的现场快速高灵敏鉴别诊断方法，并配套研制了相应的试剂盒，与之前的检测方法相比，具有如下特点和进步：
1)特异性高；通过序列比对，选择高特异性和保守性的区域作为引物设计靶基因区，极大地提高了等温扩增反应的特异性。
2)耗时短，检出率高，重复性好；运用本检测方法，可以实现对6种猪腹泻相关新发病原的同时、快速检测，全流程检测时长不超过45分钟；与基于TaqMan探针的qPCR检测方法相比，本发明提供的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒诊断灵敏度不低于88.8％，且具有极好的可重复性(Kappa≥0.87)。
3)成本低；本检测技术不需要具备专业能力的操作人员以及昂贵的仪器，能有效降低样品检测成本，应用前景巨大。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的原理或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 猪腹泻病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法
<130> 青岛农业大学
<140> 1
<141> 2021-09-10
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcggcaa aaatacacc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aactggcgat ctgagcatag 20
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 16
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gggtggcatc aaaacacttg 20
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gccatctgtt ccagacatg 19
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ctttgaccaa tcaacatctg ggttgtttta caagaatcct ggtacctaca 50
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<400> 36
gctgaaattg gtgatgccta tgtatttttt taatgcatca aaccacaaag g 51
Claims (6)
1.猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，包括多个扩增检测管，其特征在于，所述扩增检测管内分别预装如表1所示的PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV的特异性引物：
表1 PEDV、TGEV、PoRV、PKV、PSV和PDCoV的特异性引物
2.如权利要求1所述的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，还包括如表2所示的组分：
表2 猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分
3.如权利要求2所述的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，表2中所述样品采集管内预装50～100μL样品裂解液，样品裂解液为平衡酚、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和TRIzol的混合液，体积比为4:1:4:2，pH为8.0；表2中所述漂洗管A中预装100～500μL 95％乙醇；漂洗管B中预装100～500μL 70％～80％乙醇。
4.如权利要求2所述的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，其特征在于，扩增检测管预装检测试剂，所述检测试剂由石蜡分割为上下两层，下层为10×Bstbuffer、25mM dNTPs、5M Betaine、100mM MgSO4和17.5mM HNB，上层为Bst 2.0DNA聚合酶、反转录酶和ddH2O以表1所示检测6种病原的特异性引物，所述石蜡熔点为53-58℃。
5.如权利要求2所述的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品裂解：取肛拭子置于样品采集管中，搅动至白色浆状；
(2)一次漂洗：取核酸吸附材料加入至上述样品采集管中，用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至漂洗管A中，用牙签轻轻搅动5～10秒；
(3)二次漂洗：更换新牙签将上述核酸吸附材料转移到漂洗管B中，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条并晾干10秒；
(4)扩增检测：再用新牙签将上述晾干的核酸吸附材料和阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的检测管内的白色分隔上，将检测管置于63～65℃条件下，2分钟后小心取出检测管，用手指轻弹管底3～5下，确保膜片下沉到下层反应液中，再迅速放回恒温器内保温40分钟；
(5)结果判读：用眼睛观察反应液颜色；阳性对照应显示为天蓝色，阴性对照应显示为紫色，否则判定实验结果无效；样品检测结果的判断比对阳性和阴性对照进行；如果样品的反应液显示天蓝色则表示该样品的该病原检测结果为阳性，如果样品的反应液显示紫色则表示该样品的该病原检测结果为阴性。
6.如权利要求2所述的猪腹泻类病毒性病原现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述采样用核酸吸附材料为FTACards，Whatman经打孔器制作而成，直径2～3mm。
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